Summary
Her beskriver vi en protokol til at vurdere antifungal aktivitet af primære humane immunceller i realtid under anvendelse af fluorescerende Aspergillus reporter konidier sammenholdt med live-cell video mikroskopi og flowcytometri. Genererede data give indsigt i værtens celle- Aspergillus interaktioner såsom fungicid aktivitet, fagocytose, cellevandring og hæmning af svampevækst.
Abstract
Aspergillus fumigatus er et opportunistisk fungale patogen forårsager invasive infektioner hos immunkompromitterede værter med en høj case-dødeligheden. Forskning undersøger immunologiske responser mod A. fumigatus er blevet begrænset af manglen på konsekvente og pålidelige assays til måling af antifungale aktivitet af specifikke immunceller in vitro. En ny fremgangsmåde er beskrevet til at vurdere den antifungale aktivitet af primære monocytter og neutrofiler fra humane donorer mod A. fumigatus anvendelse af fluorescerende Aspergillus reporteren (FLARE) konidier. Disse konidier indeholder en genetisk kodet dsRed reporter, som udtrykkes konstitutivt i levende FLARE konidier, og er eksternt mærket med Alexa Fluor 633, som er resistente over for nedbrydning i fagolysosomet, således tillader en skelnen mellem levende og døde A. fumigatus konidier. Video mikroskopi og flowcytometri efterfølgende bruges til at visualisere interagereion mellem konidier og medfødte immunceller, vurdere fungicid virkning samtidig giver et væld af oplysninger om fagocyt migration, fagocytose og inhibering af svampevækst. Denne ny teknik har allerede givet spændende ny indsigt i vært-patogen interaktion af primære immunceller mod A. fumigatus. Det er vigtigt at bemærke laboratoriet opsætning kræves for at udføre denne analyse, herunder den nødvendige mikroskopi og flowcytometri faciliteter, og evnen til at arbejde med humant donorblod og genetisk manipulerede svampe. Men dette assay er stand til at generere store mængder data og kan afsløre detaljerede indsigt i den antifungale respons. Denne protokol er med held blevet anvendt til at undersøge vært-patogen interaktion af primære immunceller mod A. fumigatus.
Det er vigtigt at bemærke laboratoriet opsætning kræves for at udføre denne analyse, herunder den nødvendige mikroskopi og flowcytometri facilities, og evnen til at arbejde med humant donorblod og genetisk manipulerede svampe. Men dette assay er stand til at generere store mængder data og kan afsløre detaljerede indsigt i den antifungale respons. Denne protokol er med held blevet anvendt til at undersøge vært-patogen interaktion af primære immunceller mod A. fumigatus.
Introduction
Aspergillus fumigatus er et opportunistisk svampepatogen og de mest almindelige fungale årsag til invasive lungeinfektioner i immunokompromitterede vært 1, 2. Forstå, hvordan værten immunceller genkende og eliminere Aspergillus er et vigtigt område for svampe forskning, men de aktuelt tilgængelige svampedræbende analyser har væsentlige begrænsninger. Almindeligt anvendte metoder til måling af fungicid aktivitet, indbefatter kolorimetriske assays og bestemmelse af kolonidannende enheder 3, 4. Imidlertid er sådanne fremgangsmåder tilvejebringer information om fungal levedygtighed på et enkelt tidspunkt snarere end at se den dynamiske vekselvirkning mellem vært og patogen. Følgelig kan disse fremgangsmåder ikke hensyn til, om en svamp er blevet dræbt eller blot (midlertidigt) begrænset i vækst eller metabolisk aktivitet. Vi har udviklet en metode, der kan observere fungicidal aktivitet direkte og samtidig indfange detaljerede oplysninger om fagocytose, fagocyt migration og hæmning af svampevækst.
Tidligere blev en protokol offentliggjort ved hjælp af real-time imaging som et middel til at måle fagocytose af Candida albicans ved en muse makrofag cellelinie 5. Dette koncept er nu blevet udviklet yderligere at behandle viden hul i vores forståelse af Aspergillus interaktioner med immunceller ved at udnytte fluorescerende Aspergillus reporteren (FLARE) konidier 6, 7, 8. Disse konidier udtrykker en rød fluorofor (dsRed) og er mærket med en anden fluorofor (Alexa Fluor 633). Når en FLARE Konidiet bliver dræbt, stopper det producerer dsRed og den resterende dsRed svinder, mens AF633 forbliver fluorescerende og bundet til konidier. Dette skaber en klar sondring mellem levende og døde fuNGAL celler under levende celler og flowcytometri, og muliggør sporing af den skæbne enkelte konidier efter deres interaktion med immunceller.
