Summary
Här beskriver vi ett protokoll för att bedöma antisvampaktivitet av primära humana immunceller i realtid med hjälp av fluorescerande Aspergillus reporter konidier i samband med live-cell video mikroskopi och flödescytometri. Genererade data ge insikt i värd cell- Aspergillus interaktioner såsom fungicid aktivitet, fagocytos, cellmigration och inhibition av svamptillväxt.
Abstract
Aspergillus fumigatus är en opportunistisk svamppatogen orsakar invasiva infektioner hos immunförsvagade värdar med hög case-dödlighet. Forskning undersöker immunologiska svar mot A. fumigatus har begränsats av bristen på enhetliga och tillförlitliga analyser för mätning av den antifungala aktiviteten av specifika immunceller in vitro. En ny metod beskrivs för att bedöma den antifungala aktiviteten hos primära monocyter och neutrofiler från humana donatorer mot A. fumigatus användning av fluorescerande Aspergillus Reporter (FLARE) konidier. Dessa konidier innehålla en genetiskt kodad dsRed reporter, som konstitutivt uttrycks av levande FLARE konidier, och är utvändigt märkt med Alexa Fluor 633, som är resistent mot nedbrytning i fagolysosomen, vilket möjliggör en distinktion mellan levande och döda A. fumigatus konidier. Video mikroskopi och flödescytometri därefter används för att visualisera Interactjon mellan konidier och medfödda immunceller, bedöma fungicid aktivitet samtidigt som den ger en mängd information om fagocyt migration, fagocytos och inhiberingen av svamptillväxt. Denna nya teknik har redan nya spännande insikter i värd patogen interaktion av primära immunceller mot A. fumigatus. Det är viktigt att notera laboratoriet installation krävs för att utföra denna analys, inklusive nödvändiga mikroskopi och flödescytometri möjligheter och förmåga att arbeta med mänskliga givarblod och genmanipulerade svampar. Emellertid är denna analys med förmåga att generera stora mängder data och kan avslöja detaljerade insikter i det svampmotverkande svar. Detta protokoll har framgångsrikt använts för att studera värd-patogen interaktion av primära immunceller mot A. fumigatus.
Det är viktigt att notera laboratoriet installation krävs för att utföra denna analys, inklusive nödvändig mikroskopi och flödescytometri facilities, och förmåga att arbeta med mänskliga givarblod och genmanipulerade svampar. Emellertid är denna analys med förmåga att generera stora mängder data och kan avslöja detaljerade insikter i det svampmotverkande svar. Detta protokoll har framgångsrikt använts för att studera värd-patogen interaktion av primära immunceller mot A. fumigatus.
Introduction
Aspergillus fumigatus är en opportunistisk svamp patogen och den vanligaste svamp orsaken till invasiva lunginfektioner i immunförsvagade värden 1, 2. Att förstå hur värdimmunceller känner igen och eliminera Aspergillus är ett viktigt område för svamp forskning, men de för närvarande tillgängliga svampdödande analyser har betydande begränsningar. Vanligen använda metoder för mätning av fungicid aktivitet inkluderar kolorimetriska analyser och bestämning av kolonibildande enheter 3, 4. Emellertid sådana metoder ger information om svamp viabilitet vid en enda tidpunkt i stället för att visa det dynamiska samspelet mellan värd och patogen. Således kan dessa metoder inte tar hänsyn till om en svamp har dödats eller helt enkelt (tillfälligt) begränsad tillväxt eller metabolisk aktivitet. Vi har utvecklat en metod som kan observera fungicidal aktivitet direkt samtidigt fånga detaljerad information om fagocytos, fagocyt migration och hämning av svamptillväxt.
Tidigare var ett protokoll publicerades med hjälp realtidsavbildning som ett medel för att mäta fagocytos av Candida albicans medelst en musmakrofagcellinje 5. Detta koncept har nu utvecklats ytterligare för att ta itu med kunskapsklyftan i vår förståelse av Aspergillus interaktioner med immunceller genom att använda fluorescerande Aspergillus Reporter (FLARE) conidia 6, 7, 8. Dessa konidier uttrycka en röd fluorofor (dsRed) och är märkta med en andra fluorofor (Alexa Fluor 633). En gång i FLARE konidium dödas, slutar det producerande dsRed och resterande dsRed bleknar, medan AF633 förblir fluorescerande och bundna till konidier. Detta skapar en tydlig åtskillnad mellan levande och döda fuNGAL celler under levande cell imaging och flödescytometri, och möjliggör spårning av ödet för individuella konidier efter deras interaktion med immunceller.
