Summary
Здесь мы опишем протокол для оценки противогрибковой активности первичных иммунных клеток человека в режиме реального времени с использованием флуоресцентного Aspergillus репортера конидии в сочетании с живой клеткой видеомикроскопией и проточной цитометрией. Сгенерированные данные дают представление о хозяине клеточно Aspergillus взаимодействий , таких как фунгицидная активность, фагоцитоз, миграции клеток и ингибирование роста грибов.
Abstract
Аспергилл дымящийся является оппортунистическим грибковым возбудителем инвазивных инфекций у иммунодефицитов с высокой летальностью. Исследования исследования иммунологических реакций против А. fumigatus было ограничено отсутствием последовательных и надежных тестов для измерения противогрибковой активности специфических иммунных клеток в пробирке. Новый метод описан для оценки противогрибковой активности первичных моноцитов и нейтрофилов у людей - доноров против A. fumigatus с использованием флуоресцентного Aspergillus репортерной (FLARE) конидии. Эти конидии содержат генетически кодируемый репортер DsRed, который экспрессируется живыми FLARE конидий и внешне меченный Alexa Fluor 633, который является устойчивым к деградации в пределах фаголизосомы, что позволяет проводить различие между живой и мертвой А. fumigatus конидиями. Видео микроскопии и проточной цитометрии впоследствии используется для визуализации взаимодействуютиона между конидий и врожденных иммунных клеток, оценка фунгицидной активностью в то же время обеспечивая большое количество информации о миграции фагоцитов, фагоцитоз и ингибирования грибкового роста. Этот новый метод уже представил новые захватывающие идеи в хост-патоген взаимодействия первичных иммунных клеток против A. fumigatus. Важно отметить установку лаборатории, необходимые для выполнения этого анализа, в том числе необходимые микроскопии и проточной цитометрии объектов, а также способность работать с кровью человека-донора и генетически измененных грибов. Тем не менее, этот анализ может генерировать большие объемы данных и может выявить подробное понимание противогрибкового ответ. Этот протокол был успешно использован для изучения хозяин-патоген взаимодействия первичных иммунных клеток против A. fumigatus.
Важно отметить установку лабораторного, необходимое для выполнения этого анализа, в том числе необходимой микроскопии и проточной цитометрии Facilities, а также способность работать с кровью человека-донора и генетически измененных грибов. Тем не менее, этот анализ может генерировать большие объемы данных и может выявить подробное понимание противогрибкового ответ. Этот протокол был успешно использован для изучения хозяин-патоген взаимодействия первичных иммунных клеток против A. fumigatus.
Introduction
Аспергилл дымящийся является оппортунистическим грибковым патогеном и наиболее распространенной причиной грибковой инвазивных легочных инфекций в ослабленном иммунитете хост 1, 2. Понимание того, как клетки иммунной системы хозяина распознавать и элиминировать Aspergillus является важной областью грибкового исследования, однако, имеющиеся в настоящее время фунгицидных анализы имеют существенные ограничения. Обычно используемые способы измерения фунгицидной активности , включают колориметрические анализы и определение колониеобразующих единиц 3, 4. Однако такие методы дают информацию о грибковой жизнеспособности в одной точке времени, а не просмотр динамического взаимодействия между хостом и патогеном. Соответственно, эти методы не могут принимать во внимание, был ли грибок был убит или просто (временно) ограничены в росте или метаболической активности. Мы разработали метод, способный наблюдающей fungiciДаль деятельность непосредственно и одновременно захватывая подробную информацию о фагоцитозе, миграции фагоцитов и ингибирование роста грибов.
Ранее протокол был опубликован с помощью визуализации в режиме реального времени в качестве средства для измерения фагоцитоз Candida Albicans с помощью клеточной линии мыши макрофагальной 5. Эта концепция в настоящее время разработана для решения дополнительно разрыва в знаниях в нашем понимании Aspergillus взаимодействия с иммунными клетками с использованием флуоресцентного Aspergillus репортерного (FLARE) конидии 6, 7, 8. Эти конидии выражают красный флуорофор (DsRed) и помечены со вторым флуорофоры (Alexa Fluor 633). После того, как FLARE конидии убита, он прекращает производить Dsred и остальной Dsred затухает, в то время как AF633 остается флуоресцентным и связанным с конидиями. Это создает четкое различие между живой и мертвой фуNGAL клетки во время получения изображений живых клеток и проточная цитометрии, а также позволяет отслеживать судьбы отдельных конидий после их взаимодействия с иммунными клетками.
