Summary
כאן, אנו מתארים פרוטוקול להעריך פעילות אנטי-פטרייתית של תאי מערכת חיסון אנושיים עיקריים בזמן אמת באמצעות נבגי כתב ניאון אספרגילוס בשיתוף עם מיקרוסקופ וידאו חי התאים cytometry זרימה. נתונים המופקים לספק תובנה אינטראקציות אספרגילוס cell- מארח כגון פעילות קוטלת פטריות, phagocytosis, נדידת תאים ועיכוב של גידול פטרייתי.
Abstract
אספרגילוס fumigatus הוא פתוגן פטרייתיים אופורטוניסטי גרימת זיהומים פולשניים ב המארחים מדוכאי חיסון עם שיעור מקרה תמותה גבוה. מחקר חוקר תגובות חיסוניות נגד fumigatus א הוגבל על ידי חוסר מבחן עקבי ואמין למדידת הפעילות אנטי-פטרייתית של תאי מערכת חיסון ספציפיים במבחנה. שיטה חדשה מתואר להעריך את הפעילות נגד פטריות של מונוציטים ו נויטרופילים הראשוני מתורמים אדם נגד fumigatus א באמצעות פלורסנט אספרגילוס Reporter (Flare) נבגים. נבגים אלה מכילים כתב dsRed מקודדים גנטי, אשר באה לידי ביטוי constitutively ידי נבגי התלקחות חיים, ו מסומנות חיצוני עם אלקסה פלואוריד 633, אשר עמיד בפני פירוק בתוך phagolysosome, ובכך מאפשרים הבחנה בין נבגי fumigatus א מתו לחיות. מיקרוסקופ וידאו ו- flow cytometry לאחר מכן הם רגילים לחזות אינטראקציהיון בין נבגים ותאי חיסון מולדים, הערכת פעילות קוטלת פטריות בזמן גם לספק שפע של מידע על גירת תָא בַּלעָן, phagocytosis ואת עיכוב צמיחה פטרייתיים. שיטה חדשנית זו כבר סיפקה תובנות חדשות ומלהיבות לתוך אינטראקציה מארח הפתוגן של תאי מערכת החיסון הראשוני נגד fumigatus א. חשוב לציין את התקנת המעבדה נדרשת לבצע assay זה, כולל מיקרוסקופיה ההכרחי cytometry זרימת מתקנים, ואת היכולת לעבוד עם דם תורם אנושי ופטריות מניפולציות גנטיות. עם זאת, assay זה הוא מסוגל לייצר כמויות גדולות של נתונים יכול לחשוף מידע מפורט לגבי התגובה נגד הפטריות. פרוטוקול זה שימש בהצלחה לחקור את האינטראקציה מארח הפתוגן של תאי מערכת החיסון הראשוני נגד fumigatus א.
חשוב לציין את התקנת המעבדה נדרשת לבצע assay זה, כולל מיקרוסקופיה ההכרחי cytometry זרימת facilities, ואת היכולת לעבוד עם דם תורם אנושי ופטריות מניפולציות גנטיות. עם זאת, assay זה הוא מסוגל לייצר כמויות גדולות של נתונים יכול לחשוף מידע מפורט לגבי התגובה נגד הפטריות. פרוטוקול זה שימש בהצלחה לחקור את האינטראקציה מארח הפתוגן של תאי מערכת החיסון הראשוני נגד fumigatus א.
Introduction
אספרגילוס fumigatus הוא פתוגן פטרייתיים אופורטוניסטי והגורם פטרייתי הנפוץ ביותר של דלקות ריאות פולשנית בבית המארח 1 מדוכאי החיסון, 2. הבנה כיצד חיסון תאי מארח לזהות ולסלק אספרגילוס הוא אזור חשוב של מחקר פטרייתיים, לעומת זאת, מבחני קוטל הפטריות זמינים כרגע יש מגבלות משמעותיות. בדרך כלל שיטות המשמשות למדידת פעילות קוטלת פטריות כוללות מבחני colorimetric ונחישות של יחידות מושבה להרכיב 3, 4. עם זאת, שיטות כאלה לספק מידע על כדאיות פטרייתיים בנקודת זמן אחת במקום להציג את האינטראקציה הדינמית בין המארח הפתוגן. בהתאם לכך, השיטות האלה לא יכולות לקחת בחשבון אם פטרייה כבר נהרגה או פשוט (באופן זמני) מוגבל בצמיחה או פעילות מטבולית. פיתחנו שיטה המסוגלת התבוננות fungiciדאל פעילות ישירות תוך לכידת מידע מפורט בו זמנית לגבי phagocytosis, הגירה תָא בַּלעָן ועיכוב של גידול פטרייתי.