De beskrivna analyser tillhandahåller en effektiv metod för att visualisera interaktionen mellan värdimmunceller och Aspergillus och kommer att vara av betydande värde vid unraveling de cellulära signalvägar som är ansvariga för antifungala effektormekanismer i medfödda immunceller. Andra användningsområden är att visualisera hur förändringar i Aspergillus tillväxt, såsom övergången från vilande till svullna conidia, eller från svullen konidier till hyfer, påverkar fagocyter igenkänning och funktion.
Följande protokoll beskriver i detalj hur man erhålla humana monocyter och neutrofiler; hur man förbereder FLARE konidier; och hur man fångar sina svar med video mikroskopi och flödescytometri. Även om användningen av humana immunceller isolerade från givarblod beskrivs här, dettateknik har visat lika effektiva med hjälp av olika murina cellpopulationer.
Protocol
Protokollet för att erhålla neutrofiler och perifera blodmononukleära celler (PBMC) är baserat på tidigare publicerade metoder 9. Användningen av blodprover från friska frivilliga försökspersoner har godkänts av den mänskliga forskningsetiska kommittén vid University of Aberdeen. Innan du börjar se till att alla etiska godkännanden är på plats för att dra blod från friska frivilliga och / eller patienter för att det beskrivna experimentet. Håll celler på is där det är möjligt att öka deras överlevnad.
1. A. fumigatus kultur och förhållanden
- Förbereda glukos minimalt agarmedium, såsom beskrivits 10.
- Justera media till pH 6,5 med användning av 1 M NaOH och autoklav vid 120 ° C under 20 min.
- Låt svalna till 65 ° C.
- Arbetar i ett sterilt flöde huva, häll 30 ml kyld media i en T75-kolv och låt svalna med halsen på kolven vilar på en 25 ml pipett till cskapa en agar lutning.
- Strimma ut dsRed Af293- A. fumigatus-stam på agar och inkubera i 7 dagar vid 37 ° C + 5% CO2. Två kolvar kommer att ge ungefär 10 9 konidier i 5 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) före biotinylering.
2. A. fumigatus märkning och beredning
Notera: När man utför denna analys för första gången, förbereda den paren Af293- A. fumigatus-stammen. Ta prover av båda stammarna i mikrocentrifugrör och etikett endast en av varje stam som beskrivs nedan. Detta gör det möjligt för en att ha kontroll konidier utan färg och konidier med en enda färg, antingen dsRed eller AF633, för att testa installationen och utrustning.
- Skörd A. fumigatus konidier genom nedsänkning av kulturen med 30 ml PBS + 0,05% Tween-80. Filtrera den resulterande suspensionen genom ett 40 | im cellfilter in i ett 50 ml rör för att avlägsna hyfernas fragment.
- Centrifuge vid 805 xg under 10 min, avlägsna supernatanten och tvätta en gång i 20 ml steril PBS. Pool konidier från två plattor av samma stam under tvättsteget.
- Efter tvättningssteget, suspendera pelleten i 5 ml PBS och förflyttning 1 ml alikvoter av konidiesuspension i mikrocentrifugrör. 1 ml suspension av varje stam är vanligtvis tillräcklig för levande cell imaging. Linda de återstående alikvoter i folie och förvara vid 4 ° C.
- Centrifug alikvoter av konidiesuspension vid 9300 xg under 10 min vid rumstemperatur och noggrant avlägsna supernatanten. Resuspendera konidial pelleten i 1 ml 0,05 M NaHCOs 3 pH 8,3.
- Förbereda 10 mg biotin / 200 | il dimetylsulfoxid (DMSO) stamlösning genom att rekonstituera 25 mg biotin i 500 pl DMSO. Tillsätt 10 mikroliter biotin / DMSO-stamlösning till mikrocentrifugrör, täcka i aluminiumfolie och inkubera i 2 h på en rocker vid 4 ° C.
- Alikvotera resten av biotin / DMSO lager solution och frys vid -20 ° C för användning i efterföljande experiment.
- Centrifugera i 10 min vid 9300 xg och noggrant avlägsna supernatanten. Resuspendera konidial pelleten i 1 ml 100 mM Tris-HCl pH 8,0 under 1 h för att inaktivera fritt flytande biotin.