De beskrevne assays tilvejebringer en effektiv fremgangsmåde til at visualisere interaktionen mellem værten immunceller og Aspergillus og vil være af betydelig værdi i unraveling de cellulære signalveje der er ansvarlige for antifungale effektormekanismer i medfødte immunceller. Andre anvendelsesområder omfatter visualisere hvordan ændringer i Aspergillus vækst, såsom overgangen fra hvile til hævede konidier, eller fra opsvulmede konidier til hyfer, påvirke fagocyt genkendelse og funktion.
Den følgende protokol beskriver i detaljer, hvordan man opnår humane monocytter og neutrofiler; hvordan man forbereder flare conidier; og hvordan man kan fange deres svar med video mikroskopi og flowcytometri. Selv om anvendelsen af humane immunceller isoleret fra donorblod beskrives her, detteteknik har vist sig lige så effektive anvendelse af en række murine cellepopulationer.
Protocol
Den protokol til opnåelse af neutrofiler og mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) er baseret på tidligere offentliggjorte metoder 9. Brugen af blodprøver fra raske frivillige er blevet godkendt af den menneskelige videnskabsetisk komité fra University of Aberdeen. Før du starter sørge for alle de etiske godkendelser er på plads til at trække blod fra raske frivillige og / eller patienter med henblik på den beskrevne eksperiment. Hold celler på is hvor det er muligt at øge deres overlevelse.
1. A. fumigatus Kultur og Betingelser
- Forberede glucose minimal agar medium som beskrevet 10.
- Justere medier til pH 6,5 ved anvendelse af 1 M NaOH og autoklave ved 120 ° C i 20 minutter.
- Afkøles til 65 ° C.
- Arbejder i et sterilt stinkskab, hæld 30 ml afkølede medier i en T75-kolbe og afkøles med kolbens hals hviler på en 25 ml pipette til create en agar skråning.
- Streak ud dsRed Af293- A. fumigatus-stamme på agaren og inkuberes i 7 dage ved 37 ° C + 5% CO2. To kolber giver ca. 10 9 konidier i 5 ml phosphatbufret saltvand (PBS) forud for biotinylering.
2. A. fumigatus Mærkning og fremstilling
Bemærk: Når denne analyse for første gang, forberede den parentale Af293- A. fumigatus-stamme. Udtage prøver af begge stammer i mikrocentrifugerør og mærke kun en af hver stamme som beskrevet nedenfor. Dette vil tillade en at have kontrol konidier med ingen farve og konidier med en enkelt farve, enten dsRed eller AF633, for at teste opsætningen og udstyr.
- Høst A. fumigatus konidier ved at nedsænke kulturen med 30 ml PBS + 0,05% Tween-80. Filtrer den resulterende suspension gennem et 40 um cellefilter i et 50 ml rør til fjernelse hyfefragmenter.
- Centrifuge ved 805 xg i 10 min, supernatanten fjernes, og vask en gang i 20 ml steril PBS. Pool konidier fra to plader af den samme stamme i løbet af vasketrinet.
- Efter vasketrinnet, pellet resuspenderes i 5 ml PBS og overføres 1 ml portioner af konidiesuspension i mikrocentrifugerør. 1 ml suspension af hver stamme er sædvanligvis tilstrækkelig for levende celler. Wrap de resterende alikvoter i folie og opbevares ved 4 ° C.
- Centrifuge portioner af konidiesuspension ved 9.300 xg i 10 minutter ved stuetemperatur og omhyggeligt fjerne supernatanten. Resuspender konidie pellet i 1 ml 0,05 M NaHCO3 pH 8,3.
- Forbered 10 mg biotin / 200 pi dimethylsulfoxid (DMSO) stamopløsning ved at rekonstituere 25 mg biotin i 500 pi DMSO. Der tilsættes 10 pi biotin / DMSO-stamopløsning til mikrocentrifugerør, dækning i aluminiumsfolie og inkuberes i 2 timer på en rocker ved 4 ° C.
- Alikvot resten af biotin / DMSO-stamopløsning opklaringn og nedfryses til -20 ° C til anvendelse i efterfølgende eksperimenter.
- Centrifugeres i 10 minutter ved 9.300 xg og fjern forsigtigt supernatanten. Resuspender konidie pellet i 1 ml 100 mM Tris-HCI pH 8,0 i 1 time for at deaktivere fritflydende biotin.