בעבר, פרוטוקול פורסם באמצעות הדמיה בזמן אמת כאמצעי למדוד phagocytosis של קנדידה אלביקנס ידי קו התא מקרופאג עכבר 5. מושג זה עתה פותח עוד יותר להתייחס לפער בידע בהבנתנו אינטראקציות אספרגילוס עם תאי מערכת חיסון על ידי ניצול פלורסנט אספרגילוס Reporter (Flare) נבגים 6, 7, 8. נבגים אלה מבטאים fluorophore אדום (dsRed) ו מסומנים עם fluorophore שני (Alexa פלואוריד 633). לאחר התלקחות conidium נהרג, הוא מפסיק לייצר dsRed ואת הנותרים dsRed דוהה, בעוד AF633 נשאר פלורסנט וכרוך אל נבגים. זה יוצר הבחנה ברורה בין פו מת לחיותתאים NGAL במהלך ההדמיה תא חי cytometry זרימה, ומאפשר מעקב של גורל נבגים בודדים הבאים האינטראקציה שלהם עם תאי מערכת החיסון.
מבחני המתוארים לקבוע דרך יעילה לדמיין את האינטראקציה בין תאי מארחים חיסוניים אספרגילוס ויהיה בעל ערך רב גם חשיפה של מסלולי הסלולר האיתות אחראים מנגנוני מפעיל נגד פטריות תאים חיסוניים מולדים. יישומים אחרים כוללים לדמיין כיצד שינויים בצמיחה אספרגילוס, כגון מתג מן נח אל נבגים נפוחות, או מן נבגים נפוחות כדי העובש, להשפיע הכרה תָא בַּלעָן ולתפקד.
הפרוטוקול הבא מתאר בפירוט כיצד להשיג מונוציטים אדם נויטרופילים; כיצד להכין את נבגי ההתלקחות; ואיך לתפוס את תגובותיהם עם מיקרוסקופ וידאו cytometry זרימה. למרות השימוש בתאי חיסון אנושיים שבודדים מדם תורם מתואר כאן, זההטכניקה הוכיחה פחות אפקטיבית תוך שימוש במגוון של אוכלוסיות תאים בעכברים.
Protocol
הפרוטוקול לקבלת נויטרופילים ותאי דם היקפי mononuclear (PBMC) מבוסס על שיטות שפורסמו בעבר 9. השימוש דגימות דם ממתנדבים בריאים אושרה על ידי ועדת האתיקה לניסויים בבני אדם מאוניברסיטת אברדין. לפני שמתחילים לוודא שכל האישורים האתיים נמצאים במקום לציור דם ממתנדבים בריאים ו / או חולים לצורך הניסוי המתואר. שמור את התאים על הקרח שבו ניתן להגדיל את הישרדותם.
תרבות והגבלות 1. א fumigatus
- כן גלוקוז הבינוני אגרו מינימאלית כמתואר 10.
- התאם מדיה ל- pH 6.5 באמצעות 1 M NaOH החיטוי ב 120 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
- אפשר לקרר כדי 65 מעלות צלזיוס.
- עבודה במנדף זרימה סטרילי, לשפוך 30 מ"ל של התקשורת מקורר לתוך בקבוק T75 להתקרר עם הצוואר השראת הבקבוק על פיפטה 25 מ"ל ל גreate מדרון אגר.
- Streak את זן א fumigatus dsRed Af293- על אגר דגירה במשך 7 ימים על 37 ° C + 5% CO 2. שתי צלוחיות תניב כ 10 9 נבגים ב 5 מ"ל פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) טרום biotinylation.
2. א fumigatus תיוג והכנה
הערה: בעת ביצוע assay זה בפעם הראשונה, להכין את זן א fumigatus Af293- ההורי. קח דגימות של שני זני צינורות microcentrifuge ותייגת רק אחת מכל זן כמתואר להלן. זה יאפשר לקיים אחת נבגים מלאים ללא צבע נבגים עם צבע אחד, או dsRed או AF633, בדיקת ההתקנה והציוד.
- קציר fumigatus א נבגים ידי טבילה תרבות עם 30 מ"ל PBS + 0.05% Tween-80. סנן את ההשעיה וכתוצאה דרך מסננת תא 40 מיקרומטר לתוך צינור 50 מ"ל להסיר שברי hyphal.
- גentrifuge ב 805 XG במשך 10 דקות, להסיר את supernatant ולשטוף פעם 20 מ"ל של PBS סטרילית. ברכת נבגים משתי צלחות מאותו הזן במהלך השלב לשטוף.
- בעקבות הצעד כביסה, resuspend גלולה ב 5 מ"ל של PBS והעברה 1 aliquots מ"ל של השעיה הנבגים לתוך צינורות microcentrifuge. 1 מ"ל של השעיה של כל זן הוא בדרך כלל מספיק עבור הדמיה תא חי. עוטפים את aliquots הנותרים בנייר ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
- aliquots צנטריפוגה ההשעיה הנבגים ב 9300 XG במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בזהירות להסיר supernatant. Resuspend גלולה הנבגים ב 1 מ"ל 0.05 M NaHCO 3 pH 8.3.
- הכן 10 מ"ג ביוטין / 200 μL dimethylsulfoxide (DMSO) פתרון המניות על ידי reconstituting ביוטין 25 מ"ג ב 500 μL DMSO. להוסיף 10 μL ביוטין / פתרון מניות DMSO אל צינור microcentrifuge, כיסוי בנייר אלומיניום דגירה במשך 2 h על כיסא נדנדה ב 4 ° C..
- Aliquot שאר solutio המניות ביוטין / DMSOn ולהקפיא ב -20 ° C לשימוש בניסויים הבאים.
- צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 9300 XG ובזהירות להסיר את supernatant. Resuspend גלולה הנבגים ב 1 מ"ל של 100 מ"מ טריס-HCl pH 8.0 עבור 1 h כדי לבטל ביוטין "פנויות".
- צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 9300 XG ובזהירות להסיר את supernatant. שטפו את הכדור פעמיים עם 1 מ"ל של PBS סטרילי מחדש להשעות גלולה ב 1 מ"ל של PBS.
- ממיסים 1 מ"ג של streptavidin-AF633 ב 0.5 מ"ל של PBS לבצע פתרון המניות 2 מ"ג / מ"ל. להוסיף 10 μL של 2 מ"ג / מ"ל streptavidin-AF633 לכל 1 מ"ל של השעיה הנבגים דגירה במשך 40 דקות בטמפרטורת החדר על כיסא נדנדה מכוסה בנייר אלומיניום. Streptavidin-AF633 הנותרים ניתן קפוא aliquots לשימוש בניסויים הבאים.
- צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 9300 XG ולהסיר supernatant בזהירות. Resuspend גלולה הנבגים ב 1 מ"ל של PBS ולספור את נבגים באמצעות hemocytometer בבית 1: דילול 1000 (1: 100 ולאחר מכן 01:10). התאם את ריכוז הנבגים כדי 3.6 x 10 6 / מ"ל עם CO 2 תקשורת עצמאית, עוטפים בנייר כסף ולאחסן ב 4 °.
הערה: הנבגים עכשיו מסומן עם AF633 ויהיה המכונים התלקחות נבגים. - אופציונלי: אם גירוי עם נפוחות נבגים נדרש, לאחר ספירת נבגים (שלב 2.9), לדלל נבגים כדי 7.2 x 10 6 / מ"ל ב בסיס שמרים חנקן (YNB) בינוני ומוסיפים 500 μL ההשעיה הנבגים כדי 4.5 בינוני מ"ל YNB בתוך autoclaved 50 מיליליטר Erlenmeyer בקבוק. מכסים ומניחים את הבקבוק בתוך חממה רועדת (200 סל"ד ב 37 מעלות צלזיוס) במשך 6 שעות.
- העבר המדיום לצינור 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 805 XG במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולשטוף פעם PBS. צנטריפוגה שוב גלולה גלולה ב 1 מ"ל CO 2 בינוני עצמאי, נותן 3.6 x 10 6 נבגים / מ"ל.
הערה: נבגי גוש קרוב לאחר שהם להתבטבט ביצוע מדויק לספור קשה, מומלץ לחשב עם גמספרי ounted של נח נבגים בשימוש.
- העבר המדיום לצינור 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 805 XG במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולשטוף פעם PBS. צנטריפוגה שוב גלולה גלולה ב 1 מ"ל CO 2 בינוני עצמאי, נותן 3.6 x 10 6 נבגים / מ"ל.
3. בידוד של נויטרופילים אדם מונוציטים
- צייר 20 מ"ל של דם ורידי ממתנדבים בריאים לשתי צינורות הדם 10 מ"ל המכיל חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA). עבור כל התורם בנפרד, לשפוך דם 20 מ"ל בתוך שפופרת 50 מ"ל ו לדלל עם 15 מ"ל PBS.
- ביסוד דם עם 15 מ"ל של פתרון בידוד הלימפוציטים (צפיפות 1.077 גרם / מ"ל) עם מחט מזרק וברזל. מניחים את המחט בתחתית הצינור בעדינות לכפות פתרון בידוד הלימפוציטים החוצה. צנטריפוגה ב 630 XG במשך 20 דקות ללא בלם והאצה נמוכה.
- כן PBS, מקורר על קרח.
הערה: שלבי 3.4 ו 3.5 חייב להיות מלווה בעת ובעונה אחת כדי ליצור מונוציטים (3.4) ו נויטרופילים (3.5). - באמצעות pastette, לקצור את השכבה PBMC. זוהי השכבה במרכז בין הסרום הצהוב (העליון) ופתרון בידוד הלימפוציטים השקוף השכבה (נמוכה), וולהעביר לתוך צינור 50 מ"ל טרי.
- מלאו את צינור עם PBMC עד 50 מ"ל עם PBS צנטריפוגות קר בבית 582 XG במשך 10 דקות. הסר את supernatant ולשטוף פעמיים עם קר PBS ו resuspend 1 מ"ל של PBS לכל 20 מ"ל של דם התורם השתמשו בתחילה.
- הפוך 01:10 דילולים עבור לספור על ידי הוספת 20 μL של השעיה תא 160 μL של PBS ו 20 μL של trypan כחול. ספירת תאים עם hemocytometer.
- הכן פתרון חיץ על ידי הוספת 26 מ"ל של סרום העובר עגל חום מומת (FCS) ו 2.1 מ"ל של 0.5 M EDTA כדי 500 מ"ל של HBSS. בצנטריפוגה תאים עבור 10 דקות ב 515 XG resuspend ב 40 μL של פתרון חיץ לכל 1 x 10 7 תאים.
