Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

En hög kapacitet Kompatibel analys för att utvärdera läkemedlets effektivitet mot makrofag passe doi: 10.3791/55453 Published: March 24, 2017

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tuberkulos (tbc) är fortfarande ett allvarligt globalt hälsohot trots att det finns anti-TB kemoterapiregimer i över 40 år 1. Detta beror delvis på kravet på långa behandlingstider över 6 månader med hjälp av flera läkemedelskombinationer, vilket leder till patienten inte följs 2. Uppkomsten av läkemedelsresistenta tbc under de senaste åren har förvärras ytterligare problem i ett område där en framgångsrik utveckling av kliniskt godkända läkemedel är så gott som obefintlig 3. Faktum är att trots omfattande anti-TB läkemedelsutveckling har bara ett enda läkemedel varit FDA godkänt för klinisk användning under de senaste 40 åren 4. Således är nya generationer av anti-TB-droger akut behov att lösa detta problem.

Ett centralt problem i TB läkemedelsutveckling är bristen på framgångsrik överföring från föreningar med aktivitet in vitro för effekt i klinisk miljö= "xref"> 5, 6, 7. Inledningsvis var mål baserade metoder som används för att screena för anti-Mtb droger 5, som misslyckades med att översätta till hela bakterieceller. Även när Mtb celler används, är det ofta utförs med användning av buljong odlade kulturer, vilka inte exakt förutsäger läkemedelseffektivitet in vivo 8, 9. Dessa problem har erkänts och drogscreeningsanalyser mot makrofager innehållande Mtb eller latent Mtb har framgångsrikt etablerat 8, 10, 11, 12. Men inte ens dessa mer avancerade analyser inte tillräcklig hänsyn till penetrations hinder som droger möter i de icke-vaskulariserade lungskador, och i den nekrotiska härdar vid infektionsstället. Verkligen, Även för första linjens TB läkemedel rifampicin har suboptimal dosering ifrågasatts på grund av otillräcklig in vivo vävnad och cerebrospinalvätska (CSF) penetration 13, 14, 15 samt minskad effekt mot intracellulära Mtb 8, 9. Som sådan, nya modeller och analyser som skulle ta hänsyn till dessa parametrar under tidig ledning utvecklingsprocessen skulle utan tvekan förbättra TB läkemedelsforskning insatser.

För att lösa detta behov, vi nyligen etablerat en billig, snabb, och BSL-2 kompatibla alternativ infektionsmodell för Mtb läkemedlets effektivitet testning 16. Denna infektion modell produceras tätt packade Mtb inom stora makrofager aggregerade strukturer, som sammanfattat fysiologiskt relevanta cellpenetrationsbarriärer och genererade makrofag-passe Mtb. Mtb härrör från denna infektionsmodell kombinerades med resazurin mikro-analys (REMA) för att utvärdera läkemedlets effektivitet, vilket gav resultat som överensstämmer med andra intracellulära infektionsmodeller och korrelerade väl med den rapporterade förmågan hos gemensamma TB-droger för att uppnå hög CSF koncentrationer i förhållande till serumkoncentrationer 16.

Här beskriver vi i detalj generering av MTB / makrofag aggregerade strukturer för att producera makrofag-passe Mtb lämplig för drogresistensbestämning med hjälp av REMA. Framför allt visar vi hur denna infektion system skulle kunna anpassas till en 96-brunnsformat för kompatibilitet med throughput screening av kandidat anti-TB-droger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

OBS: Som M. tuberculosis mc 2 6206 är en icke-virulent stam 17, 18, kan allt arbete i detta protokoll utföras i en biosäkerhetsnivå 2 faciliteten (BSL-2).

1. odlingsbetingelser för grönt fluorescerande protein uttrycker M. tuberculosis mc 2 6206 (Mtb -GFP)

OBS: M. tuberculosis H37Rv härrör auxotrof stam mc 2 6206 (Δ panCD, Δ leuCD) transformerad med GFP-uttryckande plasmiden pMN437 används i hela detta protokoll 16. Det är möjligt att ersätta den Mtb -GFP stam med icke- GFP-uttryckande vildtyp-stam för att möjliggöra enklare tillgänglighet av stammen för forskare. Emellertid är GFP uttryck önskvärt att möjliggöra visuell bekräftelse av fagocytos och bildandet av MTB / makrofager aggregat. för long långtidsförvaring var Mtb -GFP frystes vid -80 ° C i komplett 7H9 media (som beskrivs i steg 1,1) kompletterat med 20% glycerol.