- Centrifugera i 10 min vid 9300 xg och noggrant avlägsna supernatanten. Tvätta pelleten två gånger med 1 ml steril PBS och återsuspendera pelleten i 1 ml PBS.
- Upplös 1 mg streptavidin-AF633 i 0,5 ml PBS för att göra en 2 mg / ml stamlösning. Tillsätt 10 mikroliter av 2 mg / ml streptavidin-AF633 per 1 ml konidial suspension och inkubera i 40 minuter vid rumstemperatur på en rocker täckt av aluminiumfolie. Den återstående Streptavidin-AF633 kan frysas i alikvoter för användning i efterföljande experiment.
- Centrifugera i 10 min vid 9300 xg och försiktigt bort supernatanten. Resuspendera konidial pelleten i 1 ml PBS och räkna konidier med en hemocytometer vid en 1: 1000 spädning (1: 100 och därefter 01:10). Justera konidial koncentrationen till 3,6 x 10 6 / ml med CO 2 oberoende medier, linda in i folie och förvara vid 4 ° C.
OBS! Conidia nu märkta med AF633 och kommer att hänvisas till som FLARE konidier. - Valfritt: Om stimulering med svälld konidier krävs, efter att ha räknat konidier (steg 2,9), utspädd konidier till 7,2 x 10 6 / ml i jästkvävebas (YNB) medium och tillsätt 500 | il konidiesuspension till 4,5 ml YNB-medium i en autoklaverad 50 ml-Erlenmeyerkolv. Täck och placera kolven i en skakinkubator (200 varv per minut vid 37 ° C) under 6 timmar.
- Överföra mediet till ett 15 ml rör. Centrifugera vid 805 xg under 10 min vid rumstemperatur och tvätta en gång i PBS. Centrifugera igen och återsuspendera pelleten i 1 ml CO 2 oberoende medium, vilket gav 3,6 x 10 6 konidier / ml.
Obs! Konidier klumpar ofta efter att de svullnar göra exakt räkna svårt, är det tillrådligt att räkna med counted antal vilande konidier användes.
- Överföra mediet till ett 15 ml rör. Centrifugera vid 805 xg under 10 min vid rumstemperatur och tvätta en gång i PBS. Centrifugera igen och återsuspendera pelleten i 1 ml CO 2 oberoende medium, vilket gav 3,6 x 10 6 konidier / ml.
3. Isolering av humana neutrofiler och monocyter
- Dra 20 ml av venöst blod från friska frivilliga i två 10 ml blod rör innehållande etylendiamintetraättiksyra (EDTA). För varje givare separat, häll 20 ml blod i ett 50 ml rör och späd med 15 ml PBS.
- Låg bakom blodet med 15 ml av en lymfocytisolering lösning (densitet 1,077 g / ml) med en spruta och järn nål. Placera nålen i botten av röret och försiktigt tvinga lymfocytisolering lösningen ut. Centrifugera vid 630 xg under 20 min utan någon broms och låg acceleration.
- Förbered PBS, kylda på is.
OBS: Steg 3,4 och 3,5 måste följas samtidigt generera monocyter (3,4) och neutrofiler (3,5). - Med hjälp av en pastette, skörda PBMC lagret. Detta är det skikt i mitten mellan den gula serum (övre) och det transparenta lymfocytisolering lösning (lägre) skikt, ochöverföring till ett färskt 50 ml rör.
- Fyll röret med PBMC upp till 50 ml med kall PBS och centrifugera vid 582 xg under 10 min. Avlägsna supernatanten och tvätta två gånger med kall PBS och återsuspendera i 1 mL PBS per 20 ml av donatorblod som användes initialt.
- Göra 1:10 utspädningar för räkning genom tillsats av 20 mikroliter av cellsuspensionen till 160 mikroliter av PBS och 20 | il av trypanblått. Räkna celler med en hemocytometer.
- Framställa en buffertlösning genom att tillsätta 26 ml av värmeinaktiverat fetalt kalvserum (FCS) och 2,1 ml 0,5 M EDTA till 500 ml HBSS. Centrifugera cellerna under 10 min vid 515 xg och återsuspendera i 40 | il buffertlösning per 1 x 10 7 celler.
- Överför cellsuspensionen till ett 15 ml rör och tillsätt 10 | il av CD14 mikropärlor per 1 x 10 7 celler, blanda väl och inkubera under 15 min vid 4 ° C, och se till att blanda rören varje 5 min.
- Tvätta cellerna genom att tillsätta 1 ml buffertlösning per 1 x 10 7 celler och centrifuge vid 515 xg under 10 min.