- Centrifugeres i 10 minutter ved 9.300 xg og fjern forsigtigt supernatanten. Vask pelleten to gange med 1 ml sterilt PBS, og pellet resuspenderes i 1 ml PBS.
- Opløs 1 mg Streptavidin-AF633 i 0,5 ml PBS til at lave en 2 mg / ml stamopløsning. Der tilsættes 10 pi 2 mg / ml streptavidin-AF633 pr 1 ml konidiesuspension og inkuberes i 40 minutter ved stuetemperatur på en rocker dækket med aluminiumfolie. Det resterende Streptavidin-AF633 kan fryses i portioner til anvendelse i efterfølgende eksperimenter.
- Centrifugeres i 10 minutter ved 9.300 xg og fjern forsigtigt supernatanten. Resuspender konidie pellet i 1 ml PBS og tælle konidier anvendelse af et hæmocytometer ved en 1: 1000 fortynding (1: 100 og derefter 1:10). Juster konidie fusions 3,6 x 10 6 / ml med CO2 uafhængige medier, wrap i folie og opbevares ved 4 ° C.
BEMÆRK: Konidierne er nu mærket med AF633 og vil blive omtalt som FLARE konidier. - Valgfrit: Hvis stimulering med opsvulmede konidier er påkrævet, efter optælling konidier (trin 2.9), fortyndes konidier til 7,2 x 10 6 / ml i gærnitrogenbase (YNB) medium og tilsættes 500 pi konidiesuspension til 4,5 ml YNB-medium i en autoklaveret 50 ml Erlenmeyerkolbe. Dække og kolben anbringes i en rysteinkubator (200 rpm ved 37 ° C) i 6 timer.
- Overførsel til en 15 ml rør mediet. Der centrifugeres ved 805 xg i 10 minutter ved stuetemperatur og vask en gang i PBS. Centrifuger igen og resuspender pellet i 1 ml CO2 uafhængig medium, hvilket giver 3,6 x 10 6 konidier / ml.
Bemærk: Konidier ofte klumper, når de bliver hævede gør præcis optælling vanskelig, anbefales det at beregne med counted antal hvilende konidier anvendes.
- Overførsel til en 15 ml rør mediet. Der centrifugeres ved 805 xg i 10 minutter ved stuetemperatur og vask en gang i PBS. Centrifuger igen og resuspender pellet i 1 ml CO2 uafhængig medium, hvilket giver 3,6 x 10 6 konidier / ml.
3. Isolering af humane neutrofiler og monocytter
- Trække 20 ml venøst blod fra raske frivillige i to 10 ml blod rør indeholdende ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA). For hver donor separat, hæld 20 ml blod i et 50 ml rør og fortyndes med 15 ml PBS.
- Underlag blodet med 15 ml af en lymfocyt isolation opløsning (densitet 1,077 g / ml) med en sprøjte og jern nål. Placer nålen i bunden af røret og forsigtigt tvinge lymfocyt isolation opløsning ud. Centrifugere ved 630 xg i 20 minutter uden bremse og lav acceleration.
- Forberede PBS, afkølet på is.
BEMÆRK: Trin 3.4 og 3.5 skal følges samtidigt at generere monocytter (3.4) og neutrofiler (3,5). - Under anvendelse af en pastette, indsamles PBMC lag. Dette er det lag i midten mellem den gule serum (øvre) og den transparente lymfocyt isolation opløsning (lavere) lag, ogoverføres til et frisk 50 ml rør.
- Fyld røret med PBMC op til 50 ml med kold PBS og centrifugeres ved 582 xg i 10 min. Fjern supernatanten og vask to gange med kold PBS og resuspenderes i 1 ml PBS per 20 ml af donorblod anvendte oprindeligt.
- Gøre 1:10 fortyndinger til tælling ved tilsætning af 20 pi af cellesuspensionen til 160 pi PBS og 20 pi trypanblåt. Tæl celler med en hæmocytometer.
- Fremstille en bufferopløsning ved tilsætning 26 ml varmeinaktiveret føtalt kalveserum (FCS) og 2,1 ml 0,5 M EDTA til 500 ml HBSS. Centrifuger cellerne i 10 minutter ved 515 xg og resuspender i 40 pi pufferopløsning pr 1 x 10 7 celler.
- Overfør cellesuspensionen til en 15 ml rør og tilsættes 10 pi af CD14 mikroperler pr 1 x 10 7 celler, bland godt og inkuberes i 15 minutter ved 4 ° C og sørge for at blande rørene hver 5 min.