- מעבירים את ההשעיה לתא צינור 15 מ"ל ולהוסיף 10 μL של microbeads CD14 לכל 1 x 10 7 תאים, לערבב היטב דגירה במשך 15 דקות ב 4 ° C, והקפד לערבב את צינורות כל 5 דקות.
- שטפו תאים על ידי הוספת 1 מ"ל של תמיסת חיץ לכל 1 x 10 7 תאים ו CENtrifuge ב 515 XG במשך 10 דקות.
- לשאוב supernatant לחלוטין מחדש להשעות עד 1 x 10 8 תאים 500 μL של פתרון חיץ.
- מניחים 1 טור לדגימה על מפריד מגנטי על פי הוראות היצרן. ראשית לשטוף את הטור פעם עם 500 μL של פתרון חיץ.
- פיפטה 500 μL של ההשעיה התא דרך הטור, מחכים בטור לייבוש ולאחר מכן לשטוף ידי חזרה שלוש פעמים זה עם פתרון חיץ.
- מניח צינור 15 מיליליטר חדש מתחת לעמודה ולקחת את העמודה את המפריד המגנטי. ואז לשטוף את התאים מתוך הטור לתוך צינור עם 1 מ"ל של תמיסת חיץ.
- להוסיף 4 מ"ל של תמיסת חיץ צנטריפוגות ב 515 XG במשך 10 דקות, ולאחר מכן מחדש להשעות ב 1 מ"ל של מכון ממוריאל פארק רוזוול (RPMI) בינוני.
- הפוך 01:10 דילולים עבור לספור על ידי הוספת 20 μL של השעיה תא 160 μL של PBS ו 20 μL של trypan כחול. ספירת התאים עםhemocytometer.
- התאם את ריכוז תא 6 x 10 5 / מיליליטר עם RPMI וזרעי 200 μL על צלחת הדמיה מבוססת זכוכית 35 מ"מ. דגירה לילה ב- C ° 37 עם 5% CO 2.
- למחרת, לפני ההדמיה, להסיר את RPMI ולהוסיף 200 μL של מדיום עצמאי 2 CO.
הערה: אלה מונוציטים יכול גם להיות מובחן לתוך תת מקרופאג שונה לפני ההדמיה. אם זוהי טכניקה כדי להיחקר, נקודת התחלה מצוינת הוא הנייר האחרון על ידי Ohradanova-Repic ואח. 1 1.
- לאחר קצירת שכבת PBMC, להסיר את כל בסרום ורוב פתרון הבידוד הלימפוציטים, אבל להיזהר שלא להסיר את הלהקה הלבנה הקטנה על גבי הגלולה האדומה כמו זו תכיל את רוב נויטרופילים.
- הכינו מלאי חיץ 10x hypotonic תמס על ידי הוספת 83 גרם של NH 4 Cl ו- 10 גרם של KHCO 3 ב 1 ליטר של מים סטריליים. חנות ב 4 °ג
- לדלל 10x המניה הזו עם מים סטריליים ולהוסיף אותו הצינורות. ואז, להפוך בזהירות 3 פעמים לדגור קרח למשך 15 דקות.
- צנטריפוגה ב 394 XG במשך 10 דקות ו resuspend במאגר תמוגה hypotonic עבור 10 דקות בקרח.
- צנטריפוגה ב 394 XG ולשטוף פעמיים עם PBS קר. גלולה ב 1 מ"ל של מדיום עצמאי 2 CO לכל תורם.
- הפוך 01:10 דילולים עבור לספור על ידי הוספת 20 μL של השעיה תא 160 μL של PBS ו 20 μL של trypan כחול. ספירת התאים עם hemocytometer.
- עבור cytometry זרימה, ולהתאים את הריכוז כדי 6 x 10 5 / מ"ל ולהוסיף 400 ההשעיה תא μL לצלחת 24-היטב. למיקרוסקופיה, להוסיף 200 μL של אותו השעית התא בצלחת הדמיה מבוססת זכוכית 35 מ"מ.
הערה: הדמיה נויטרופילים או cytometry הזרימה צריכה להיות יזם מיד בשל נטייתן לעבור אפופטוזיס אם נותר unstimulated. אם זה לא אפשרי נויטרופילים יש לשמור עלקרח בשימוש בהקדם האפשרי (בתוך אותו היום).
4. Cytometry זרימה
- הוספת 200 μL של 1.2 x 10 6 / מ"ל התלקחות נבגים אל התאים בצלחת 24-היטב, ולאחר מכן להוסיף 100 μL של 20 מיקרוגרם / מ"ל voriconazole. הוספת 300 μL של RPMI דגירה במשך 16 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
הערה: Voriconazole מתווסף למנוע נביטת נבגים. - להוסיף 25 μL של פתרון המניות 1 מ"מ Calcofluor-לבן היטב כל ריכוז סופי של 25 מיקרומטר ו דגירה במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
- צנטריפוגה ב 582 XG במשך 10 דקות. הסר את supernatant ולשטוף פעמיים עם PBS.
- כדי לקצור תאים חסיד (מונוציטים), להוסיף 1 מ"ל של PBS עם 3 מ"מ EDTA לכל היטב דגירה במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. לשטוף בעדינות תאים מההצלחה ידי pipetting ולאסוף תאי צינור.