- Aspirera supernatanten fullständigt och resuspendera upp till 1 x 10 8-celler i 500 mikroliter buffertlösning.
- Placera en kolumn per prov på en magnetisk separator enligt tillverkarens instruktioner. Först tvätta kolonnen en gång med 500 mikroliter buffertlösning.
- Pipettera de 500 mikroliter cellsuspension genom kolonnen, vänta på kolonnen för att torka och sedan tvätta genom att upprepa detta tre gånger med buffertlösning.
- Placera ett nytt 15 ml rör under kolonnen och ta kolonnen off den magnetiska separatorn. spola sedan cellerna ut ur kolonnen in i röret med 1 ml buffertlösning.
- Lägg 4 ml buffertlösning och centrifugera vid 515 xg under 10 min, och sedan återsuspendera i 1 ml av Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium.
- Göra 1:10 utspädningar för räkning genom tillsats av 20 mikroliter av cellsuspensionen till 160 mikroliter av PBS och 20 | il av trypanblått. Räkna cellerna med enhemocytometer.
- Justera cellkoncentrationen till 6 x 10 5 / ml med RPMI och utsäde 200 mikroliter på en 35 mm glasbaserade avbildnings skålen. Inkubera över natten vid 37 ° C med 5% CO2.
- Nästa dag, före avbildning, ta bort RPMI och tillsätt 200 | il av CO 2 oberoende medium.
Notera: Dessa monocyter kan också differentieras till olika makrofag delmängder före avbildning. Om detta är en teknik som skall undersökas, är en utmärkt utgångspunkt nyligen papper genom Ohradanova-Repics et al. 1 1.
- Efter skörd av PBMC lagret, ta bort alla serum och de flesta av lymfocytisolering lösningen, men var noga med att inte ta bort den lilla vita bandet på toppen av den röda pelleten eftersom detta kommer att innehålla de flesta av neutrofiler.
- Förbered en 10x hypotonisk lysbuffert lager genom att tillsätta 83 g NH4CI och 10 g KHCO3 i en L sterilt vatten. Lagra vid 4 °C.
- Späd detta bestånd 10x med sterilt vatten och tillsätt den till rören. Sedan försiktigt invertera 3 gånger och inkubera i is under 15 minuter.
- Centrifugera vid 394 xg under 10 min och återsuspendera i hypoton lyseringsbuffert i 10 min i is.
- Centrifugera vid 394 xg och tvätta två gånger med kall PBS. Återsuspendera i 1 ml av CO 2 oberoende medium per donator.
- Göra 1:10 utspädningar för räkning genom tillsats av 20 mikroliter av cellsuspensionen till 160 mikroliter av PBS och 20 | il av trypanblått. Räkna cellerna med en hemocytometer.
- För flödescytometri, justera koncentrationen till 6 x 10 5 / ml och tillsätt 400 | il cellsuspension till en 24-brunnsplatta. För mikroskopi, tillsätt 200 | il av samma cellsuspension till en 35 mm glasbaserade avbildnings skålen.
Obs: Neutrofil avbildning eller flödescytometri bör inledas omedelbart på grund av deras benägenhet att genomgå apoptos om de lämnas ostimulerade. Om detta inte är möjligt neutrofiler bör hållas påis och användas så snart som möjligt (inom samma dag).
4. Flödescytometri
- Lägga 200 mikroliter av 1,2 x 10 6 / ml FLARE konidier till cellerna i 24-brunnars platta, och sedan lägga till 100 mikroliter av 20 mikrogram / ml voriconazol. Lägga 300 mikroliter av RPMI och inkubera i 16 h vid 37 ° C med 5% CO2.
OBS: Voriconazol tillsätts för att förhindra konidial groning. - Lägga 25 mikroliter av en 1 mM Calcofluor-vit förrådslösning till varje brunn för en slutlig koncentration av 25 | iM och inkubera under 10 min vid 37 ° C med 5% CO2.
- Centrifugera vid 582 xg under 10 min. Avlägsna supernatanten och tvätta två gånger med PBS.
- Att skörda vidhäftande celler (monocyter), tillsätt 1 ml av PBS med 3 mM EDTA till varje brunn och inkubera under 10 min vid 37 ° C med 5% CO2. tvätta försiktigt celler av från plattan genom pipettering och samla cellerna i ett rör.
- Tvätta en gång i FACS-buffert (2% fetalt kalvserum till PBS), och sedan återsuspendera i FACS-buffert för FACS-analys.