- Vask cellerne ved at tilsætte 1 ml pufferopløsning pr 1 x 10 7 celler og centrifuge ved 515 xg i 10 min.
- Aspirer supernatanten fuldstændigt og resuspender op til 1 x 10 8 celler i 500 pi pufferopløsning.
- Placere 1 kolonne per prøve på en magnetisk separator ifølge producentens anvisninger. Dernæst vaskes søjlen en gang med 500 pi pufferopløsning.
- Pipette de 500 pi cellesuspension gennem søjlen, vente på kolonnen for at tørre og derefter vaske ved at gentage dette tre gange med bufferopløsning.
- Placere en ny 15 ml rør under kolonnen og tage kolonnen fra den magnetiske separator. skylle hvorefter cellerne ud af søjlen i røret med 1 ml pufferopløsning.
- Tilsæt 4 ml pufferopløsning og der centrifugeres ved 515 xg i 10 minutter og derefter genopslæmme i 1 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium.
- Gøre 1:10 fortyndinger til tælling ved tilsætning af 20 pi af cellesuspensionen til 160 pi PBS og 20 pi trypanblåt. Tæl cellerne med enhæmocytometer.
- Juster cellekoncentrationen til 6 x 10 5 / ml med RPMI og frø 200 pi på en 35 mm glas-baserede imaging skålen. Inkuber natten over ved 37 ° C med 5% CO2.
- Den næste dag, før billeddannelse, fjern RPMI og tilsæt 200 pi CO 2 uafhængige medium.
Bemærk: Disse monocytter kan også differentieres i forskellige makrofagpopulationer delmængder før billeddannelse. Hvis dette er en teknik, der skal undersøges, et godt udgangspunkt er den nylige papir ved Ohradanova-Repic et al. 1 1.
- Efter høst af PBMC laget, fjerne alle serummet og det meste af lymfocyt isolation opløsning, men pas på ikke at fjerne den lille hvide bånd på toppen af røde pellet, da dette vil indeholde de fleste af neutrofiler.
- Forberede en 10x hypotonisk lysepuffer lager ved tilsætning 83 g NH4Cl og 10 g KHCO3 i 1 I sterilt vand. Opbevares ved 4 °C.
- Fortynd denne bestand 10x med sterilt vand og føje den til rørene. Derefter forsigtigt vendes 3 gange og inkuberes i is i 15 minutter.
- Centrifuger ved 394 xg i 10 minutter og resuspender i hypotonisk lysepuffer i 10 minutter i is.
- Der centrifugeres ved 394 xg og vaskes to gange med kold PBS. Resuspender i 1 ml CO 2 uafhængige medium pr donor.
- Gøre 1:10 fortyndinger til tælling ved tilsætning af 20 pi af cellesuspensionen til 160 pi PBS og 20 pi trypanblåt. Tæl cellerne med et hæmocytometer.
- Til flowcytometri, indstille koncentrationen til 6 x 10 5 / ml og tilsæt 400 pi cellesuspension til en plade med 24 brønde. Til mikroskopi, tilsættes 200 pi af den samme cellesuspension til en 35 mm glas-baserede imaging skålen.
Bemærk: Neutrofil billeddannelse eller flowcytometri bør indledes straks på grund af deres tilbøjelighed til at undergå apoptose, hvis ustimuleret. Hvis dette ikke er bør holdes på mulige neutrofileris og anvendes så hurtigt som muligt (inden for samme dag).
4. flowcytometri
- Tilsæt 200 pi 1,2 x 10 6 / ml FLARE konidier til cellerne i 24-brønds plade, og derefter tilsættes 100 pi 20 ug / ml voriconazol. Tilsæt 300 pi RPMI og inkuberes i 16 timer ved 37 ° C med 5% CO2.
BEMÆRK: Voriconazol tilsættes for at forhindre konidial spiring. - 25 pi af en 1 mM Calcofluor-hvid stamopløsning til hver brønd til en slutkoncentration på 25 pM og inkuberes i 10 minutter ved 37 ° C med 5% CO2.
- Der centrifugeres ved 582 xg i 10 min. Fjern supernatanten og vask to gange med PBS.
- At høste adhærente celler (monocytter), tilsættes 1 ml PBS med 3 mM EDTA til hver brønd og inkuberes i 10 minutter ved 37 ° C med 5% CO2. Forsigtigt vaske celler fra pladen ved pipettering og samle celler i et rør.
- Vask en gang i FACS buffer (2% føtalt kalveserum til PBS), og derefter genopslæmme i FACS Buffer for FACS-analyse.