  1. Förbereda komplett Mtb -GFP media (7H9-C) genom att komplettera 7H9-medium med 10% Middlebrook OADC, 0,02% tyloxapol, 24 mikrogram / ml D-pantotensyra, 50 | ig / ml L-leucin och 50 mikrogram / ml Hygromycin B.
  2. Tina en flaska med Mtb -GFP och lägga till 10 ml 7H9-C i en 30 ml fyrkantig botten PETG kolv.
  3. Inkubera vid 37 ° C på en roterande skakanordning (50 varv per minut). Ta optiska densitetsmätningar (OD 600) med några dagar tills OD 600 når 1,0 (ca 5-8 dagar).
  4. Späd och passage kulturen som behövs för att upprätthålla en OD 600 mellan 0,2-1,0.
  5. För infektion, använda en etablerad kultur av Mtb -GFP inom den logaritmiska tillväxtfasen (OD 600 av 0,6-1). För att undvika klumpiga kulturer, Sonikera Mtb odlingskolv i ett vattenbad (130 W, 3 x 5 s pulser) ONCe eller två gånger i veckan

2. odlingsbetingelser för THP-1-celler

  1. Förbereda komplett THP-1-cellmedium (RPMI-C) genom att komplettera RPMI 1640-medium med 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum, 2 mM L-glutamin och 10 mM HEPES.
  2. Inkubera cellerna i en T-75 kolv vid 37 ° C i en fuktad atmosfär av 5% CO2.
  3. Räkna celler med användning av en hemocytometer eller flödescytometri varannan dag och upprätthålla THP-1-celler med en täthet mellan 0,1 till 0600000 per ml.

3. Infektion protokoll för att generera Mtb / makrofag Samman Structures

  1. THP-1 cellberedning (per 96-brunnars platta)
    1. Centrifugera 7 x 10 6 THP-1-celler vid 250 xg under 5 min. Återsuspendera i 7 ml RPMI-C.
  2. Mtb -GFP beredning
    1. Centrifugera 2,8 x 10 8 Mtb -GFP vid 3200 xg under 5 min i en swinging-bucket centrifug usjunga en omvandling av OD 600 1,0 = 3 x 10 8 bakterier / ml.
    2. Tvätta en gång med RPMI-C och centrifugera som i steg 3.2.1.
    3. Återsuspendera i 7 ml RPMI-C och vortexa i 10 s.
  3. Infektion
    OBS: Se figur 1 för mall.
    1. Bered en 96-brunnsplatta genom tillsats av 200 mikroliter av sterilt vatten i rader A och H och kolumner 1 och 12 för en vatten fälg för att förhindra avdunstning av odlingsmedium.
    2. Tillsätt 200 mikroliter RPMI-C kolumn 2 (B2 till G2) för bakgrunden kontroll (Blank).
    3. Att infektera, lägga till Mtb -GFP suspension (steg 3,2) till THP-1 cellsuspension (steg 3,1) och blanda väl genom att pipettera. Den slutliga THP-1 celltätheten är 5 x 10 5 per ml och motsvarande infektions är 40.
    4. Häll THP-1 / Mtb -GFP suspension in i en 25 ml reservoar.
    5. Tillsätt 200 mikroliter av THP-1 / Mtb -GFP fjädring på alla återstående 96-brunnar (B3 genom G11) usinga multikanalpipett.
      OBS: Om man arbetar med multipla 96-brunnsplattor, regelbundet återsuspendera den återstående THP-1 / Mtb suspension i behållaren för att säkerställa en jämn blandning sätts till varje brunn.
    6. Inkubera vid 37 ° C med 5% CO2 under 7-10 dagar.
    7. Ändra media varje 2 dagar genom att långsamt ta bort 100 mikroliter bringade media från toppen av varje brunn och försiktigt tillsätta 100 mikroliter förvärmda RPMI-C med användning av en flerkanalig pipett. Do not resuspendera brunnar och störa de Mtb / makrofag aggregat på botten av brunnarna.
    8. Visuellt undersöka brunnarna genom fluorescensmikroskopi (4-10X mål) dagligen, tagit del av storleken på MTB / makrofager aggregat. Vid dag 7-10, bör MTB / makrofager aggregat vara tillräckligt stor (se Figur 2 för referens) för att fortsätta för läkemedlets effektivitet testning (avsnitt 4).
    9. Om så önskas, ta bilder av de 96-brunnarna med en automatisk cellavbildningssystem monteratmed ljusa fält och GFP filter sätter att dokumentera Mtb / makrofager aggregatbildning.
      OBS: Om användarna inte har tillgång till en automatiserad bildsystem, kan bilder av representativa brunnar tas med hjälp av något lämpligt mikroskop med GFP och ljusa fältkapacitet.