- לשטוף פעם FACS החוצץ (נסיוב עגל עוברי 2% ל PBS), ולאחר מכן להשעות ב FACS חוצץ לניתוח FACS.
- לניתוח FACS, הראשון להתאים את הפרמטרים פיצוי של זרימת cytometer ולהגדיר שערים חיובי באמצעות צינורות פיצוי חד צבעוניים, כולל נבגים ללא צבע: dsRed + נבגים, AF633 + נבגים, וכן נבגים לבן + Calcofluor (כפי שנוצר ב 4.2).
- שער נקבע נבגים חופשיים מבוסס על קדימה ועל פיזור צד באמצעות נבגים ללא צבע. גדר תא שער על קדימה פיזור בצד ידי למעט שער הנבגים בחינם.
- לנתח צינור מדגם ידי הקלטת 10,000 אירועים.
הערה: תאים הקשורים נבגים חיים יהיה DsRed + ו AF633 +. תאים הקשורים נבגים מתים יהיו AF633 + בלבד. תאים עוברים אורח שלא עוסקים נבגים יהיה dsRed- ו AF633-. אוכלוסיות התאים-עוסקים הנבגים מנותחים נוסף עבור מכתים Calcofluor הלבן בערוץ הכחול פסיפיק. נבגים שנותרו מחוץ לתאים יהיה + לבן Calcofluor, וכן נבגים כי כבר הפנימו יהיוCalcofluor לבן-.
5. תא חי מיקרוסקופי וידאו
הערה: הבחירה של מיקרוסקופ תהיה תלויה מה זמין מקומית, אבל הגדרת מיקרוסקופ תצטרך לכלול בשלב הפוך, בתא סביבתי מחומם ל 37 מעלות צלזיוס ומסנני עירור / פליטה מתאימות dsRed (532/561 ננומטר) ו AF633 (633 ננומטר). נבגים אבוקה לא עובדים עם לייזר 488 ננומטר במקום הלייזר 532/561 ננומטר עבור dsRed. בעת ביצוע הניסוי הזה בפעם ראשונה זה, להשתמש בשלט הנבגים ללא צבע וצבע יחיד לבדוק קרינת רקע ולדמם-הדרך בין dsRed וערוצי AF633.
- הפעל את חימום מיקרוסקופ לפני הניסוי ולאפשר מספיק זמן עבור חדר הבקרה הסביבתי לחמם 37 ° C. הזמן שלוקח טמפרטורה בתא לייצב ישתנה להתקנות מיקרוסקופ שונות.
- הפעילו את מיקרוסקופ והמחשב, והנהמודעת תוכנת ההדמיה. הר צלחת הדמיה על הבמה מיקרוסקופ ולהתאים את הפוקוס כדי למצוא את הנויטרופילים או מונוציטים האדם.
- עבור dsRed ו AF633, להגדיר את כוח לייזר כדי 10% וחשיפה הזמן 1 s בהגדרות הרכישה.
- הסר את שקופית ההדמיה ולהוסיף 100 μL של 3 x 10 6 / מיליליטר התלקחות השעית נבגים אל הבארות המתאימות (נפח הכולל 300 μL / טוב). הקלט את הזמן כי התלקחות נבגים מתווספים המנה.
- חזרה לשקופית לשלב ולהתאים רגישות מצלמה עבור dsRed ו AF633 לראות את הנבגים בבירור אבל לא לחשוף יותר מדי את התמונה. גדר רשימת נקודות הבמה אם רכישת ריבוי נקודות נדרשה.
- התחל הדמיה כשכל הנקודות הן בפוקוס, הערוצים מותאמים ואת הזמן ומשך המחזור מוגדר. מחזור זמן ומשך ההדמיה תלוי בשאלות הניסיוניות. המטרה היא לשמור את זמן מחזור קצר ככל האפשר (≤2 דקות) עם 1 דק המאפשר ניתוח מעמיק של uptדינמיקת אקה.
Representative Results
תוצאות נציגים מוצגות בעקבות הפרוטוקול המתואר. איור 1 מדגים וידאו 6 h לחיות תאי נציג עם נויטרופילים אדם נבגי התלקחות. dsRed (אדום) מתבטא הנבגים עצמם בזמן שהם סומנו בתווית עם AF633 (מג'נטה).
איור 2 הוא דימוי מנקודת זמן אחת מסרט דומה כפי המוצג באיור 1, הממחיש את ההבדל בין נבגי התלקחות מתים לחיות. נבגי מלח נבדלים נבגים חיו על ידי לאבד אות dsRed (אדום) שלהם תוך שמירה על AF633 בהיר (מגנט) פלואורסצנטי. נבגי fumigatus א קרובות לשרוד בתוך פגוציטים במשך 6 h. לכן, כדי לכמת באופן יעיל הרג, cytometry זרימה חלקות מוצגים עבור תקופת דגירה 16 h באיור 3. נתונים אלה הושגו עם CE מקרופאג המכתשיתll קו כדוגמה אבל יכול להתבצע עם כל סוג תא. באיור 4 ההגירה הוצג השעה הראשונה של גירוי עבור נויטרופילים אנושי כמו גם המהירות שלהם ותנועה כיוונית. איור 5 מציג את אחוז נויטרופילים ומונוציטים כי יש לבלוע 1, 2, 3 או יותר נבגים בעוד איור 6 מציג את מספר נבגים כי נובטים בתוך העובש.