- Til FACS-analyse, først justere kompensationsparametre af flowcytometeret og sæt positive porte ved hjælp ensfarvet kompensation rør, herunder konidier med ingen farve: dsRed + konidier, AF633 + konidier, og Calcofluor White + konidier (dannet som i 4.2).
- Set fri konidier gate baseret på forward og sidespredning hjælp konidier uden farve. Sæt celle gate på fremad og sidespredning ved at udelukke den frie konidier porten.
- Analyser prøveglas ved at optage 10.000 begivenheder.
BEMÆRK: Celler, der er forbundet med levende sporer vil blive dsRed + og AF633 +. Celler, der er forbundet med døde sporer vil kun være AF633 +. Bystander celler, der ikke har engageret conidier bliver dsRed- og AF633-. De konidier-engageret cellepopulationer er yderligere analyseret for Calcofluor White farvning på Pacific Blue-kanalen. Konidier, der forbliver uden for celler vil være Calcofluor White +, og konidier, der er blevet internaliseret vil væreCalcofluor Hvid-.
5. Levende Cell Video Microscopy
Bemærk: Valget af mikroskop vil afhænge af, hvad der er til rådighed lokalt, men mikroskopet opsætningen skal indsætte en omvendt fase, et klimakammer opvarmet til 37 ° C og passende excitation / emissionsfiltre for dsRed (532/561 nm) og AF633 (633 nm). FLARE konidier fungerer ikke med 488 nm laseren i stedet for 532/561 nm laser til dsRed. Ved udførelse af dette eksperiment for dette første gang, bruge kontrol konidier uden farve og enkelt farve til at teste for baggrundsfluorescens og bløder-through mellem dsRed og AF633 kanaler.
- Tænde mikroskopet varmelegeme før forsøget og give tilstrækkelig tid til styrekammeret den miljømæssige at opvarme til 37 ° C. Den tid, kammer temperaturligevaegten vil variere for forskellige mikroskop opsætninger.
- Tænd mikroskop og computeren, og loannonce imaging-softwaren. Monter imaging fadet på mikroskopet scenen og justere fokus for at finde de humane neutrofiler eller monocytter.
- For dsRed og AF633, indstille laseren magt til 10% og eksponeringstid til 1 s i indstillingerne for erhvervelse.
- Fjern billeddannende slide og tilsæt 100 pi 3 x 10 6 / ml FLARE konidiesuspension til de passende brønde (totalt volumen 300 pl / brønd). Optag den tid, flare konidier føjes til fadet.
- Retur slide på scenen og justere kameraets følsomhed for dsRed og AF633 til klart at se den konidier men ikke overeksponere billedet. Opsæt en scene punkter liste, hvis erhvervelsen multi-point er påkrævet.
- Begynd billeddannelse, når alle punkter er i fokus, er kanalerne optimeres og cyklus tid og varighed er indstillet. Cyklus tid og varighed af billedbehandling afhænger af den eksperimentelle spørgsmål. Målet er at holde cyklustiden så kort som mulig (≤2 min) med 1 min muliggør dybdegående analyse af uptake dynamik.
Representative Results
Repræsentative resultater er vist efter den beskrevne protokol. Figur 1 illustrerer en repræsentativ 6 timer live-cell video med humane neutrofiler og FLARE konidier. dsRed (rød) udtrykkes af konidier sig selv, mens de er blevet mærket med AF633 (magenta).
Figur 2 er et billede fra et enkelt tidspunkt fra en lignende film som vist i figur 1, der illustrerer forskellen mellem levende og døde FLARE konidier. Døde konidier adskiller sig fra live-konidier ved at miste deres dsRed (rød) signal og samtidig opretholde en lys AF633 (magenta) fluorescens. A. fumigatus konidier ofte overleve inden fagocytter i over 6 timer. Derfor effektivt at kvantificere drab, flowcytometri afbildninger er vist for en 16 timer inkubationsperiode i figur 3. Disse data blev opnået med en alveolær makrofag cell linje som et eksempel, men kan udføres med en hvilken som helst celletype. I figur 4 migrationen er vist i den første time af stimulation til humane neutrofiler samt deres hastighed og retningsbestemt bevægelse. Figur 5 viser procentdelen af neutrofiler og monocytter, der har indtaget 1, 2, 3 eller flere konidier mens figur 6 viser antallet af konidier, der spire i hyfer.