4. Tillväxt inhibitionsanalys för att bedöma läkemedlets effektivitet mot Mtb Härstammar från MTB / Macrophage Aggregates

  1. Beredning läkemedel (tredubbla förutsättningar för två läkemedel)
    OBS: Se figur 1A för mall.
    1. I en separat 96-brunnar, tillsätt 125 | il av 7H9-C media till B2 genom att G10.
    2. Förbered två läkemedel vid dubbla den högsta önskade slutkoncentrationen i 1 ml 7H9-C för att ta hänsyn till utspädningen i steg 4.2.4.
    3. Tillsätt 250 mikroliter av varje läkemedel till brunnar B11-C11-D11 och E11-F11-G11, respektive för trippelbehandlingar.
    4. Med hjälp av en flerkanals pipett, seriellt dilute försöksläkemedlen två-faldigt genom att flytta 125 mikroliter från B11-G11 i B10-G10. Blanda genom att pipettera 5 gånger vid varje steg.
    5. Fortsätt att flytta 125 mikroliter från kolumn till kolumn (höger till vänster) över plattan, och slutar efter kolumn 4.
    6. Efter blandning kolumn 4, kasta 125 mikroliter i en avfallsbehållare. Kolumnerna 2 och 3 ska inte innehålla några droger för att möjliggöra användning som bakgrund (Blank) och positiva kontroller tillväxt.
      OBS: Alternativt följa mallen i figur 1B för bibliotek att testa läkemedel. Varje 96-brunnar rymmer 58 läkemedel vid en enda koncentration. Förbereda denna drog platta med användning av dubbel den önskade slutkoncentrationen, eftersom den kommer att spädas i halv i steg 4.2.4.
  2. Läkemedelsbehandling:
    1. Hämta 96-brunnar innehåller Mtb-infekterade makrofager (Mtb / makrofager aggregat).
    2. Dekantera försiktigt alla relevanta brunnar (B2 genom G11) med en flerkanals pipett.Utför detta i en tvåstegsprocess sätt: först ta bort 150 mikroliter utan att luta plattan och ta bort kvarvarande material (~ 50 mikroliter) genom att luta plattan och sätta in pipettspetsen till den nedre kanten av brunnen. Som Mtb / makrofag aggregat är vidhäftande till botten av brunnen, bör inget material förloras.
    3. Försiktigt lägga 100 mikroliter av 7H9-C media till alla relevanta brunnar (B2 genom G11) av plattan innehåller MTB / makrofager aggregat.
    4. Med hjälp av en flerkanals pipett, överför 100 mikroliter från läkemedelsinnehållande 96-brunnar (steg 4,1) till motsvarande brunnar av infektionen plattan.
    5. Samlas upp i slutna påsen och inkubera i 3 dagar vid 37 ° C.

5. Kvantifiering av läkemedlets effektivitet Använda Resazurin mikrotiter analys

  1. Förbereda resazurin stamlösning vid en slutlig koncentration av 0,8 mg / ml i H2O Filtrera genom 0,22 | im porstorlek PVDF-membran för sterilisering.
  2. Förbereda resazurin arbetslösning genom att blanda resazurin stamlösning, H2O och Tween-80 (20% lösning i H2O) i en 2: 1: 1-förhållande. Slutliga koncentrationer är 0,4 mg / ml resazurin och 5% Tween-80.
  3. Med användning av en plattläsare, installation av ett program för att läsa fluorescens vid 530 nm excitation och 590 nm emission var 30 min under 24 h vid 37 ° C. Pre-varm plattavläsare till 37 ° C.
  4. Tillsätt 20 mikroliter av resazurin arbetslösning till alla relevanta brunnar (B2 genom G11) hos läkemedelsbehandlade plattan (steg 4,11) med användning av en flerkanalig pipett.
  5. Placera plattan på plattläsare och starta programmet inrättades steg 5,3.
    OBS: För att underlätta behandlingen av stora volymer av analysplattor, är det tillräckligt att utveckla analysen i en 37 ° C inkubator och utför enda fluorescens läser varje 24 timmar. Detta gäller även för användare som inte har tillgång till en plattläsare med kinetiska och inkubation kapacitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