- För FACS-analys, först justera kompenseringsparametrarna för flödescytometern och ställa positiva grindar använder enfärgade kompensations rör, inklusive konidier med ingen färg: dsRed + konidier, AF633 + konidier och Calcofluor Vit + konidier (genererad som i 4,2).
- Befriade konidier gate baserat på framåt och sidospridning med hjälp av konidier utan färg. Ställ cell gate på framåt och sidospridning genom att utesluta den fria konidier gate.
- Analysera provröret genom att spela in 10.000 händelser.
OBS: Celler som är förknippade med levande konidier ska DsRed + och AF633 +. Celler som är förknippade med döda konidier blir bara AF633 +. Bystander celler som inte har engagerade konidier blir dsRed- och AF633-. De konidier-ingrepp cellpopulationer analyseras vidare för Calcofluor vit färgning på Pacific Blue kanalen. Konidier som finns kvar utanför cellerna blir Calcofluor vit + och konidier som har internalis blirCalcofluor White-.
5. Levande cell Video Microscopy
Notera: Valet av mikroskop kommer att bero på vad som är tillgängligt lokalt, men mikroskopet installationen kommer att behöva inkludera en inverterad stadium, en miljökammare uppvärmd till 37 ° C och lämpliga filter excitation / emissions för dsRed (532/561 nm) och AF633 (633 nm). FLARE konidier fungerar inte med 488 nm laser i stället för 532/561 nm laser för dsRed. Vid utförande av detta experiment för denna första gången, använda kontroll konidier med ingen färg och enda färg för att testa för bakgrundsfluorescens och genomblödning mellan dsRed och AF633 kanaler.
- Slå på mikroskopet värmaren före experimentet och ge tillräcklig tid för miljöstyrkammaren att värmas till 37 ° C. Den tid det tar för kammartemperatur att stabilisera kommer att variera för olika mikroskop uppställningar.
- Slå på mikroskop och datorn och load bildprogram. Montera bild skålen på mikroskop scenen och justera fokus för att hitta de humana neutrofiler eller monocyter.
- För dsRed och AF633, ställa in lasereffekten till 10% och exponeringstiden för 1 s i anskaffningsinställningarna.
- Ta bort bild sliden och tillsätt 100 | il av 3 x 10 6 / ml FLARE konidiesuspension till de lämpliga brunnarna (total volym 300 ul / brunn). Registrera den tid som blossar konidier läggs till skålen.
- Återgå bilden på scenen och justera kamerakänslighet för dsRed och AF633 att tydligt se konidier men inte överexponera bilden. Sätt upp en scen punkter lista om flera punkter förvärv krävs.
- Påbörja avbildning när alla punkter är i fokus, är kanalerna optimeras och cykeltiden och varaktigheten är inställd. Cykeltiden och varaktigheten av avbildning beror på den experimentella fråga. Målet är att hålla cykeltiden så kort som möjligt (≤2 min) med 1 min möjliggör fördjupad analys av UPTAKE dynamik.
Representative Results
Representativa resultat visas efter den beskrivna protokollet. Figur 1 illustrerar en representativ 6 h live-cell video med humana neutrofiler och FLARE konidier. dsRed (röd) uttrycks genom konidier själva medan de har märkts med AF633 (Magenta).
Figur 2 är en bild från en enda tidpunkt från en liknande film som visas i figur 1, som illustrerar skillnaden mellan levande och döda FLARE konidier. Döda konidier särskiljs från levande conidia genom att förlora sin (röd) signal dsRed samtidigt som en ljus AF633 (magenta) fluorescens. A. fumigatus konidier överleva ofta inom fagocyter för över 6 h. Därför, för att effektivt kvantifiera döda, flödescytometri kurvor visas för en 16 h inkubationsperiod i figur 3. Dessa data erhölls med en alveolär makrofag cell linje som ett exempel utan kan utföras med vilken som helst celltyp. I figur 4 migreringen visas i den första timmen av stimulering för humana neutrofiler samt deras hastighet och riktad rörelse. Figur 5 visar andelen neutrofiler och monocyter som har intagit en, två, 3 eller fler konidier medan figur 6 visar antalet konidier som gror in i hyfer.