Figur 1: Levende-celle video mikroskopi film af humane neutrofiler og flare konidier. Neutrofiler blev isoleret fra humant blod og podet sammen med FLARE konidier i CO2 uafhængig medium i et forhold på 1: 3. Billeddannelse blev initieret direkte ved 37 ° C med en roterende skive konfokalt mikroskop. Der blev taget billeder ved 1 min og 55 s intervaller over en periode på 6 timer. Skalasøjle = 10 um.En zoomet ind video vises med de kanaler, der er adskilt for at præcisere, hvilken rolle flare konidier med DIC i øverste venstre, dsRed (rød) i øverste højre, AF633 (grøn) i bunden til venstre og den fusionerede video i nederste højre . Klik her for at downloade denne video.
Figur 2: Enkelt tidspunkt billedet demonstrerer forskellen mellem levende og døde FLARE konidier. Humane neutrofiler blev stimuleret med FLARE konidier og afbildes med en roterende skive konfokalt mikroskop. Et billede blev taget fra de genererede film. Døde konidier adskiller sig fra hyfer ved at have mistet deres dsRed (rød: øverst til højre) signal og samtidig bevare deres AF633 fluorescens (grøn: nederst til venstre). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Kvantificering og validering af fagocytose og drab af A. fumigatus konidier. Muse alveolære makrofagceller (MH-S) blev inkuberet med FLARE konidier i et 1: 1 forhold i 16 timer i nærvær af voriconazol. MH-S-celler er associeret med levende konidier er vist i den røde port (dsRed + AF633 +). MH-S-celler er forbundet med døde konidier er vist i den blå gate (dsRed-AF633 +). Bystander MH-S-celler er vist i den guld gate. Calcofluor White, celleimpermeabelt fluorescerende farvestof, der binder til svampens cellevæg, anvendes til at skelne ekstracellulær konidier (Calcofluor White +) fra intracellulær konidier (Calcofluor White-). Som en ekstra validering til fremgangsmåden, er det vist, at behandling med 2 uM cytochalasin D inhiberer konidial optagelse af MH-S-celler.e.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig3large.jpg">Please klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Migration af humane neutrofiler og monocytter mod A. fumigatus konidier. Neutrofiler blev isoleret fra humant blod og podet sammen med FLARE konidier i CO2 uafhængig medium i et forhold på 1: 3. Billeddannelse blev initieret direkte ved 37 ° C med en roterende skive konfokalt mikroskop. Der blev taget billeder ved 1 min og 55 s intervaller over en periode på 6 timer. Migration af alle individuelle humane neutrofiler per felt blev manuelt spores vha tracking software mod hvilende (A) og opsvulmet (B) konidier i 1 time. Data betegner 1 ramme af celler for hver betingelse af samme donor. Den bugtende faktor (C), et mål for directional bevægelse, og hastighed (D) blev derefter kvantificeret under anvendelse af samme software. Middelværdi ± SEM for 3 donorer er vist med 30 celler pr donor end 2 uafhængige eksperimenter. *: P <0,05 (Welch korrigerede t-test). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Fagocytose af A. fumigatus konidier af humane neutrofiler og monocytter. Neutrofiler og monocytter blev isoleret fra humant blod og podet sammen med FLARE konidier i CO2 uafhængig medium i et forhold på 1: 3. Billeddannelse blev initieret direkte ved 37 ° C med en roterende skive konfokalt mikroskop. Der blev taget billeder ved 1 min og 55 s intervaller over en periode på 6 timer. Fagocytose blev målt som mængden af celler indeholdering FLARE konidier efter 4 timers stimulering. Dataene er angivet som middelværdi ± SEM fra 3 donorer og 3 billeder pr donor end 2 uafhængige eksperimenter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Inhibering af spiring af A. fumigatus konidier af neutrofiler og monocytter. Neutrofiler og monocytter blev isoleret fra humant blod og podet sammen med FLARE konidier i CO2 uafhængig medium i et forhold på 1: 3. Billeddannelse blev initieret direkte ved 37 ° C med en roterende skive konfokalt mikroskop. Der blev taget billeder ved 1 min og 55 s intervaller over en periode på 6 timer. Inhibering af fungal spiring blev undersøgt ved måling af procentdelen af konidier, der havde kimnering efter 2, 4 og 6 timer af co-kultur. Dataene er angivet som middelværdi ± SEM fra 3 donorer og 3 billeder pr donor end 2 uafhængige eksperimenter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Denne metode beskriver en innovativ in vitro metode til at studere den antifungale aktivitet af humane primære fagocytter mod A. fumigatus anvendelse af fluorescerende Aspergillus REPORTER (FLARE) konidier, levende celler og flowcytometri. Tidligere undersøgelser har vist den merværdi anvendelse FLARE konidier både in vivo i murin eksperimentel svampeinfektion og in vitro vurdering af antifungal immunitet 6, 7. Kombinere FLARE konidier med denne næste generation af levende celler teknik muliggør en opsætning til at måle levedygtigheden af individuel konidier under dynamiske interaktioner in vitro.