För att bekräfta robustheten anpassa detta infektionsmodell till 96-brunnars plattformat, här undersökte vi drogkänslighet av Mtb härledd från vårt 96-väl anpassad infektionsmodell mot rifampicin (RIF) och moxifloxacin (Moxi) enligt den mall ges i figur 1A. Vi visar att genereringen av Mtb / makrofag aggregerade strukturer nyckel till denna analys tillförlitligt kan produceras i en 96-brunnsplattformat (figur 2), vilket möjliggör genomströmning kompatibilitet (Figur 1B). Makrofag passe Mtb produceras på detta sätt kan användas direkt för läkemedlets effektivitet tester med väl karakteriserade resazurin mikro-analys (Figur 3).

Som resazurin analysen bygger på oxidativa arter som producerats av metaboliskt aktiv Mtb att konvertera blå resazurin till fluorescent rosa resorufin, kan förändringen i färg och fluorescens användas för att som en surrogatmarkör för att bestämma mängden av bakterietillväxt. I figur 3A visar vi att det finns tillräckligt med känslighet inom resazurin analys för att tillförlitligt detektera viabla Mtb bakterier med förmåga att replikera i frånvaro av läkemedel efter endast tre dagars inkubation. Medan visuell bekräftelse av endpoint färgförändring är endast ett ungefärligt utvärdering av tillväxt, kan vi exakt kvantifiera detta genom kinetiskt mäta omvandlingen av resazurin till dess fluorescerande metabolit resorufin med användning av en plattläsare (figur 3B). Med hjälp av dessa uppgifter, normalisering till den positiva tillväxtkontrollen (frånvaro av läkemedel) möjliggör beräkningen av känslighet döda kurvor för att visualisera läkemedlets effektivitet mot makrofag-passe Mtb (Figur 4).

Här, de representativa resultat i figurerna 3 4 visar att den minimala hämmande koncentrationen (MIC), definierad som den lägsta koncentrationen av antibiotikum vid vilken 90% tillväxthämning, är större än 2 mikrogram / ml för både rifampicin och moxifloxacin mot Mtb härrör från vår infektionsmodell. Detta visar att vår infektionsmodell förutspår effekten av anti-Mtb läkemedel som är mer i linje med MIC-värden som bestämts mot intracellulära Mtb 8, och därmed återspeglar diffusion barriäregenskaper som försummas i de flesta Mtb drogkänslighetsanalyser med hjälp av buljong odlas bakterieceller.

Viktigt är de data som erhållits med hjälp av den beskrivna analysen i 96-hålsformat visade mycket jämförbara resultat som vi tidigare hade bestämts för rifampicin och moxifloxacin mot makrofag-passe Mtb 16.