Figur 1: Live-cell video mikroskopi film av mänskliga neutrofiler och FLARE konidier. Neutrofiler isolerades från humant blod och såddes tillsammans med FLARE konidier i CO 2 oberoende medium vid ett förhållande av 1: 3, respektive. Imaging initierades direkt vid 37 ° C med en roterande skiva konfokalmikroskop. Bilder fångades vid 1 min och 55 s intervaller under en period av 6 timmar. Scale bar = 10 | im.En zoom in video visas med kanalerna separerade för att klargöra rollen för FLARE konidier med DIC i det övre vänstra, dsRed (röd) i det övre högra, AF633 (grön) i botten vänster och den sammanslagna video i det nedre högra . Klicka här för att ladda ner video.
Figur 2: Single tidpunkten bild visar skillnaden mellan levande och döda FLARE konidier. Humana neutrofiler stimulerades med FLARE konidier och avbildas med en snurrande skiva konfokalmikroskop. En bild togs från de genererade filmer. Döda konidier skiljer sig från hyfer genom att ha förlorat sin dsRed (red: överst till höger) signal samtidigt som deras AF633 fluorescens (grön: längst ned till vänster). Klicka här för att för en större version av denna figur.
Figur 3: Kvantifiering och validering av fagocytos och dödande av A. fumigatus konidier. Mus alveolmakrofagceller (MH-S) inkuberades med FLARE konidier vid ett 1: 1-förhållande för 16 h i närvaro av voriconazol. MH-S-celler associerade med levande konidier visas i röda porten (dsRed + AF633 +). MH-S-celler associerade med döda konidier visas i den blå grind (dsRed-AF633 +). Bystander MH-S-celler visas i guld grind. Calcofluor White, en cellimpermeabel fluorescerande färg som binder till svampens cellvägg, används för att särskilja extracellulär konidier (Calcofluor Vit +) från intracellulär konidier (Calcofluor White-). Som en extra validering med metoden, är det visat att behandling med 2 | iM cytokalasin D inhiberar konidial upptag av MH-S-celler.e.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig3large.jpg">Please klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Migration av humana neutrofiler och monocyter mot A. fumigatus konidier. Neutrofiler isolerades från humant blod och såddes tillsammans med FLARE konidier i CO 2 oberoende medium vid ett förhållande av 1: 3, respektive. Imaging initierades direkt vid 37 ° C med en roterande skiva konfokalmikroskop. Bilder fångades vid 1 min och 55 s intervaller under en period av 6 timmar. Migration av alla enskilda humana neutrofiler per fält manuellt spårats med spårningsprogram mot vilande (A) och svällt (B) konidier för en timme. Data representerar en ram av celler för varje tillstånd av samma givare. Den slingrande faktor (C), ett mått på directional rörelse och hastigheten (D) var sedan kvantifieras med användning av samma mjukvara. Medelvärde ± SEM för 3 donatorer visas med 30 celler per donator över 2 oberoende experiment. *: P <0,05 (Welch s korrigerade t-test). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Fagocytos av A. fumigatus konidier av humana neutrofiler och monocyter. Neutrofiler och monocyter isolerades från humant blod och såddes tillsammans med FLARE konidier i CO 2 oberoende medium vid ett förhållande av 1: 3, respektive. Imaging initierades direkt vid 37 ° C med en roterande skiva konfokalmikroskop. Bilder fångades vid 1 min och 55 s intervaller under en period av 6 timmar. Fagocytos uppmättes som den mängd celler innehållering FLARE konidier efter 4 h av stimulering. Data presenteras som medelvärde ± SEM från 3 donatorer och 3 bilder per donator över 2 oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Hämning av groning av A. fumigatus konidier av neutrofiler och monocyter. Neutrofiler och monocyter isolerades från humant blod och såddes tillsammans med FLARE konidier i CO 2 oberoende medium vid ett förhållande av 1: 3, respektive. Imaging initierades direkt vid 37 ° C med en roterande skiva konfokalmikroskop. Bilder fångades vid 1 min och 55 s intervaller under en period av 6 timmar. Hämning av svamp groning undersöktes genom att mäta andelen av konidier som hade groddarinated efter 2, 4 och 6 h från samodling. Data presenteras som medelvärde ± SEM från 3 donatorer och 3 bilder per donator över 2 oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Denna metod beskriver en innovativ metod in vitro för att studera den antifungala aktiviteten hos humana primära fagocyter mot A. fumigatus användning av fluorescerande Aspergillus Reporter (FLARE) konidier, levande cell imaging och flödescytometri. Tidigare studier har visat den adderade värdet av att använda FLARE konidier både in vivo i murin experimentell svampinfektion och in vitro bedömning av svampmotverkande immunitet 6, 7. Kombinering FLARE konidier med denna nästa generation levande cell imaging teknik medger en setup för att mäta viabiliteten hos individuella konidier under dynamiska interaktioner in vitro.