Den beskrevne fremgangsmåde har potentiale til at undersøge de specifikke roller og betydning af visse cellulære processer af immunceller på deres antifungale responser. Hertil kommer, antifungale responser af fagocytter fra specifikke patienterdefinerede enkelt komponent defekter i deres immunsystem kan vurderes nærmere. Meget tidlige og indledende antifungale reaktioner kan studeres i detaljer i løbet af 6 timer med kontinuerlig billeddannelse. Dette giver mulighed for selv subtile forskelle, der skal detekteres, såsom hastigheden af fagocyt overgangen til svampen, internalisering satser, dynamik fungicide begivenheder 12, hvilket ville være undistinguishable anvendelse af konventionelle fagocytose fremgangsmåder.
Hvilken som helst celletype kan anvendes med denne metode; celletyperne her anvendte blev udvalgt, fordi disse fagocytter udgør de første og anden linje til forsvar i de humane luftveje mod A. fumigatus 13. Interessant nok kan iagttages meget klare forskelle mellem hvordan monocytter og neutrofiler i indgreb med hvilende og hævede konidier og hyfer. Monocytter næppe migrere til konidier, mens neutrofiler vise meget mere vandrende aktivitet. Yderligere fluorescerende markers såsom levende-døde markører på immunceller kan indbefattes i assayet for at give indsigt i fagocyt overlevelse efter interaktioner med Aspergillus. Interessante potentielle fremtidige ansøgninger om denne teknologi omfatter co-dyrkning af forskellige værtscelletyper, konsekvenserne for antifungale responser (fx makrofager på en epitelcelle monolag, monocytafledte dendritiske celler sammen med neutrofiler), og den tidstro måling af reaktiv produktion oxygenformer eller neutrofil ekstracellulær fælde formation efter stimulering med Aspergillus.
Enkelte punkter skal bemærkes at bruge denne protokol fremmest laboratoriet opsætning nødvendig: et mikroskop med en inverteret fase, et miljøkammer stabil ved 37 ° C, og excitation / emissionsfiltre for dsRed (532/561 nm) og AF633 ( 633 nm). Evnen af mikroskopet for at holde cellerne i fokus og fastholde immersionsolien (særlig relevant under mUlti-punkt erhvervelse) bør overvåges med jævne mellemrum på grund af den lange varighed af billeddannelse. Til kvantificering af fungicid aktivitet flowcytometri faciliteter er nødvendige. Derudover passende institutionelle og etisk godkendelse skal være på plads til at arbejde med rask donor og patient afledt blodprøver og genetisk manipulerede svampe. Det anbefales kraftigt at bruge friske blodprøver (brug på samme dag) for at forbedre cellelevedygtighed og bevare funktionaliteten. Ideelt er isolering af celler udføres umiddelbart efter trækning blodprøverne og neutrofiler afbildes straks efter isolering.
Afslutningsvis til en næste generation af levende celler teknik vurdere i stor detalje fagocyt svampedræbende aktivitet mod A. fumigatus er beskrevet. Denne teknologi kan give et unikt indblik i de enkelte celle-svampe interaktioner i begyndelsen af medfødte immunforsvar mod Aspergillus.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde er blevet støttet af MRC og University of Aberdeen (MRC Center for Medicinsk Mykologi) og af Wellcome Trust Strategic Award - Medicinsk Mykologi Fungal Immunologi (SFB, JMB, JK, AW). En særlig tak gives til støtte fra Chloe fond. TMH er støttet af en bevilling fra National Institute of Health (NIH, kode RO1 093.808) og Memorial Sloan Kettering Cancer Center er støttet af NIH tilskud P30 CA008748. Derudover TMH er en efterforsker i Patogenese af smitsomme sygdomme støttet af Burroughs Wellcome fonden. Vi vil gerne takke Aberdeen Mikroskopi og Histologi faciliteten for deres hjælp og støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Sigma | G6279 | http://www.sigmaaldrich.com |
| T75 flask | Greiner Bio-One | 658 175 | http://www.greinerbioone.com/ |
| PBS | Gibco | 20012-019 | https://www.thermofisher.com/ |
| Tween-80 | Fisher Scientific | 10592955 | https://nl.fishersci.com/ |
| 40 µm filter | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | https://www.thermofisher.com/ |
| 15 mL Falcon tube | Greiner Bio-One | 188 261 | http://www.greinerbioone.com/ |
| 50 mL Falcon tube | Greiner Bio-One | 227 261 | http://www.greinerbioone.com/ |