Figur 1: Läkemedels platta layout. (A) Exempel mall av läkemedlet utmaningen platta som används i steg 4. Detta gör det möjligt att parallelltestning av två läkemedel i tredubbla brunnar på 8 definierade koncentrationer. Som ett representativt experiment använde vi rifampicin (RIF) och moxifloxacin (Moxi) börjar vid 2 ^ M och 2,5 ^ M resp. (B) En alternativ mall för throughput screening är också anordnad för att visa möjligheten att testning av 58 föreningar vid en vald koncentration. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: Generering av Mtb / makrofag aggregerade strukturer i 96-brunnarformatera. (A) representant ljusa fält och GFP samman bilder av Mtb -macrophage aggregat på dag 9 efter infektion. Bilder fångades med en 4X mål med hjälp av ett automatiserat program cell imaging som dokumenterar hela väl genom att sy ett montage av tre med 3 individuellt tagna bilder. (B) En enskild icke-sydd bild från synfältet visas i (A). (C) En representant samman ljusa fält och GFP bilden av en Mtb / makrofag aggregatstruktur fångas med en 10X objektiv. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3: Använda resazurin mikro analys för att mäta Mtb lönsamhet. (A) Förekomst av viable Mtb celler kan enkelt bestämmas genom omvandling av den blå resazurin färgämnet till sin rosa, reducerad form. Representativa resultat visas här med rifampicin (RIF) och moxifloxacin (Moxi) enligt mallen i figur 1A. (B) För att kvantitativt mäta omvandlingen av resazurin, fluorescens av individuella brunnar (motsvarande fig 3A) övervakades kinetiskt under 24 timmar såsom beskrivits i steg 5. Representativa mini-grafer visar relativa fluorescensenheter (y-axeln) mot tiden (x -Axel). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4: Fastställande drogkänslighet döda kurvor från REMA data. Relativa fluorescensenheter vid tidpunkten för maximal resazurin signal i (A) rifampicin och (B) moxifloxacin behandlade brunnar (från figur 3B) normaliserades till ingen narkotikakontroll (maximal Mtb tillväxt) som 100% överlevnad. Bakgrundskontroll (Blank) signaler subtraheras från varje provbrunn. Procenten överlevnad plottades för varje individuell koncentration av läkemedelsbehandling för att alstra en dödande kurva. Data i denna figur representerar medelvärdena ± SD av tre oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Här har vi beskrivit i detalj en alternativ Mtb infektionsmodell som lämpar sig för läkemedlets effektivitet testning. Denna modell tar hänsyn till två viktiga faktorer som bör ges mer uppmärksamhet under den tidiga TB läkemedelsutvecklingsprocessen: närvaron av fysiologiskt relevanta hinder för läkemedelspenetration och metabola förändringar av Mtb under infektion. Medan vi tidigare har visat fördelarna med vårt infektionsmodell och föreslog möjligheten att skala upp infektionen för genomströmning kompatibilitet 16, här visar vi att detta verkligen kan uppnås genom att anpassa systemet direkt i 96-brunnar format. Förmågan att generera Mtb / makrofag aggregat direkt i 96-hålsplattor är fördelaktigt eftersom det tar bort kravet på att pipett och fördela aggregaten från en stor odlingskolv i enskilda brunnar, vilket i sig är svårt eftersom storleken på aggregaten kan nå storlekar> 500 | j, m. Den stora storleken av de infekterade makrofager aggregaten skulle förhindra användningen av P200 flerkanalspipetter som är nödvändiga för genomströmning analyser eftersom det antingen skulle täppa tips eller omfattande pipettering skulle bryta sönder aggregaten. Modifieringen av denna infektion systemet till 96-brunnsplattor minskar mängden manipulation steg som krävs och genererar enhetliga brunnar med liknande mängder av MTB / makrofager aggregat. Som sådant är detta analyssystem särskilt värdefullt inte bara i den tidiga utvecklingen processen att förutsäga effekten av bly kandidatföreningar in vivo, men i throughput screening av bibliotek drog.

En viktig fördel med den beskrivna infektionsmodell är utnyttjandet av en BSL-2 kompatibel Mtb-stam. Förmågan att arbeta under BSL-2 villkor är mycket kostnadseffektiv, accelererar manipulation av protokollet, och viktigast möjliggör laboratorier som inte har tillgång till en BSL-3 möjlighet att utföraSE avancerade drogscreeningsanalyser. Utnyttjad auxotrof Mtb mc 2 6206 stam är ett derivat av H37Rv 17, 18 som behåller alla utom 4 gener, panCD och leuCD, som inte påverkar läkemedelsresistens eller tolerans 16. Jämfört med andra vanligen använda Mtb surrogat såsom M. bovis BCG och M. smegmatis, Mtb mc 2 6206 är närmast besläktad med virulent Mtb H37Rv, referensstam för patogenes studier. Viktigt hävdat RD-1 locus, som är frånvarande från BCG och spelar en viktig roll i Mtb virulens och granulombildning 19. Jämförelsevis är Mtb mc 2 6206 också mer relevant för TB-läkemedelsutveckling analyser än M. smegmatis, som är en snabbväxande arter som är genomiskt skiljer sig från Mtb och har olika antibiotikaresistens profiler.