Описанные анализы обеспечивают эффективный метод визуализации взаимодействия между принимающей иммунными клетками и Aspergillus , и будут иметь существенное значение в разгадке пути клеточной сигнализации , ответственный за противогрибковые эффекторные механизмы в врожденных иммунных клетках. Другие приложения включают визуализации , как изменения в росте Aspergillus, такие как переход от покоя к набухшим конидиям, или из набухших конидий гифа, влияют на распознавание и фагоцитарной функцию.
Следующий протокол подробно описывает, как получить человеческие моноциты и нейтрофилы; как подготовить FLARE конидии; и как захватить их ответы с видеомикроскопии и проточной цитометрии. Хотя использование иммунных клеток человека, выделенные из донорской крови, описано здесь, этометодика доказала одинаково эффективна с использованием различных популяций мышиных клеток.
Protocol
Протокол для получения нейтрофилов и мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) основан на ранее опубликованных методов 9. Использование образцов крови здоровых добровольцев было одобрено человеком исследований комитета по этике Университета Абердина. Перед началом убедитесь, что все этические утверждения в месте забора крови у здоровых добровольцев и / или пациентов с целью описываемого эксперимента. Держите клетки на льду, где это возможно, чтобы увеличить их выживание.
1. A. fumigatus Культура и условия
- Подготовка к глюкозе минимальной агаризованной среды , как описано 10.
- Настройка средств массовой информации до рН 6,5 с помощью 1 М NaOH и автоклаве при 120 ° С в течение 20 мин.
- Дать остыть до 65 ° С.
- Работа в стерильном капоте потока, заливают 30 мл охлажденных сред в T75 колбу и дать остыть с горловиной колбы покоящегося на 25 мл пипетку сreate агар склон.
- Серия из штамма A. fumigatus DsRed Af293- на агар и инкубируют в течение 7 дней при 37 ° С + 5% CO 2. Две колбы дадут приблизительно 10 9 конидий в 5 мл фосфатно-буферном солевом растворе (PBS) , предварительно биотинилирования.
2. А. fumigatus Маркировка и подготовка
Примечание: При выполнении этого теста в первый раз, подготовить родителей Af293- А. fumigatus штамма. Взять образцы обоих штаммов в микроцентрифужных пробирках и маркировать только один из каждого штамма, как описано ниже. Это позволит иметь один контрольные конидии, без цвета и конидий с одним цветом, либо Dsred или AF633, чтобы проверить установку и оборудование.
- Урожай конидии А. fumigatus путем погружения культуры с 30 мл PBS + 0,05% Твин-80. Фильтр полученной суспензии через сито 40 мкм клетки в трубку 50 мл, чтобы удалить фрагменты гиф.
- Сentrifuge при 805 х г в течение 10 мин, удалить супернатант и мыть один раз в 20 мл стерильной PBS. Бассейн конидии из двух пластин одного и того же штамма во время этапа стирки.
- После стадии промывки, ресуспендирует осадок в 5 мл PBS и перенос 1 мл аликвоты суспензии конидий в микроцентрифужные пробирки. 1 мл суспензии каждого штамма, как правило, достаточно для получения изображений живых клеток. Заверните оставшиеся аликвоты в фольгу и хранят при температуре 4 ° С.
- Центрифуга аликвоты суспензии конидий на 9300 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре и тщательно удалить надосадочную жидкость. Ресуспендируют осадок в конидий 1 мл 0,05 М NaHCO 3 рН 8,3.
- Подготовьте 10 мг биотина / 200 мкл диметилсульфоксиде (ДМСО) маточного раствора путем восстановления 25 мг биотина в 500 мкл ДМСО. Добавьте 10 мкл ДМСО / биотин маточного раствора в микроцентрифужных трубки, крышку в алюминиевую фольгу и инкубируют в течение 2 часов на качалке при 4 ° С.
- Алиготе остаток биотина / ДМСО SOLUTIOп и замерзает при -20 ° C для использования в последующих экспериментах.
- Центрифуга течение 10 мин при 9300 х г и осторожно удалить супернатант. Ресуспендирует осадок в конидиях 1 мл 100 мМ Трис-HCl, рН 8,0 в течение 1 ч, чтобы деактивировать свободно плавающий биотин.
- Центрифуга течение 10 мин при 9300 х г и осторожно удалить супернатант. Промывают осадок дважды 1 мл стерильной PBS и ресуспендируют осадок в 1 мл PBS.