| MilliQ | Millipore | QGARD00R1 | Nanopure water works similarly. http://www.merckmillipore.com/ |
| Biotin | Molecular Probes | B-6352 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html |
| DMSO | Sigma | D5879 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Streptavidin-AF633 | Molecular Probes | S-21375 | AF633 is the only tested fluorophore so far that remains visible in phagosomes. https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html |
| EDTA blood tubes | Greiner Bio-One | 455036 | Any blood tubes with an anti-coagulating agent should work. http://www.greinerbioone.com/en/start/ |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | http://www3.gehealthcare.com/ |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | SV3008401 | https://www.thermofisher.com/ |
| HBSS | Gibco | 14170112 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html |
| CD14 microbeads | Myltenyi Biotec | 130-050-201 | Other monocyte isolation methods can be used as well, we prefer this method as it gives a consistent high purity of monocytes without being labor intensive. http://www.miltenyibiotec.com/en/ |
| MS Columns | Myltenyi Biotec | 130-042-201 | See comment at CD14 microbeads. http://www.miltenyibiotec.com/en/ |
| RPMI + Glutamax | Gibco | 72400-021 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html |
| CO2 independent medium | Thermo Fisher Scientific | 18045054 | Necessary if there is not sufficient CO2 exchange during imaging. https://www.thermofisher.com/uk/en/home |
| µ-slide 8 well glass bottom | Ibidi | 80827 | This is the imaging dish that we use, however any glass imaging dish of proper size should work. http://ibidi.com/ |
| UltraVIEW VoX 3D Live Cell Imaging System | Perkin Elmer | L7267000 | Includes volocity software for acquisition and analysis. http://www.perkinelmer.com/ |
| Calcofluor white | Sigma | 18909 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Voriconazole | Sigma | PZ0005 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| BD LSRII | BD Biosciences | Flowcytometer used. https://www.bdbiosciences.com/ |
References
- Kosmidis, C., Denning, D. W. The clinical spectrum of pulmonary aspergillosis. Thorax. 70 (3), 270-277 (2015).
- Warris, A. The biology of pulmonary Aspergillus infections. J Infect. 69 (Suppl 1), S36-S41 (2014).
- Henriet, S. S., et al. Human leukocytes kill Aspergillus nidulans by reactive oxygen species-independent mechanisms. Infect Immun. 79 (2), 767-773 (2010).
- Sheppard, D. C., et al. Comparison of three methodologies for the determination of pulmonary fungal burden in experimental murine aspergillosis. Clin Microbiol Infect. 12 (4), 376-380 (2006).
- Lewis, L. E., Bain, J. M., Okai, B., Gow, N. A. R., Erwig, L. P. Live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis. J Vis Exp. (71), e50196 (2013).
- Heung, L. J., Jhingran, A., Hohl, T. M. Deploying FLAREs to Visualize Functional Outcomes of Host-Pathogen Encounters. PLoS Pathog. 11 (7), e1004912 (2015).
- Jhingran, A., et al. Tracing conidial fate and measuring host cell antifungal activity using a reporter of microbial viability in the lung. Cell Rep. 2 (6), 1762-1773 (2012).
- Espinosa, V., et al. Inflammatory monocytes orchestrate innate antifungal immunity in the lung. PLoS Pathog. 10 (2), e1003940 (2014).
- English, D., Andersen, B. R. Single step separation of red blood cells, granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradient of ficoll hypaque. J Immunol Met. 5 (3), 249-252 (1974).
- Shimizu, K., Keller, N. P. Genetic involvement of a cAMP-dependent protein kinase in a G protein signaling pathway regulating morphological and chemical transitions in Aspergillus nidulans. Genetics. 157 (2), 591-600 (2001).
- Ohradanova-Repic, A., Machacek, C., Fischer, M. B., Stockinger, H. Differentiation of human monocytes and derived subsets of macrophages and dendritic cells by the HLDA10 monoclonal antibody panel. Clin Transl Immunology. 5 (1), e55 (2016).
- Lewis, L. E., et al. Stage specific assessment of Candida albicans phagocytosis by macrophages identifies cell wall composition and morphogenesis as key determinants. PLoS Pathog. 8 (3), e1002578 (2012).
- Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes. J Clin Invest. 69 (3), 617-631 (1982).
