En fremgangsmåte for fremstilling av ansiktspreparater av muskelkarotidarterien og aorta er beskrevet. Slike preparater, når immunofluorescensfarget med spesifikke antistoffer, gjør det mulig for oss å studere lokalisering av proteiner og identifikasjon av celletyper i hele vaskulærveggen ved konfokal mikroskopi.
Seksjoner av parafininkonstruert vev blir rutinemessig brukt til å studere vevshistologi og histopatologi. Det er imidlertid vanskelig å avgjøre hva den tredimensjonale vevsmorfologien er fra slike seksjoner. I tillegg kan de undersøkte delene av vev ikke inneholde regionen i vevet som er nødvendig for den pågående studien. Denne sistnevnte begrensningen hindrer histopatologiske studier av blodkar siden vaskulære lesjoner utvikles på en fokalisert måte. Dette krever en metode som gjør at vi kan undersøke et bredt område av blodkarveggen, fra overflaten til dypere områder. En helmontering og ansiktspreparasjon av blodkar oppfyller dette kravet. I denne artikkelen vil vi demonstrere hvordan man gjør ansiktspreparasjoner av musa aorta og karotisarterie og å immunofluorescently flekke dem for konfokal mikroskopi og andre typer fluorescensbasert bildebehandling.
For histopatologiske studier ved lysmikroskopi behandles tredimensjonale biter av biologiske vev rutinemessig for paraffininduksjon etterfulgt av snitting og farging. En vevsprøve som har blitt paraffin-innebygd, kan være flere millimeter i alle tre dimensjoner. For lysmikroskopi må det imidlertid først snittes slik at lyset kan passere gjennom og deretter farget slik at den tynne delen gir nok kontrast til bildebehandling. Fordi snittprøver vanligvis er 5-10 μm tykkelse, ser man bare en liten del av hele prøven i to dimensjoner av gangen. Det er mulig å samle sekvensielle seksjoner og, etter å ha avbildet hvert enkelt avsnitt, utfører datamaskinassistert rekonstruksjon av 3D-bildene, men dette er en kjedelig jobb. Histopatologi av blodkar, spesielt for å studere patogenesen av aterosklerose, presenterer unike problemer. Aterosklerose er en fokalisert sykdom som utvikler segLokalt i områder hvor forstyrret blodstrøm forekommer. Dessuten initieres sykdommen i intima, et tynt vev bestående av et monolag av endotelceller og ekstracellulær matrise, av store arterier. Av disse årsakene er det en utfordring å lokalisere og studere tidlige lesjoner ved hjelp av seksjonerte blodårer, fordi man lett kan savne snittet av lesjonen. Selv om en seksjon inkluderer et sykt område, vil man kun se en 5-10 μm porsjon som inneholder endotelceller og andre vaskulære veggceller i media og adventitia.
Preparasjoner for hele fjellet og ansiktet (uttalte än fäs) gjør at vi kan undersøke et bredt område av blodkarets overflate som hele aorta fra aorta rotten helt ned til de vanlige iliac arteriene. Ved å bruke et slikt preparat som er farget med spesifikke antistoffer og andre spesifikke prober, kan man finne plasseringen av lesjoner og også hvor forskjellige molekylære hendelser forekommer i endotelceller i forbindelse medAtherogenesen som forandringer i ekspresjon, lokalisering og posttranslasjonelle modifikasjoner av proteiner. I tillegg til å studere atherogenese blir endotelcelleformen observert i en ansiktspreparat brukt som en indikator på det regionale tidsmessige blodstrømningsmønster. Slike data er viktige for å studere mekanosignalering av endotelceller in situ. For dette formål er rutinemessige histologiske tverrsnittede blodkar ikke nyttige. For vaskulær medisin og biologi er det derfor spesielt viktig å skaffe seg en teknikk for å lage ansiktspreparater av blodkar som gjør det mulig å observere et bredt område av fartøyets overflate samt dypere undergrunnsflater av fartøyet.
Som gjennomgått av Jelev og Surchev 1 , har vaskulære biologer utviklet ulike metoder for å observere foringen av blodårene i ansiktet. Noen geniale metoder ble utviklet i 1940- og 1950-tallet. Ved hjelp av disse metodene var de Kunne studere den grunnleggende organisasjonen av endotelceller som linje den indre overflaten av blodårene. Imidlertid var det ikke alltid mulig å oppnå uforstyrret morfologisk grunnlag på grunn av måten disse preparatene fremstilles på (den såkalte Hautchen-metoden 2 , 3 , 4 eller avskalling av fartøyets overflate 5 ) og måten prøven ble farget på. Informasjon fra fartøyets overflate til de dypere områdene av blodkarveggen. Hele montering av ansiktsbeholderpreparat kombinert med immunfluorescensfarging tillot oss ikke bare å studere endotelcellemorfologi og proteinuttrykk og lokalisering i disse cellene, men også for å utvide slike studier til den subendoteliale regionen av karvegveggen. Tidlige studier ved bruk av blodkar og ansiktspreparater ble farget immunoflurescently begynte å dukke opp i 1980-tallet 6 ,F "> 7. Med fremkomsten av laserskanning av konfokal mikroskopi og nyere mikrofonmikroskopi, kan man nå skaffe klare in-fokusbilder av blodkarets veggstruktur i immunfluorescently-stained en ansiktsbeholderprøver samt det vaskulære nettverket i levende dyr 8 , 9 , 10 , 11. Disse datamaskinbaserte billedteknikkene skaper optiske snittbilder i fokus og ved å stable slike bilder kan man få rekonstruert 3D-bilder av fartøyets vegg og det vaskulære nettverket i vev. I tillegg er en Kan generere bilder av en seksjon laget langs Z-aksen til det rekonstruerte bildet 12 , 13 .
I denne artikkelen vil vi illustrere en metode for å forberede en ansiktspreparat av musaorta og halspulsåren for immunfluorescerende farging. En ansikts forberedelserKan gjøres selv etter at disse fartøyene har blitt manipulert eksperimentelt. For eksempel kan en halspulsårer være delvis ligert og deretter et ansiktspreparat fremstilt etter en slik operasjon. Av denne grunn vil vi også beskrive i denne artikkelen hvordan vi gjør en delvis ligering på halspulsåren. Sammenlignet med å lage lignende preparater fra større dyr som rotter, kaniner og mennesker, er musekar små i størrelse og mer skjøre, hvilket krever ekstra omsorg for håndtering under kirurgisk isolering av kar og forbereder dem for antistofffarging og mikroskopi. Fordi den mest brukte dyremodellen for genetisk modifikasjon er musen, blir det kritisk for mange etterforskere å håndtere muskasser uten å skade dem. I dette manuskriptet vil vi beskrive hvordan du skal håndtere museblodkar når du lager ansiktspreparater av musa aorta og karotisarterie. For demonstrasjonsformål vil vi bruke wild type C57 / b6 mus.
Når du håndterer museblodkar, er det viktig å huske at endotelet er skjøre, og at enhver overdreven mekanisk kraft vil skade endotelceller. Endotelcellene bryter for eksempel av eller løsner fra karveggen hvis karet blir perfusert for kraftig, noe som lett kan skje når karet blir perfusjonert ved hjelp av en hånddrevet sprøyte.
For å oppnå konstant perfusjonstrykk bruker vi et tyngdekraftsperfusjonssystem med 120 cm vannkolonne trykk. Det er blitt rapportert at det gjennomsnittlige…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterens forskningsaktiviteter støttes av stipend fra National Institute of Health til Dr. Abe (HL-130193, HL-123346, HL-118462, HL-108551).
0.9% Sodium Chloride injection solution USP 500ml bag | Fisher Scientific | NC9788429 |
12-well plates | Fisher Scientific | 12556005 |
6-0 coated vicryl suture | Ethicon | J833G |
AF488 goat anti-rat IgG | Life Technologies | A11006 |
AF546 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11035 |
Anti-CD144 (Ve-Cad) | BD Biosciences | BD555289 |
Anti-VCAM-1 (H-276) Rabbit polyclonal IgG | Santa Cruze Biotechnology | Sc-8304 |
Aoto Flow System | Braintree Scientific | EZ-AF9000 |
Autoclave Wrap. 24x24in | Cardinal Health | 4024 |
Blunt retractors, 2.5mm wide | Fine Science Tools | 18200-10 |
Caprofen (Rimadyl) | zoetis | NADA#141-199 |
Chlorhexidine Scrub, 2% | Med-Vet International | RXCHLOR2-PC |
Curity gauze sponges 2×2 | Cardinal Health | KC2146 |
Electric heating pad, 12X14 | Fisher Scientific | NC0667724 |
Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 |
Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 |
Micro cover glass 22x50mm | VWR | 48393059 |
Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-18 |
normal goat serum | Equitech-Bio | GS05 |
Paraformaldehyde Solution 4% in PBS | Santa Cruze Biotechnology | SC-281692 |
Petri Dishes 100x15mm | Fisher Scientific | FB0875713 |
Prolong Gold Antifade mountant with DAPI | Life Technologies | P-36935 |
Puritan cortton swabs | VWR | 10806-005 |
Puritan Mini cotton tipped aplicators | VWR | 82004-050 |
Round handled Needle Holder | Fine Science Tools | 12076-12 |
Silk Suture 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 |
Spring scissors | ROBOZ | RS-5601 |
Strabismus Scissors | Fine Science Tools | 14075-09 |
Super Grip Forceps | Fine Science Tools | 00649-11 |
Transparent Dressing | Cardinal Health | TD-26C |
Triton X-1000 | Fisher Scientific | AC327371000 |