איור 1: סרט מיקרוסקופיה וידאו Live- תא של נויטרופילים אדם התלקחות נבגים. נויטרופילים בודדו דם אדם זורעים יחד עם נבגי אבוקה ב 2 CO בינוני עצמאי ביחס של 1: 3, בהתאמה. הדמיה יזם ישירות 37 ° C עם מיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב. תמונות נתפסו בבית 1 דקות ו 55 s במרווחים על פני תקופה של 6 h. בר סולם = 10 מיקרומטר.גדלת וידאו מוצג עם ערוצי מופרדים כדי להבהיר את תפקידו של נבגי התלקחות עם DIC בפינה השמאלית העליון, dsRed (אדום), בפינה הימנית העליונה, AF633 (ירוק) בפינה שמאלית התחתונה ואת הווידאו הממוזג בפינה הימנית התחתונה . אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.
איור 2: תמונת נקודה אחת בזמן הוכחת ההבדל בין נבגי התלקחות מתים לחיות. נויטרופילים האדם היו מגורה עם נבגים אבוקה ו צילמו באמצעות מיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב. תמונה צולמה מהסרטים שנוצרו. נבגי מלח נבדלים עובש ידי שאבד dsRed (אדום: למעלה מימין) שלהם אותות תוך שמירת קרינת AF633 שלהם (ירוק: צד שמאל למטה). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: כימות ותיקוף phagocytosis וההרג של נבגי fumigatus א. עכבר המכתשית תאי מקרופאג (MH-S) הודגרו עם נבגים אבוקה בבית 1: יחס 1 עבור 16 h בנוכחות voriconazole. MH-S תאים הקשורים נבגים חיים מוצגים השער האדום (dsRed + AF633 +). MH-S תאים הקשורים נבגים מתים מוצגי השער הכחול (dsRed-AF633 +). צופים מצד תאי MH-S מוצגים שער הזהב. Calcofluor לבן, צבע פלואורסצנטי-חדיר תא הנקשרת דופן התא פטרייתיים, משמש להבחין נבגים תאיים (+ הלבן Calcofluor) מ נבגים תאיים (Calcofluor לבן-). בתור אימות נוספת לשיטה, הוא מגלה כי טיפול 2 מיקרומטר cytochalasin D מעכב ספיגת נבגים ידי תאי MH-S.e.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig3large.jpg">Please לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: הגירה של נויטרופילים האדם מונוציטים נגד fumigatus א נבגים. נויטרופילים בודדו דם אדם זורעים יחד עם נבגי אבוקה ב 2 CO בינוני עצמאי ביחס של 1: 3, בהתאמה. הדמיה יזם ישירות 37 ° C עם מיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב. תמונות נתפסו בבית 1 דקות ו 55 s במרווחים על פני תקופה של 6 שעות. הגירה של כל נויטרופילים אדם בודדים לכל שדה היה ידני אחריהן מעקב באמצעות תוכנת מעקב נגד נח (א) ונפוח (B) נבגים עבור 1 h. נתונים מייצגים 1 מסגרת של תאים עבור כל תנאי מאותו התורם. הגורם המתפתל (C), מדד directioהתנועה הסופית, ומהירות (ד) היו אז לכמת באמצעות אותה תוכנה. ממוצע ± SEM עבור 3 תורמים מוצגים עם 30 תאים לכל תורם מעל 2 ניסויים עצמאיים. *: P <0.05 (מבחן t המתוקן של וולץ). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: Phagocytosis של נבגי א fumigatus ידי נויטרופילים ומונוציטים אנושיים. נויטרופילים ומונוציטים בודדו דם אדם זורעים יחד עם נבגי התלקחות במדיום עצמאי 2 CO ביחס של 1: 3, בהתאמה. הדמיה יזם ישירות 37 ° C עם מיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב. תמונות נתפסו בבית 1 דקות ו 55 s במרווחים על פני תקופה של 6 h. Phagocytosis נמדדה כמות התאים מכיליםing התלקחות נבגים לאחר 4 שעות של גירוי. נתונים מוצגים כממוצע ± SEM מ 3 תורמים 3 פריימים תורמים מעל 2 ניסויים עצמאיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6: עיכוב של נביטה של נבגי א fumigatus ידי נויטרופילים ומונוציטים. נויטרופילים ומונוציטים בודדו דם אדם זורעים יחד עם נבגי התלקחות במדיום עצמאי 2 CO ביחס של 1: 3, בהתאמה. הדמיה יזם ישירות 37 ° C עם מיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב. תמונות נתפסו בבית 1 דקות ו 55 s במרווחים על פני תקופה של 6 שעות. עיכוב של נביטה פטרייתי נבדק על ידי מדידת אחוז הנבגים שיש ניבטיםinated לאחר 2, 4 ו 6 שעות של תרבות שיתוף. נתונים מוצגים כממוצע ± SEM מ 3 תורמים 3 פריימים תורמים מעל 2 ניסויים עצמאיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
שיטה זו מתארת חדשני בשיטה במבחנה ללמוד את הפעילות נגד פטריות של פגוציטים העיקרי אדם נגד fumigatus א באמצעות פלורסנט אספרגילוס Reporter (Flare) נבגים, הדמיה תא חי cytometry הזרימה. מחקרים קודמים הוכיחו את הערך המוסף של שימוש התלקחות נבגים הן in vivo ב זיהום פטרייתי בעכברים ניסיוני בהערכה במבחנה של חסינות נגד פטריות 6, 7. שילוב התלקחות נבגים עם טכניקת הדמיה תא חי הדור הבא זה מאפשר התקנה למדוד כדאיות של נבגים בודדים במהלך אינטראקציות דינמי במבחנה.