Den analys som beskrivs här är också värdefullt på grund av dess höga grad av flexibilitet. 96-brunnsplattor innehållande MTB / makrofager aggregat kan användas inte bara för titrering av läkemedelsbehandling i tre exemplar som vi har visat (Figur 3), men också för screening av hela bibliotek läkemedels (Figur 1B). Vid en vald koncentration, kan varje 96-brunnsplatta screena 58 föreningar. Detta antal skulle drastiskt öka till> 300 föreningar om infektionen systemet är anpassat till en 384-brunnar, vilket är fullt möjligt bygger på att det faktum att vi får starka resazurin signaler efter att endast tillåta bakterierna att replikera i 3 dagar. I själva verket skulle det vara relativt enkelt att anpassa detta system för att 384-brunnar format, liksom andra än ned-skalning volymerna proportionellt för att passa den mindre väl format, skulle majoriteten av protokollet förblir oförändrade. För att möjliggöra tillräcklig signal för resazurin analysen, kan det varakrävs för att töja inkubationen i steg 4.2.5 till 7 dagar för att möjliggöra tillräckligt med bakteriell replikation.

Även koppling denna infektionsmodell till resazurin analysen som en utläsning för Mtb lönsamhet har många fördelar, nämligen dess kostnadseffektivitet och snabb analysprotokoll samtidigt uppnå jämförbara resultat till andra guld standardsystem såsom BACTEC 460 20, gör det ändå har vissa begränsningar . Den resazurin analysen kan inte diskriminera mellan bakteriostatiska och bakteriedödande läkemedel eftersom det endast mäter metabolisk aktivitet. Detta är ett viktigt hinder för att hålla i minnet, eftersom metabolisk aktivitet är naturligt låg i latent Mtb. Emellertid är en viktig del av denna analys infektionsmodell, som kan vara förenligt med avläsningar för Mtb drogkänslighet än resazurin analysen. Till exempel, efter läkemedelsbehandling, brunnar kunde direkt ströks ut för kolonienhet bildning (CFU) räknar, guldet standard för att testa den antibakteriella effekten av föreningar (även om detta inte är kompatibel med throughput screening). Alternativt skulle detta system vara kopplat till luciferas uttrycka Mtb, som har visat att nära korrelerar till CFU räknar 21. Att använda ett luciferas system för att mäta drogkänslighet, skulle bara två ändringar i protokollet krävas: i) ersättning av Mtb -GFP med Mtb -luciferase och ii) användning av Bright-Glo luciferin reagens i stället för resazurin i steg 5. användningen av luciferas som uttrycker Mtb skulle förkorta utvecklingen av analysen för att 30 min medan avsevärt ökar analyskänsligheten till nivåer som skulle vara lätt kompatibel med 384-brunnsplattformat.

