높은 처리량을 지원 분석은 대식 세포 계대에 대한 약물 효능을 평가하기<em> 결핵균</em
Summary
New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.
Abstract
The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.
Introduction
결핵 (TB)는 40 년 1 항 결핵 화학 요법의 유용성에도 불구하고 심각한 세계 보건 위협 남아있다. 이 비 준수 (2) 환자에 이르게 여러 약물 조합을 사용하여 6 개월의 긴 치료 기간에 대한 요구에 부분적으로 기인한다. 임상 적으로 승인 된 약물의 개발에 성공 3 사실상 존재이다 최근 약제 내성 결핵의 출현은 상기 전계의 문제를 배합했다. 사실, 철저한 항 결핵 약물 개발에도 불구하고, 단 하나의 약물은 FDA가 지난 40 년 4 임상 사용이 승인되었습니다. 따라서, 항 결핵 약물의 새로운 세대는 시급히이 문제를 해결하기 위해 필요하다.
결핵 신약 개발의 핵심 문제는 임상에서 효능을 시험 관내 활성을 가진 화합물에서 성공적으로 전송의 부족이다= "외부 참조"> 5, 6, 7. 처음에, 목표 기반의 접근 방식은 전체 박테리아 세포로 번역하는 데 실패 방지 MTB 약 5,을 선별하기 위해 사용되었다. MTB 세포가 사용되는 경우에도, 그것은 종종 정확하게 생체 8,9 약물 효능을 예측할 수없는 배양액 성장 배양 물을 사용하여 수행된다. 이러한 문제가 인식되었고 MTB 잠복 또는 MTB 대 식세포를 함유하는 약물 스크리닝 분석은 성공적으로 8, 10, 11, 12을 확립하고있다. 그러나, 이들 고급 분석법 약물 비 혈관 폐 병변 발생 관통 장벽 충분한 고려를하고,하지 감염 부위의 괴사 병소이다. 과연심지어 첫번째 줄 TB 약물 리팜피신위한 차선 투여 인해 생체 조직 및 뇌척수액 (CSF)의 불충분으로 문제시 된 세포 MTB (8, 9)에 대해 효능을 감소뿐만 아니라 13 14 15 침투. 의심 할 여지없이 TB 신약 개발 노력을 향상시킬 것이다 초기 리드 개발 과정에서 계정에 이러한 매개 변수를 걸릴 것 같은, 새로운 모델과 분석으로.
이러한 요구를 해결하기 위해, 우리는 최근 MTB 약물 효능 검사 (16)에 대한 저렴하고 신속하고 BSL-2 호환 대안 감염 모델을 설립했다. 생리 학적으로 관련 세포 침투 장벽을 효과적으로 요약 및 대 식세포 계대를 생성 밀도가 생산 큰 식세포 집계 구조 내에서 MTB 포장이 감염 모델, <em> 잠재 MTB를 닮은 변경된 생리 학적 상태와 MTB. 이 감염 모델로부터 유도 MTB 다른 세포 내 감염 모델과 일치하는 결과를 생성 약효를 평가하는 레사 주린 마이크로 타이 세이 (REMA)와 함께 혈중 농도에 비해 높은 CSF 농도를 달성하기 위해 공통 TB 약물의보고 능력을 잘 상관 관계 16.
여기서는 상세히 REMA를 사용 약제 감수성 테스트 식세포 계대 MTB 적합한 생산하는 MTB / 대식 세포 집합체 구조의 생성을 설명한다. 특히,이 감염 시스템을 후보 항 결핵 약물의 스크리닝과의 호환성을 위해 96- 웰 포맷으로 구성 될 수있는 방법을 보여준다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서는 상세히 약효 시험에 적합한 다른 MTB 감염 모델을 설명 하였다. 이 모델은 계정 초기 결핵 약물 개발 과정에서 더 고려를 부여해야 두 가지 주요 요인을 취 약물 침투와 감염시 MTB의 대사 변화에 생리 학적으로 관련 장벽의 존재. 우리는 이전에 우리 감염 모델의 이점을 도시 처리량 호환성 16 감염을 스케일링 가능성을 제시하고 있지만, 여기에서 우리는 96 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Frank Wolschendorf for access to the Cytation 3 automated imaging plate reader. This work was funded in part by NIH grant R01-AI104499 to OK. Parts of the work were performed in the UAB CFAR facilities and by the UAB CFAR Flow Cytometry Core/Joint UAB Flow Cytometry Core, which are funded by NIH/NIAID P30 AI027767 and by NIH 5P30 AR048311.
Materials
| 7H9 | BD Difco | 271310 | Follow manufacturer's recommendations |
| Middlebrook OADC | BD Biosciences | 212351 | |
| Tyloxapol | Sigma | T8761 | Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma | P5710 | Prepare 24 mg/ml stock solution in H2O; filter sterilize |
| L-leucine | MP Biomedicals | 194694 | Prepare 50 mg/ml stock solution in H2O; filter sterilize |
| Hygromycin B | EMD Millipore | 400051 | Prepare 200 mg/ml stock solution in H2O |
| Nalgene Square PETG media bottle | Thermo Fisher | 2019-0030 | |
| RPMI 1640 media | Hyclone | SH30027.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S12450H | |
| L-glutamine | Corning | MT25005CI | |
| HEPES | Hyclone | SH30237.01 | |
| Cytation 3 plate reader | Biotek | Interchangable with any fluorescent plate reader and microscope | |
| Gen5 Software | Biotek | Recording and analysis of rezasurin coversion | |
| Rifampicin | Fisher Scientific | BP2679250 | Prepare 10 mg/ml stock solution in H2O |
| Moxifloxacin Hydrochloride | Acros Organics | 457960010 | Prepare 10 mg/ml stock solution in H2O |
| Resazurin Sodium Salt | Sigma | R7017 | Prepare 800 μg/mL stock solution in H2O; filter sterilize |
| Tween-80 | Fisher Scientific | T164500 | Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize |
References
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