השיטה המתוארת יש פוטנציאל לחקור את התפקידים הספציפיים ואת החשיבות של תהליכים תאיים מסוימים של תאי מערכת החיסון על התגובות נגד פטריות שלהם. בנוסף, תגובות נגד פטריות של פגוציטים מחולי סובלים ספציפייםניתן להעריך מוגדר פגמים רכיב בודד במערכת החיסונית שלהם ביתר פירוט. מאוד מוקדמות ראשוניות ניתן ללמוד תגובות נגד פטריות בפירוט רב מעל 6 שעות של הדמיה רציפה. זה מאפשר אפילו הבדלים דקים כדי להתגלות, כגון מהירות של הגירה תָא בַּלעָן לכיוון הפטרייה, שיעורי ההפנמה, הדינמיקה של האירועים קוטל פטריות 12, אשר יהיה undistinguishable בשיטות phagocytosis קונבנציונאלי.
כל סוג תא יכול לשמש בשיטה זו; סוגי התאים המשמשים כאן נבחרו משום פגוציטים אלה מהווים את הקווים הראשונים ושניים של הגנה על דרך הנשימה האנושית נגד fumigatus א 13. מעניין, מאוד הבדלים ברורים ניתן להבחין בין כמה מונוציטים ו נויטרופילים לעסוק עם מנוחת נבגי נפוחות עובש. המונוציטים בקושי להעביר נבגים, בעוד נויטרופילים להציג הרבה פעילות נודדת יותר. mar פלורסנט נוסףKERS כגון סמנים חי-מת על תאי מערכת החיסון יכולה להיכלל assay לספק תובנות הישרדות תָא בַּלעָן הבאים אינטראקציות עם אספרגילוס. יישומים עתידיים פוטנציאליים מעניין לטכנולוגיה זו כוללים את שיתוף התרבות של סוגי תאים המארח שונים, ההשלכות לתגובות נגד פטריות (למשל, מקרופאגים על monolayer אפיתל, תאים דנדריטיים הנגזרות מונוציטים יחד עם נויטרופילים), וכן מדידה בזמן אמת של תגובתי ייצור מיני חמצן או היווצרות מלכודת תאי נויטרופילים בעקבות גירוי עם אספרגילוס.
כמה נקודות צריכות לציין להשתמש בפרוטוקול זה, ובראשונה התקנת המעבדה נדרשת: מיקרוסקופ עם במה הפוכה, בתא סביבתי יציב על 37 מעלות צלזיוס, ואת העירור / מסנני פליטה עבור dsRed (532/561 ננומטר) ו AF633 ( 633 ננומטר). היכולת של מיקרוסקופ כדי לשמור על התאים בפוקוס ולשמור על טבילת השמן (רלוונטי במיוחד במהלך מטררכישת ulti נקודות) יש לעקוב באופן תקופתי בשל משך ההדמיה הארוך. עבור כימות של פעילות קוטלת פטריות cytometry זרימת מתקנים נדרשים. בנוסף, אישורים מוסדיים אתיים ראויים צריכים להיות במקום לעבוד עם תורם בריא ודגימות דם נגזר חולה ופטריות מניפולציות גנטיות. מומלץ מאוד להשתמש בדגימות דם טרי (שימוש באותו יום) כדי להגדיל את כדאיות התא ולשמר פונקציונליות. באופן אידיאלי, בידוד של תאים מבוצע מייד לאחר ציור דגימות דם נויטרופילים הם צלמו מייד לאחר בידוד.
לסיכום, טכניקה הדמיה תא חי הדור הבא להעריך בפעילות נגד פטריות תָא בַּלעָן בפירוט רב נגד fumigatus א מתואר. טכנולוגיה זו יכולה לספק תובנה ייחודית אינטראקציות תא-פטרייתי בודדת גנויות חיסון מולדות מוקדם נגד אספרגילוס.