Det beskrivna förfarandet har potential för att undersöka de specifika roller och betydelsen av vissa cellulära processer av immunceller på deras antifungala responser. Dessutom svampdödande svar fagocyter från specifika patienter som lider avdefinierade enstaka defekter komponent i deras immunsystem kan bedömas i större detalj. Mycket kan studeras tidiga och initiala antifungala responser i detalj under 6 h av kontinuerlig avbildning. Detta möjliggör även subtila skillnader som skall detekteras, såsom hastigheten hos fagocytsystemet migrering mot svampen, internalisehastigheter, dynamik fungicida händelser 12, vilket skulle vara undistinguishable användning av konventionella fagocytos metoder.
Alla celltyper skulle kunna användas med denna metod; de celltyper som används här valdes ut eftersom dessa fagocyter utgör de första och andra försvarslinjerna i de humana luftvägarna mot A. fumigatus 13. Intressant nog kan observeras mycket tydliga skillnader mellan hur monocyter och neutrofiler samarbeta med vila och svullen konidier och hyfer. Monocyter knappast migrera till konidier, medan neutrofiler uppvisar mycket flyttande aktivitet. Ytterligare fluorescerande markers såsom levande-död markörer på immunceller kan inkluderas i analysen för att ge insikter i fagocyt överlevnad efter interaktioner med Aspergillus. Intressanta potentiella framtida tillämpningar för denna teknologi inkluderar samodling av olika värdcelltyper, konsekvenserna för antifungala responser (t ex makrofager på ett epitelialt monoskikt, monocythärledda dendritiska celler tillsammans med neutrofiler), och realtids-mätning av reaktiv syreproduktion art eller neutrofil extracellulär fälla bildning efter stimulering med Aspergillus.
Några punkter måste noteras att använda detta protokoll, främst laboratoriet installation krävs: ett mikroskop med en inverterad stadium, en miljökammare stabil vid 37 ° C, och excitation / emissionsfilter för dsRed (532/561 nm) och AF633 ( 633 nm). Förmågan hos mikroskopet för att hålla cellerna i fokus och kvarhålla oljeimmersion (särskilt relevant under multi-punkt förvärv) bör kontrolleras periodiskt på grund av den långa varaktigheten av avbildning. För kvantifiering av svampdödande aktivitet flödescytometri anläggningar krävs. Dessutom lämpliga institutionella och etiska godkännanden måste vara på plats för att arbeta med frisk donator och patient härrör blodprov och genmanipulerade svampar. Det rekommenderas starkt att använda färska blodprover (använd samma dag) för att öka cellernas livskraft och bevara funktionalitet. Idealt, är isolering av celler utförs omedelbart efter dragning blodproven och neutrofiler avbildas omedelbart efter isoleringen.
Avslutningsvis, till ett nästa generations levande cell avbildningsteknik bedöma i detalj fagocyt antimykotisk aktivitet mot A. fumigatus beskrivs. Denna teknik kan ge en unik inblick i enskilda cellsvamp interaktioner i tidiga medfödda immunförsvar mot Aspergillus.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete har stötts av MRC och University of Aberdeen (MRC Centrum för medicinsk mykologi) och Wellcome Trust Strategic Award - Medicinsk mykologi Svamp Immunology (SFB, JMB, JK, AW). Ett särskilt tack ges till stöd från Chloe fonden. TMH stöds av ett bidrag från National Institute of Health (NIH, kod RO1 093.808) och Memorial Sloan Kettering Cancer Center stöds av NIH bidrag P30 CA008748. Dessutom är TMH en utredare i patogenesen av Smittskydds stöds av Burroughs Wellcome Fund. Vi vill tacka Aberdeen mikroskopi och histologi Facility för deras hjälp och stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Sigma | G6279 | http://www.sigmaaldrich.com |
| T75 flask | Greiner Bio-One | 658 175 | http://www.greinerbioone.com/ |
| PBS | Gibco | 20012-019 | https://www.thermofisher.com/ |
| Tween-80 | Fisher Scientific | 10592955 | https://nl.fishersci.com/ |
| 40 µm filter | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | https://www.thermofisher.com/ |
| 15 mL Falcon tube | Greiner Bio-One | 188 261 | http://www.greinerbioone.com/ |
| 50 mL Falcon tube | Greiner Bio-One | 227 261 | http://www.greinerbioone.com/ |
| MilliQ | Millipore | QGARD00R1 | Nanopure water works similarly. http://www.merckmillipore.com/ |
| Biotin | Molecular Probes | B-6352 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html |
| DMSO | Sigma | D5879 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Streptavidin-AF633 | Molecular Probes | S-21375 | AF633 is the only tested fluorophore so far that remains visible in phagosomes. https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html |
| EDTA blood tubes | Greiner Bio-One | 455036 | Any blood tubes with an anti-coagulating agent should work. http://www.greinerbioone.com/en/start/ |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | http://www3.gehealthcare.com/ |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | SV3008401 | https://www.thermofisher.com/ |
| HBSS | Gibco | 14170112 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html |
| CD14 microbeads | Myltenyi Biotec | 130-050-201 | Other monocyte isolation methods can be used as well, we prefer this method as it gives a consistent high purity of monocytes without being labor intensive. http://www.miltenyibiotec.com/en/ |
| MS Columns | Myltenyi Biotec | 130-042-201 | See comment at CD14 microbeads. http://www.miltenyibiotec.com/en/ |
| RPMI + Glutamax | Gibco | 72400-021 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html |
| CO2 independent medium | Thermo Fisher Scientific | 18045054 | Necessary if there is not sufficient CO2 exchange during imaging. https://www.thermofisher.com/uk/en/home |
| µ-slide 8 well glass bottom | Ibidi | 80827 | This is the imaging dish that we use, however any glass imaging dish of proper size should work. http://ibidi.com/ |
| UltraVIEW VoX 3D Live Cell Imaging System | Perkin Elmer | L7267000 | Includes volocity software for acquisition and analysis. http://www.perkinelmer.com/ |
| Calcofluor white | Sigma | 18909 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Voriconazole | Sigma | PZ0005 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| BD LSRII | BD Biosciences | Flowcytometer used. https://www.bdbiosciences.com/ |
References
- Kosmidis, C., Denning, D. W. The clinical spectrum of pulmonary aspergillosis. Thorax. 70 (3), 270-277 (2015).
- Warris, A. The biology of pulmonary Aspergillus infections. J Infect. 69 (Suppl 1), S36-S41 (2014).
- Henriet, S. S., et al. Human leukocytes kill Aspergillus nidulans by reactive oxygen species-independent mechanisms. Infect Immun. 79 (2), 767-773 (2010).
- Sheppard, D. C., et al. Comparison of three methodologies for the determination of pulmonary fungal burden in experimental murine aspergillosis. Clin Microbiol Infect. 12 (4), 376-380 (2006).
- Lewis, L. E., Bain, J. M., Okai, B., Gow, N. A. R., Erwig, L. P. Live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis. J Vis Exp. (71), e50196 (2013).
- Heung, L. J., Jhingran, A., Hohl, T. M. Deploying FLAREs to Visualize Functional Outcomes of Host-Pathogen Encounters. PLoS Pathog. 11 (7), e1004912 (2015).
- Jhingran, A., et al. Tracing conidial fate and measuring host cell antifungal activity using a reporter of microbial viability in the lung. Cell Rep. 2 (6), 1762-1773 (2012).
- Espinosa, V., et al. Inflammatory monocytes orchestrate innate antifungal immunity in the lung. PLoS Pathog. 10 (2), e1003940 (2014).
- English, D., Andersen, B. R. Single step separation of red blood cells, granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradient of ficoll hypaque. J Immunol Met. 5 (3), 249-252 (1974).
- Shimizu, K., Keller, N. P. Genetic involvement of a cAMP-dependent protein kinase in a G protein signaling pathway regulating morphological and chemical transitions in Aspergillus nidulans. Genetics. 157 (2), 591-600 (2001).
- Ohradanova-Repic, A., Machacek, C., Fischer, M. B., Stockinger, H. Differentiation of human monocytes and derived subsets of macrophages and dendritic cells by the HLDA10 monoclonal antibody panel. Clin Transl Immunology. 5 (1), e55 (2016).
- Lewis, L. E., et al. Stage specific assessment of Candida albicans phagocytosis by macrophages identifies cell wall composition and morphogenesis as key determinants. PLoS Pathog. 8 (3), e1002578 (2012).
- Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes. J Clin Invest. 69 (3), 617-631 (1982).