- Растворите 1 мг стрептавидина-AF633 в 0,5 мл PBS, чтобы сделать 2 мг / мл маточного раствора. Добавить 10 мкл 2 мг / мл стрептавидин-AF633 на 1 мл суспензии конидий и инкубируют в течение 40 мин при комнатной температуре на качалке, покрытой алюминиевой фольгой. Остальные стрептавидины-AF633 может быть заморожен в аликвотах для использования в последующих экспериментах.
- Центрифуга течение 10 мин при 9300 х г и осторожно удалить надосадочную жидкость. Ресуспендируют осадок конидий в 1 мл PBS и считать конидии с использованием гемоцитометра при 1: 1000 разбавлении (1: 100, а затем 1:10), Регулировка конидий концентрации до 3,6 × 10 6 / мл с помощью СО 2 независимых средств массовой информации, завернуть в фольгу и хранить при температуре 4 ° С.
Примечание: Конидии теперь помечены AF633 и будет называться FLARE конидий. - Необязательно: Если стимуляция опухшие конидий требуется, после подсчета конидии (этап 2.9), разбавленных конидии до 7,2 × 10 6 / мл в базе дрожжевого азота (YNB) среду и добавляют 500 мкл конидий суспензии до 4,5 мл YNB среды в автоклавируют 50 мл колбу Эрленмейера. Накройте и колбу помещают в инкубатор встряхивания (200 оборотов в минуту при 37 ° C) в течение 6 ч.
- Передача среды в трубке 15 мл. Центрифуга при 805 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре и мыть один раз в PBS. Центрифуга снова и ресуспендируют осадок в 1 мл CO 2 независимых среды, что дает 3,6 × 10 6 конидий / мл.
Примечание: Конидии часто комок после того, как они становятся раздутыми сделать точный подсчет трудно, рекомендуется вычислять с сounted количество отдыха конидии используемой.
- Передача среды в трубке 15 мл. Центрифуга при 805 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре и мыть один раз в PBS. Центрифуга снова и ресуспендируют осадок в 1 мл CO 2 независимых среды, что дает 3,6 × 10 6 конидий / мл.
3. Выделение человека нейтрофилы и моноциты
- Draw 20 мл венозной крови от здоровых добровольцев на две пробирки 10 мл крови, содержащих этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА). Для каждого донора в отдельности, заливают 20 мл крови в пробирку 50 мл и разбавляют 15 мл PBS.
- Underlay крови с 15 мл раствора изоляции лимфоцитов (плотность 1,077 г / мл) с помощью шприца и игл железа. Поместите иглу в нижней части трубы и осторожно заставить раствор изоляции из лимфоцитов. Центрифуга при 630 х г в течение 20 мин, без тормозов и низким ускорением.
- Приготовьте PBS, охлажденное на льду.
Примечание: Шаги 3.4 и 3.5 должны соблюдаться одновременно генерировать моноциты (3.4) и нейтрофилов (3.5). - Использование pastette, собрать слой РВМС. Это слой в центре между желтой сывороткой (верхней) и раствором прозрачной изоляции лимфоцитов (нижним) слоем, иперенести в свежую пробирку 50 мл.
- Заполните трубку с РВМСОМ до 50 мл с холодным PBS и центрифуги при 582 мкг в течение 10 мин. Удалить супернатант и дважды промывают холодным PBS и ресуспендируют в 1 мл PBS на 20 мл донорской крови, используемых на начальном этапе.
- Сделать 1:10 разведений для подсчета путем добавления 20 мкл клеточной суспензии в 160 мкл PBS и 20 мкл трипанового синего. Граф клеток с гемоцитометром.
- Подготовка буферного раствора путем добавления 26 мл инактивированной нагреванием фетальной телячьей сыворотки (FCS) и 2,1 мл 0,5 М ЭДТА до 500 мл HBSS. Центрифуга клетки в течение 10 мин при 515 мкг и ресуспендируют в 40 мкл буферного раствора на 1 × 10 7 клеток.
- Передача клеточной суспензии в 15 мл пробирку и добавляют 10 мкл CD14 микрошариков на 1 × 10 7 клеток, хорошо перемешать и инкубировать в течение 15 мин при 4 ° С, убедившись , чтобы смешать трубки через каждые 5 мин.
- Вымойте клеток путем добавления 1 мл буферного раствора на 1 × 10 7 клеток и CENtrifuge при 515 мкг в течение 10 мин.
- Отберите супернатант полностью и ресуспендируют до 1 × 10 8 клеток в 500 мкл буферного раствора.
- Поместите 1 столбец за образец на магнитном сепараторе в соответствии с инструкциями изготовителя. Во-первых промывки колонки один раз с 500 мкл буферного раствора.
- Пипетки 500 мкл клеточной суспензии через колонку, подождите колонку, чтобы высушить и затем промыть, повторяя это три раза буферным раствором.
- Поместите новый 15 мл трубку под колонку и принять колонку от магнитного сепаратора. Затем промыть клетки из колонки в пробирку с 1 мл буферного раствора.
- Добавить 4 мл буферного раствора и центрифугируют при 515 х г в течение 10 мин, а затем ресуспендируют в 1 мл института Roswell Park Memorial (RPMI) среды.
- Сделать 1:10 разведений для подсчета путем добавления 20 мкл клеточной суспензии в 160 мкл PBS и 20 мкл трипанового синего. Количество клеток сгемоцитометр.
- Регулировка концентрации клеток до 6 × 10 5 / мл RPMI с и семян 200 мкл на чашку 35 мм изображения на основе стекла. Инкубируют в течение ночи при 37 ° С с 5% CO 2.
- На следующий день, до обработки изображений, удалить RPMI и добавляют 200 мкл СО 2 независимой среды.
Примечание: Эти моноциты также могут быть дифференцированы в различные макрофаги подмножества до визуализации. Если это метод , чтобы изучить, является отличной отправной точкой является недавней работе Ohradanova-Repic и др. 1 1.
- После уборки слоя РВМСА, удалить все сыворотки и большая часть раствора изоляции лимфоцитов, но быть осторожными, чтобы не удалить маленькую белую полосу на верхней часть красной таблетки, так как это будет содержать большую часть нейтрофилов.
- Подготовка 10x гипотонического буфера для лизиса запаса добавлением 83 г NH 4 Cl и 10 г КНСО 3 в 1 л стерильной воды. Хранить при 4 °C.
- Развести этот запас в 10 раз стерильной водой и добавить его в пробирки. Затем осторожно инвертировать 3 раза и инкубировать на льду в течение 15 мин.
- Центрифуга при 394 мкг в течение 10 мин и ресуспендируют в буфере для лизиса гипотонического в течение 10 мин во льду.
- Центрифуга при 394 мкг и дважды промывают холодным PBS. Ресуспендирует в 1 мл СО 2 независимой среды на донор.
- Сделать 1:10 разведений для подсчета путем добавления 20 мкл клеточной суспензии в 160 мкл PBS и 20 мкл трипанового синего. Граф клеток с гемоцитометром.
- Для проточной цитометрии, регулировать концентрацию до 6 × 10 5 / мл и добавляют суспензию 400 мкл клеток в 24-луночный планшет. Для микроскопии, добавить 200 мкл той же самой клеточной суспензии в чашку формирования изображения 35 мм на основе стекла.
Примечание: визуализации или нейтрофилов проточной цитометрии должно быть начато немедленно из - за их склонность к апоптозу , если оставить нестимулированными. Если это невозможно, нейтрофилы должны храниться налед и использовать как можно скорее (в тот же день).
4. проточной цитометрии
- Добавляют 200 мкл 1,2 × 10 6 / мл FLARE конидий к клеткам в 24-луночного планшета, а затем добавить 100 мкл 20 мкг / мл вориконазола. Добавьте 300 мкл среды RPMI , и инкубируют в течение 16 ч при 37 ° С с 5% CO 2.
Примечание: вориконазол добавляются для предотвращения конидий всхожести. - Добавьте 25 мкл 1 мМ Calcofluor-белого исходного раствора в каждую лунку для конечной концентрации 25 мкМ и инкубируют в течение 10 мин при 37 ° С с 5% CO 2.
- Центрифуга при 582 мкг в течение 10 мин. Удалить супернатант и дважды промывают PBS.
- Для того, чтобы собрать прилипшие клетки (моноциты), добавляют 1 мл PBS с 3 мМ EDTA в каждую лунку и инкубировали в течение 10 мин при 37 ° С с 5% CO 2. Осторожно промыть клетки от пластины с помощью пипетки и собрать клетки в пробирке.
- Промыть один раз в FACS буфере (2% фетальной телячьей сыворотки, чтобы PBS), а затем ресуспендируют в FACS буфере для анализа FACS.
- Для анализа FACS, сначала необходимо настроить параметры компенсации на проточном цитометре и установить положительные ворота используя одноцветные компенсационные трубы, в том числе конидий, без цвета: DsRed + конидий, AF633 + конидий и Calcofluor белых + конидий (сгенерированная, как в 4.2).
- Освобожденные конидии затвор на основе вперед и боковое рассеивание, используя конидию без цвета. Набор клеток ворота по прямой и боковое рассеивание за счет исключения свободного конидий ворота.
- Анализ образца трубки путем записи 10000 событий.
Примечание: Клетки, связанные с живыми конидий будут Dsred + и AF633 +. Клетки, связанные с мертвыми конидиями будут только AF633 +. Клетки Bystander, которые не занимаются конидии будет dsRed- и AF633-. В популяции клеток конидий зацепления дополнительно анализируется для Calcofluor White окрашивания на канале Pacific Blue. Конидии, которые остаются вне клетки будут Calcofluor White + и конидия, которые были усвоены будутCalcofluor Белый-.
5. Живая сотовый видеомикроскопия
Примечание: Выбор микроскопа будет зависеть от того, что доступно локально, но установка микроскопа нужно будет включать в себя этап, инвертированный экологическую камеру, нагретую до 37 ° С и соответствующими фильтрами возбуждения / излучения для DsRed (532/561 нм) и AF633 (633 нм). FLARE конидии не работают с 488 нм лазер вместо этого 532/561 нм лазера для Dsred. При выполнении этого эксперимента для этого впервые, использовать контрольные конидии, без цвета и одного цвета, чтобы проверить на фоновую флуоресценцию и проступание между DsRed и AF633 каналами.
- Включите микроскоп нагреватель до начала эксперимента и обеспечить достаточное время для камеры контроля окружающей среды, чтобы нагреть до 37 ° С. Время, необходимое для температуры камеры для стабилизации будет изменяться для различных установок микроскопа.
- Включите микроскоп и компьютер, и вотобъявления программное обеспечение визуализации. Установите блюдо изображения на предметный столик микроскопа и настроить фокус, чтобы найти человека нейтрофилы или моноциты.
- Для Dsred и AF633, установите мощность лазера до 10% и выдержек времени до 1 с в настройках приобретения.
- Удалить слайд изображения и добавить 100 мкл 3 × 10 6 / мл ПИРОФАКЕЛА суспензии конидий в соответствующие лунки (общий объем 300 мкл / лунку). Запишите время, факельных конидии добавляют к блюду.
- Вернуть слайд на сцену и настроить чувствительность камеры для Dsred и AF633, чтобы ясно видеть конидии, но не передержать изображение. Настройка списка точек этапа, если требуются приобретение многоточечного.
- Начинают визуализации, когда все точки находятся в фокусе, каналы оптимизированы и время цикла и продолжительность устанавливаются. Время цикла и продолжительность визуализации зависит от экспериментального вопроса. Цель состоит в том, чтобы сохранить время цикла как можно более коротким (≤2 мин) с 1 мин позволяет в глубине анализа UPTдинамика. готовит в
Representative Results
Типичные результаты показаны после описанного протокола. Рисунок 1 иллюстрирует типичную 6 ч видео живых клеток с человеческими нейтрофилами и гиперемии конидий. Dsred (красный) выражается сами конидий в то время как они были помечены AF633 (Magenta).
Фиг.2 представляет собой изображение с одной точки времени от аналогичного фильма , как показано на рисунке 1, иллюстрирующий разницу между живой и мертвой FLARE конидий. Мертвые конидии отличаются от живых конидий, теряя их сигнал DsRed (красный), сохраняя при этом ярко-AF633 (пурпурный) флуоресценции. A. fumigatus конидий часто выживают в фагоцитах для более 6 ч. Поэтому, чтобы эффективно убить количественно, проточной цитометрии участки показаны на 16 ч периода инкубации на рисунке 3. Эти данные были получены с альвеолярного макрофага сеLL линия в качестве примера, но может быть выполнена с любым типом клеток. На рисунке 4 показана миграция в первый час стимуляции для нейтрофилов человека, а также их скорости и направленного движения. На фиг.5 показан процент нейтрофилов и моноцитов , которые глотавшие 1, 2, 3 или более конидии , а на рис 6 показывают количество конидий , которые прорастают в гифы.
Рисунок 1: Live-клеточной видеомикроскопия фильм нейтрофилов человека и FLARE конидий. Нейтрофилы были выделены из человеческой крови и высевали совместно с FLARE конидиями в CO 2 , независимой среде при соотношении 1: 3, соответственно. Визуализация инициировали непосредственно при температуре 37 ° C с вращающимся диском конфокальной микроскопией. Изображения были получены с интервалом 1 мин и 55 сек в течение 6 ч. Шкала бар = 10 мкм.Увеличенной в видео показано с каналами, разделенными уточнить роль FLARE конидий с DIC в верхнем левом углу, DsRed (красный) в правом верхнем углу, AF633 (зеленый) в нижнем левом углу, и объединенное видео в правом нижнем углу , Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить это видео.
Рисунок 2: Один момент времени изображение демонстрирует разницу между живой и мертвой FLARE конидий. Человеческие нейтрофилы стимулировали FLARE конидий и визуализируют с помощью вращающегося диска конфокальной микроскопии. Изображение было взято из сгенерированных фильмов. Мертвые конидии отличаются от гиф путем потеряв DsRed (красный: верхний правый) сигнала при сохранении их флуоресценции AF633 (зеленый: внизу слева). Пожалуйста , нажмите здесь просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Количественные и проверка фагоцитоза и уничтожению А. fumigatus конидий. Mouse альвеолярных макрофагов клетки (MH-S), инкубировали с FLARE конидий в соотношении 1: 1 в течение 16 ч в присутствии вориконазола. MH-S клетка, связанная с живыми конидий показана в красных воротах (DsRed + AF633 +). MH-S клетка, связанная с мертвыми конидий показана в синих воротах (DsRed-AF633 +). Bystander MH-S клетки показаны в золотой ворот. Calcofluor Белые, клетка непроницаемой флуоресцентный краситель, который связывается с грибковой клеточной стенкой, используются, чтобы отличить внеклеточные конидии (Calcofluor белый +) из внутриклеточных конидий (Calcofluor Белый-). В качестве дополнительной проверки на метод, было показано, что лечение с 2 мкМ цитохалазина D ингибирует конидии поглощения клеток МН-S.e.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig3large.jpg">Please нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Миграция человека нейтрофилов и моноцитов против А. fumigatus конидий. Нейтрофилы были выделены из человеческой крови и высевали совместно с FLARE конидиями в CO 2 , независимой среде при соотношении 1: 3, соответственно. Визуализация инициировали непосредственно при температуре 37 ° C с вращающимся диском конфокальной микроскопией. Изображения были получены с интервалом 1 мин и 55 сек в течение 6 часов. Миграция всех индивидуальных человеческих нейтрофилов в поле было вручную с помощью отслеживания программного обеспечения против покоя (А) и набухший (B) конидии в течение 1 часа. Данные представляют 1 кадр ячеек для каждого состояния одного и того же донора. Извилистый фактор (С), меры directioNAL движение, и скорость (D) , затем были количественно с использованием того же программного обеспечения. Среднее ± SEM для 3 доноров, показаны с 30 клетками на донор более 2-х независимых экспериментов. *: Р <0,05 (Уэлч исправлены т тест). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: Фагоцитоз А. fumigatus конидий человеческих нейтрофилов и моноцитами. Нейтрофилы и моноциты выдел ли из крови человека и высевали совместно с FLARE конидий в CO 2 , независимой среде при соотношении 1: 3, соответственно. Визуализация инициировали непосредственно при температуре 37 ° C с вращающимся диском конфокальной микроскопией. Изображения были получены с интервалом 1 мин и 55 сек в течение 6 ч. Фагоцитоз измеряли как количество клеток содержатING FLARE конидии через 4 ч после стимуляции. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM от 3 доноров и 3 кадра в донор более 2-х независимых экспериментов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6: Ингибирование прорастания конидий A. fumigatus нейтрофилами и моноцитами. Нейтрофилы и моноциты выдел ли из крови человека и высевали совместно с FLARE конидий в CO 2 , независимой среде при соотношении 1: 3, соответственно. Визуализация инициировали непосредственно при температуре 37 ° C с вращающимся диском конфокальной микроскопией. Изображения были получены с интервалом 1 мин и 55 сек в течение 6 часов. Ингибирование грибного прорастания исследовали путем измерения процентного содержания конидий, которые имели зародышщаемые после 2, 4 и 6 ч совместной культуры. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM от 3 доноров и 3 кадра в донор более 2-х независимых экспериментов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Discussion
Этот метод описывает инновационный метод в пробирке для изучения противогрибковой активности первичных фагоцитов человека против A. fumigatus с использованием флуоресцентного Aspergillus репортерного (FLARE) конидии, изображений живых клеток и проточной цитометрией. Предыдущие исследования продемонстрировали добавленную стоимость использования FLARE конидии как в естественных условиях в мышиной экспериментальной грибковой инфекции и в пробирке оценки противогрибкового иммунитета 6, 7. Сочетание FLARE конидии с этой техникой визуализации клеток следующего поколения живой позволяет задать для измерения жизнеспособности индивидуальных конидий во время динамических взаимодействий в пробирке.
Описанный метод имеет потенциал, чтобы исследовать конкретные роли и важность определенных клеточных процессов иммунных клеток на их противогрибковых ответы. Кроме того, противогрибковые реакции фагоцитов от конкретных пациентов, страдающих отопределенные единичные дефекты компонентов в их иммунной системе могут быть оценены более подробно. Очень ранние и начальные противогрибковые ответы могут быть подробно изучены в течение 6 часов непрерывной съемки. Это позволяет даже тонкие различия , чтобы быть обнаружены, например, скорость миграции фагоцитов к грибку, скорость интернализации, динамика фунгицидных событий 12, которые были бы неотличимо с использованием традиционных методов фагоцитоза.
Любой тип клеток может быть использован с помощью этого метода; типы клеток , используемые здесь , были выбраны потому , что эти фагоциты представляют собой первую и вторую линию обороны в человеческих дыхательных путях против A. fumigatus 13. Интересно, что очень четкие различия можно наблюдать между тем, как моноциты и нейтрофилы заниматься с отдыха и опухшие конидий и гиф. Моноциты едва ли переходить на конидии, в то время как нейтрофилы отображать гораздо больше миграционную активность. Дополнительный флуоресцентный МарKERS , такие как живые умерших маркеры на иммунные клетки может быть включен в анализе , чтобы дать ответ на выживание фагоцитарного следующего взаимодействия с Aspergillus. Интересные возможности применения в будущем для этой технологии включают в себя совместное культивирование различных типов клеток хозяина, последствия для противогрибковых реакций (например, макрофаги на эпителиального монослоя, моноцитов дендритные клетки вместе с нейтрофилами), а также измерения в реальном масштабе времени реактивная производство форм кислорода или нейтрофилы образование внеклеточной ловушки после стимуляции Aspergillus.
Несколько моментов необходимо отметить, чтобы использовать этот протокол, в первую очередь лабораторной установки требуемого: микроскоп с инвертированной стадии, климатическую камеру стабильной при температуре 37 ° C, и возбуждение / фильтры выбросов для DsRed (532/561 нм) и AF633 ( 633 нм). Способность микроскопа, чтобы сохранить клетки в фокусе и сохранить масло погружения (особенно актуально в мUlti-точка сбора) следует периодически контролировать из-за большой продолжительности визуализации. Для количественного определения фунгицидной активности проточной цитометрии средства требуются. Кроме того, соответствующие институциональные и этические допуски должны быть на месте, чтобы работать с здоровым донором и пациентом получены образцами крови и генетически измененными грибами. Настоятельно рекомендуется использовать свежие образцы крови (использование в тот же день), чтобы повысить жизнеспособность клеток и сохранить функциональность. В идеале, изоляция клеток выполняются сразу же после нанесения образцов крови и нейтрофилы изображаются сразу после изоляции.
В заключении следует отметить, метод визуализации живых клеток следующего поколения для оценки в большой противогрибковой активности подробно фагоцитов против A. fumigatus описано. Эта технология может обеспечить уникальное понимание отдельных клеточными грибковыми взаимодействий в ранней врожденной иммунной защите против Aspergillus.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана MRC и Университета Абердина (MRC Центр медицинской микологии) и в Wellcome Trust Стратегическим Award - медицинской микологии грибной Immunology (SFB, JMB, JK, AW). Особую благодарность уделяется поддержке фонда Chloe. TMH поддерживается грантом Национального института здоровья (NIH, код RO1 093808) и Кеттеринг онкологического центра Memorial Sloan поддерживается NIH грант P30 CA008748. Кроме того, ТМЙ является исследователем в патогенезе инфекционных заболеваний при поддержке Wellcome Фонда Burroughs. Мы хотели бы поблагодарить Aberdeen Микроскопия и гистология фонд за их помощь и поддержку.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Sigma | G6279 | http://www.sigmaaldrich.com |
| T75 flask | Greiner Bio-One | 658 175 | http://www.greinerbioone.com/ |
| PBS | Gibco | 20012-019 | https://www.thermofisher.com/ |
| Tween-80 | Fisher Scientific | 10592955 | https://nl.fishersci.com/ |
| 40 µm filter | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | https://www.thermofisher.com/ |
| 15 mL Falcon tube | Greiner Bio-One | 188 261 | http://www.greinerbioone.com/ |
| 50 mL Falcon tube | Greiner Bio-One | 227 261 | http://www.greinerbioone.com/ |
| MilliQ | Millipore | QGARD00R1 | Nanopure water works similarly. http://www.merckmillipore.com/ |
| Biotin | Molecular Probes | B-6352 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html |
| DMSO | Sigma | D5879 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Streptavidin-AF633 | Molecular Probes | S-21375 | AF633 is the only tested fluorophore so far that remains visible in phagosomes. https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html |
| EDTA blood tubes | Greiner Bio-One | 455036 | Any blood tubes with an anti-coagulating agent should work. http://www.greinerbioone.com/en/start/ |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | http://www3.gehealthcare.com/ |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | SV3008401 | https://www.thermofisher.com/ |
| HBSS | Gibco | 14170112 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html |
| CD14 microbeads | Myltenyi Biotec | 130-050-201 | Other monocyte isolation methods can be used as well, we prefer this method as it gives a consistent high purity of monocytes without being labor intensive. http://www.miltenyibiotec.com/en/ |
| MS Columns | Myltenyi Biotec | 130-042-201 | See comment at CD14 microbeads. http://www.miltenyibiotec.com/en/ |
| RPMI + Glutamax | Gibco | 72400-021 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html |
| CO2 independent medium | Thermo Fisher Scientific | 18045054 | Necessary if there is not sufficient CO2 exchange during imaging. https://www.thermofisher.com/uk/en/home |
| µ-slide 8 well glass bottom | Ibidi | 80827 | This is the imaging dish that we use, however any glass imaging dish of proper size should work. http://ibidi.com/ |
| UltraVIEW VoX 3D Live Cell Imaging System | Perkin Elmer | L7267000 | Includes volocity software for acquisition and analysis. http://www.perkinelmer.com/ |
| Calcofluor white | Sigma | 18909 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Voriconazole | Sigma | PZ0005 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| BD LSRII | BD Biosciences | Flowcytometer used. https://www.bdbiosciences.com/ |
References
- Kosmidis, C., Denning, D. W. The clinical spectrum of pulmonary aspergillosis. Thorax. 70 (3), 270-277 (2015).
- Warris, A. The biology of pulmonary Aspergillus infections. J Infect. 69 (Suppl 1), S36-S41 (2014).
- Henriet, S. S., et al. Human leukocytes kill Aspergillus nidulans by reactive oxygen species-independent mechanisms. Infect Immun. 79 (2), 767-773 (2010).
- Sheppard, D. C., et al. Comparison of three methodologies for the determination of pulmonary fungal burden in experimental murine aspergillosis. Clin Microbiol Infect. 12 (4), 376-380 (2006).
- Lewis, L. E., Bain, J. M., Okai, B., Gow, N. A. R., Erwig, L. P. Live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis. J Vis Exp. (71), e50196 (2013).
- Heung, L. J., Jhingran, A., Hohl, T. M. Deploying FLAREs to Visualize Functional Outcomes of Host-Pathogen Encounters. PLoS Pathog. 11 (7), e1004912 (2015).
- Jhingran, A., et al. Tracing conidial fate and measuring host cell antifungal activity using a reporter of microbial viability in the lung. Cell Rep. 2 (6), 1762-1773 (2012).
- Espinosa, V., et al. Inflammatory monocytes orchestrate innate antifungal immunity in the lung. PLoS Pathog. 10 (2), e1003940 (2014).
- English, D., Andersen, B. R. Single step separation of red blood cells, granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradient of ficoll hypaque. J Immunol Met. 5 (3), 249-252 (1974).
- Shimizu, K., Keller, N. P. Genetic involvement of a cAMP-dependent protein kinase in a G protein signaling pathway regulating morphological and chemical transitions in Aspergillus nidulans. Genetics. 157 (2), 591-600 (2001).
- Ohradanova-Repic, A., Machacek, C., Fischer, M. B., Stockinger, H. Differentiation of human monocytes and derived subsets of macrophages and dendritic cells by the HLDA10 monoclonal antibody panel. Clin Transl Immunology. 5 (1), e55 (2016).
- Lewis, L. E., et al. Stage specific assessment of Candida albicans phagocytosis by macrophages identifies cell wall composition and morphogenesis as key determinants. PLoS Pathog. 8 (3), e1002578 (2012).
- Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes. J Clin Invest. 69 (3), 617-631 (1982).