Disclosures
החוקרים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי MRC ואוניברסיטת אברדין (מרכז MRC עבור מיקולוגיה רפואי) ועל ידי פרס אסטרטגיים קרן Wellcome - אימונולוגיה פטרייתיים מיקולוגיה רפואי (SFB, JMB, JK, AW). תודה מיוחדת ניתנת תמיכה מקרן קלואי. TMH נתמך על ידי מענק מטעם המכון הלאומי לבריאות (NIH, קוד RO1 093,808) ובמרכז הסרטן ממוריאל סלואן קטרינג נתמך על ידי CA008748 P30 מענק NIH. בנוסף, TMH הוא חוקר בפתוגנזה של מחלות זיהומיות הנתמכות על ידי קרן Wellcome בורוז. אנו מבקשים להודות מיקרוסקופית אברדין מתקן היסטולוגיה עבור עזרתם ותמיכתם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Sigma | G6279 | http://www.sigmaaldrich.com |
| T75 flask | Greiner Bio-One | 658 175 | http://www.greinerbioone.com/ |
| PBS | Gibco | 20012-019 | https://www.thermofisher.com/ |
| Tween-80 | Fisher Scientific | 10592955 | https://nl.fishersci.com/ |
| 40 µm filter | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | https://www.thermofisher.com/ |
| 15 mL Falcon tube | Greiner Bio-One | 188 261 | http://www.greinerbioone.com/ |
| 50 mL Falcon tube | Greiner Bio-One | 227 261 | http://www.greinerbioone.com/ |
| MilliQ | Millipore | QGARD00R1 | Nanopure water works similarly. http://www.merckmillipore.com/ |
| Biotin | Molecular Probes | B-6352 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html |
| DMSO | Sigma | D5879 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Streptavidin-AF633 | Molecular Probes | S-21375 | AF633 is the only tested fluorophore so far that remains visible in phagosomes. https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html |
| EDTA blood tubes | Greiner Bio-One | 455036 | Any blood tubes with an anti-coagulating agent should work. http://www.greinerbioone.com/en/start/ |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | http://www3.gehealthcare.com/ |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | SV3008401 | https://www.thermofisher.com/ |
| HBSS | Gibco | 14170112 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html |
| CD14 microbeads | Myltenyi Biotec | 130-050-201 | Other monocyte isolation methods can be used as well, we prefer this method as it gives a consistent high purity of monocytes without being labor intensive. http://www.miltenyibiotec.com/en/ |
| MS Columns | Myltenyi Biotec | 130-042-201 | See comment at CD14 microbeads. http://www.miltenyibiotec.com/en/ |
| RPMI + Glutamax | Gibco | 72400-021 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html |
| CO2 independent medium | Thermo Fisher Scientific | 18045054 | Necessary if there is not sufficient CO2 exchange during imaging. https://www.thermofisher.com/uk/en/home |
| µ-slide 8 well glass bottom | Ibidi | 80827 | This is the imaging dish that we use, however any glass imaging dish of proper size should work. http://ibidi.com/ |
| UltraVIEW VoX 3D Live Cell Imaging System | Perkin Elmer | L7267000 | Includes volocity software for acquisition and analysis. http://www.perkinelmer.com/ |
| Calcofluor white | Sigma | 18909 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Voriconazole | Sigma | PZ0005 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| BD LSRII | BD Biosciences | Flowcytometer used. https://www.bdbiosciences.com/ |
References
- Kosmidis, C., Denning, D. W. The clinical spectrum of pulmonary aspergillosis. Thorax. 70 (3), 270-277 (2015).
- Warris, A. The biology of pulmonary Aspergillus infections. J Infect. 69 (Suppl 1), S36-S41 (2014).
- Henriet, S. S., et al. Human leukocytes kill Aspergillus nidulans by reactive oxygen species-independent mechanisms. Infect Immun. 79 (2), 767-773 (2010).
- Sheppard, D. C., et al. Comparison of three methodologies for the determination of pulmonary fungal burden in experimental murine aspergillosis. Clin Microbiol Infect. 12 (4), 376-380 (2006).
- Lewis, L. E., Bain, J. M., Okai, B., Gow, N. A. R., Erwig, L. P. Live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis. J Vis Exp. (71), e50196 (2013).
- Heung, L. J., Jhingran, A., Hohl, T. M. Deploying FLAREs to Visualize Functional Outcomes of Host-Pathogen Encounters. PLoS Pathog. 11 (7), e1004912 (2015).
- Jhingran, A., et al. Tracing conidial fate and measuring host cell antifungal activity using a reporter of microbial viability in the lung. Cell Rep. 2 (6), 1762-1773 (2012).
- Espinosa, V., et al. Inflammatory monocytes orchestrate innate antifungal immunity in the lung. PLoS Pathog. 10 (2), e1003940 (2014).
- English, D., Andersen, B. R. Single step separation of red blood cells, granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradient of ficoll hypaque. J Immunol Met. 5 (3), 249-252 (1974).
- Shimizu, K., Keller, N. P. Genetic involvement of a cAMP-dependent protein kinase in a G protein signaling pathway regulating morphological and chemical transitions in Aspergillus nidulans. Genetics. 157 (2), 591-600 (2001).
- Ohradanova-Repic, A., Machacek, C., Fischer, M. B., Stockinger, H. Differentiation of human monocytes and derived subsets of macrophages and dendritic cells by the HLDA10 monoclonal antibody panel. Clin Transl Immunology. 5 (1), e55 (2016).
- Lewis, L. E., et al. Stage specific assessment of Candida albicans phagocytosis by macrophages identifies cell wall composition and morphogenesis as key determinants. PLoS Pathog. 8 (3), e1002578 (2012).
- Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes. J Clin Invest. 69 (3), 617-631 (1982).