Sammanfattningsvis har vi framgångsrikt gått denna infektionsmodell i en 96-brunnar format som har relativt få manipuleringssteg, hög reproducerbarhet, och förmågan att producera oändliga mängder av startmaterial, alla nyckelfaktorer i genom kompatibilitet. Denna analys är också lätt att anpassa till många olika format och avläsningar, vilket gör det en värdefull tillgång för tidigt Mtb läkemedelsutvecklingsprocessen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7H9 BD Difco 271310 Follow manufacturer's recommendations
Middlebrook OADC BD Biosciences 212351
Tyloxapol Sigma T8761 Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize
D-Pantothenic acid hemicalcium salt Sigma P5710 Prepare 24 mg/mL stock solution in H2O; filter sterilize
L-leucine MP Biomedicals 194694 Prepare 50 mg/mL stock solution in H2O; filter sterilize
Hygromycin B EMD Millipore 400051 Prepare 200 mg/mL stock solution in H2O
Nalgene Square PETG media bottle Thermo Fisher 2019-0030
RPMI 1640 media Hyclone SH30027.01
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S12450H
L-glutamine Corning MT25005CI
HEPES Hyclone SH30237.01
Cytation 3 plate reader Biotek Interchangable with any fluorescent plate reader and microscope
Gen5 Software Biotek Recording and analysis of rezasurin coversion
Rifampicin  Fisher Scientific BP2679250 Prepare 10 mg/mL stock solution in H2O
Moxifloxacin Hydrochloride Acros Organics 457960010 Prepare 10 mg/mL stock solution in H2O
Resazurin Sodium Salt Sigma R7017 Prepare 800 μg/mL stock solution in H2O; filter sterilize
Tween-80 Fisher Scientific T164500 Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barry, C. E. Lessons from seven decades of antituberculosis drug discovery. Curr Top Med Chem. 11, (10), 1216-1225 (2011).
  2. Bass, J. B. Jr, et al. Treatment of tuberculosis and tuberculosis infection in adults and children. American Thoracic Society and The Centers for Disease Control and Prevention. Am J Respir Crit Care Med. 149, (5), 1359-1374 (1994).
  3. Koul, A., Arnoult, E., Lounis, N., Guillemont, J., Andries, K. The challenge of new drug discovery for tuberculosis. Nature. 469, (7331), 483-490 (2011).
  4. Palomino, J. C., Martin, A. TMC207 becomes bedaquiline, a new anti-TB drug. Future Microbiol. 8, (9), 1071-1080 (2013).
  5. Zuniga, E. S., Early, J., Parish, T. The future for early-stage tuberculosis drug discovery. Future Microbiol. 10, (2), 217-229 (2015).
  6. Evangelopoulos, D., Fonseca, da, D, J., Waddell, S. J. Understanding anti-tuberculosis drug efficacy: rethinking bacterial populations and how we model them. Int J Infect Dis. 32, 76-80 (2015).
  7. Ekins, S., et al. Looking back to the future: predicting in vivo efficacy of small molecules versus Mycobacterium tuberculosis. J Chem Inf Model. 54, (4), 1070-1082 (2014).
  8. Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathog. 5, (10), e1000645 (2009).
  9. Hartkoorn, R. C., et al. Differential drug susceptibility of intracellular and extracellular tuberculosis, and the impact of P-glycoprotein. Tuberculosis (Edinb). 87, (3), 248-255 (2007).
  10. Queval, C. J., et al. A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening. J Vis Exp. (83), e51114 (2014).
  11. Sorrentino, F., et al. Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit Mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages. Antimicrob Agents Chemother. 60, (1), (2015).
  12. Sarathy, J., Dartois, V., Dick, T., Gengenbacher, M. Reduced drug uptake in phenotypically resistant nutrient-starved nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 57, (4), 1648-1653 (2013).
  13. Dutta, N. K., Karakousis, P. C. Can the duration of tuberculosis treatment be shortened with higher dosages of rifampicin? Front Microbiol. 6, 1117 (2015).
  14. van Ingen, J., et al. Why Do We Use 600 mg of Rifampicin in Tuberculosis Treatment? Clin Infect Dis. 52, (9), e194-e199 (2011).
  15. Donald, P. R. Cerebrospinal fluid concentrations of antituberculosis agents in adults and children. Tuberculosis (Edinb). 90, (5), 279-292 (2010).
  16. Schaaf, K., et al. A Macrophage Infection Model to Predict Drug Efficacy Against Mycobacterium Tuberculosis. Assay Drug Dev Technol. 14, (6), 345-354 (2016).
  17. Sampson, S. L., et al. Protection elicited by a double leucine and pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis in guinea pigs. Infect Immun. 72, (5), 3031-3037 (2004).
  18. Jain, P., et al. Specialized transduction designed for precise high-throughput unmarked deletions in Mycobacterium tuberculosis. MBio. 5, (3), e01245-e01214 (2014).
  19. Davis, J. M., Ramakrishnan, L. The role of the granuloma in expansion and dissemination of early tuberculous infection. Cell. 136, (1), 37-49 (2009).
  20. Collins, L., Franzblau, S. G. Microplate alamar blue assay versus BACTEC 460 system for high-throughput screening of compounds against Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium. Antimicrob Agents Chemother. 41, (5), 1004-1009 (1997).
  21. Snewin, V. A., et al. Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs. Infect Immun. 67, (9), 4586-4593 (1999).
En hög kapacitet Kompatibel analys för att utvärdera läkemedlets effektivitet mot makrofag passe<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schaaf, K., Smith, S. R., Hayley, V., Kutsch, O., Sun, J. A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis. J. Vis. Exp. (121), e55453, doi:10.3791/55453 (2017).More

Schaaf, K., Smith, S. R., Hayley, V., Kutsch, O., Sun, J. A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis. J. Vis. Exp. (121), e55453, doi:10.3791/55453 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter