Summary
Pruebas de comportamiento se utilizan en ensayos pre-clínicos para evaluar los efectos fenotípicos de una enfermedad o tratamiento sobre el bienestar de los animales. Para evaluar globalmente el funcionamiento motor, seleccionamos pruebas de locomoción general, fuerza muscular y coordinación: prueba de campo abierto, la malla y la prueba del rotarod, respectivamente.
Abstract
Pruebas de comportamiento se utilizan en ensayos pre-clínicos para evaluar los efectos fenotípicos y los resultados que tiene una determinada enfermedad o tratamiento sobre la salud y el bienestar del animal. Hay numerosas pruebas de comportamiento que pueden ser aplicadas. Hemos seleccionado una prueba para la locomoción general, prueba de campo abierto (OFT); una prueba de fuerza muscular, prueba de la malla (MT); y una prueba de coordinación, la prueba del rotarod (RR). La prueba puede realizarse sobre una base semanal o mensual. Como prueba de locomoción general, las obras OFT objetivamente monitoreo de parámetros de movimiento mientras el ratón está en un aparato de campo abierto. El campo es generalmente una caja de 2' x 2', y los movimientos se registran a través de la detección de láser o a través de captura de vídeo. El ratón se coloca en el centro del campo abierto y permitido moverse libremente para la prueba. El MT utiliza la latencia para un ratón para caer una pantalla invertida como una medida de fuerza muscular. Un ratón se coloca en una pantalla, que se invierte en una caja clara y se mide el tiempo de su latencia a caer. Se realizan tres ensayos, con el mejor de los tres ensayos anotados para ese día. Una puntuación de 60 s es el tiempo máximo que un ratón quedo invertido. Ratones se dan un descanso de 5 minutos entre ensayos de prueba de acoplamiento. Por último, un protocolo acelerado en el RR evalúa coordinación motora y la resistencia. Durante un ensayo, un ratón camina sobre una varilla giratoria aumenta en velocidad de 4 rpm a 40 rpm durante 5 minutos. La prueba termina cuando el ratón toca el sensor de presión imantada al caer. Cada ratón somete a tres ensayos, y la mejor prueba es anotó para ese día. Este combinados datos conductuales permiten la evaluación global de la movilidad, coordinación, fuerza y movimiento de los animales. Al menos dos de las tres medidas de prueba de comportamiento debe mostrar mejora para un animal calificar como teniendo la función motora mejora general.
Introduction
El objetivo de la prueba comportamental es medir la caracterización fenotípica, ya sea en estudios para un nuevo modelo de ratón de enfermedades que afectan el sistema nervioso central o de un ensayo de un nuevo tratamiento. Hay una variedad de pruebas de comportamiento para elegir. La justificación para el uso de una combinación de pruebas de comportamiento es a menudo evaluar completamente los resultados del tratamiento clínico previo. La batería de pruebas de comportamiento en el presente documento incluye la prueba de campo abierto (OFT), prueba de la prueba de acoplamiento (MT) y el rotarod (RR).
La OFT se utiliza como una medida de actividad locomotora general1,2,3,4,5,6,7. Esta evaluación permite que el ratón para moverse libremente en un campo abierto, y las medidas tomadas son los movimientos del ratón en el transcurso de la prueba de comportamiento. Los análisis cuantitativos hizo utilizando un OFT incluyen cría, movido de distancia, tiempo pasado móviles (por ejemplo, caminar y correr) y los cambios en la actividad con el tiempo (por ejemplo, movimientos de salto y más lento/hiperactivo), razón por la cual es una útil y Análisis exhaustivo del comportamiento de roedor.
La MT se utiliza para evaluar la solidez de los ratones1,2,8,9,10,11. El uso de las cuatro extremidades para colgar de una malla de cuadrícula permite la medición no invasiva de la habilidad de los ratones para mostrar tensión sostenida del miembro mientras que oponerse a los efectos de la gravedad. Esta evaluación se realiza colocando un ratón en una malla invertida y su latencia a la sincronización. Esta prueba evalúa la fuerza muscular del ratón midiendo cuánto puede sostenerse en la pantalla invertida antes de caerse.
El RR evalúa la coordinación de un ratón mientras está usando la aceleración protocolo1,2,7,8,9,12,13. El aparato de rotarod consiste en un haz cilíndrico que gira en el aire a partir de las 4 rpm. El ratón puede aprender esta habilidad de coordinación motora y está cuestionado luego por lento, incremental aumenta hasta 40 rpm. Clásicamente, el protocolo de velocidad constante es una medida de la fuerza muscular, mientras que el protocolo de aceleración para el RR evalúa coordinación, resistencia y fuerza muscular1,2,7, 14.
Las ventajas de estas tres pruebas conductuales son son ampliamente aceptadas en los roedores comportamiento prueba comunidad2,7,8,9y cuando toma no sólo como la suma de los pruebas individuales, pero colectivamente, puede utilizarse como una evaluación global del comportamiento fenotípico de la investigación de los diferentes resultados de los tratamientos experimentales. La OFT es una de las pruebas sólo para general aparato locomotor de la actividad2. La RR también es una de las únicas maneras de evaluar coordinación2, que para utilizar el software de análisis de marcha, que no se discutirán aquí. Hay algunas maneras en las que se puede evaluar la fuerza muscular de un ratón; sin embargo, utilizando la MT o una prueba de caída de cable, se ha utilizado fundamentalmente en la literatura y es aceptado como un método confiable para las pruebas de fuerza muscular2,8,9,10, 11. muchas otras técnicas para medir la coordinación y locomoción general son muy lentos y no pueden producir datos fiables (por ejemplo, sincronización manualmente el movimiento del ratón o pintura manualmente las patas para el análisis de la marcha). Los sistemas automatizados de la OFT y el RR aumentan la fiabilidad y validez de los datos y ahorrar tiempo y esfuerzo.
Por ejemplo, dada la neurodegeneración de la modelo de ratón de la enfermedad de Sandhoff, al realizar esta batería de pruebas, la OFT sería la primera de estas pruebas para evaluar las anormalidades del motor que generalmente se ven en este modelo de ratón a partir de 3 meses de edad. Déficit en coordinación motora también debe ser evidente a partir de las 12 semanas de edad. Déficits en la fuerza muscular deben comenzar alrededor de las 14 semanas de edad, pero al final llegan a ser mucho más significativos por 16 semanas.
Estas pruebas son útiles en el estudio de las enfermedades que causan deficiencias motoras importantes, incluyendo enfermedades de neurodegenerative9 como Sandhoff enfermedad1,8,13, la enfermedad de Parkinson7, Enfermedad de Huntington, esclerosis múltiple. Las pruebas también pueden utilizarse para el estudio de envejecimiento y hacer comparativa evaluación geriátrica o medidas de salud. Disturbios de la marcha y los cambios en la locomoción y el equilibrio se ven en muchos de estos Estados de enfermedad. Sin embargo, la utilidad de estas pruebas no se limita a enfermedades con prevalencia síntomas neuromusculares.
Tenga en cuenta que no ha habido ninguna variables confusoras señaló con respecto a la motivación o la novedad de ninguna de las medidas de prueba comportamiento descritas. Es imprescindible para ciertos Estados de enfermedad y patologías que los investigadores adquieran datos conductuales preliminares antes de que el ratón muestra síntomas fenotípicos; el investigador debe entonces periódicamente (semanal) asegurar que se contabilizan todas las deficiencias motoras. Muchas enfermedades tienen un inicio rápido de síntomas fenotípicos, y sin pruebas semanales, estos síntomas no ser contablemente.
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Protocol
Todos los protocolos descritos fueron realizados de acuerdo con y fueron aprobados por cuidado Comité del Animal de la Universidad de la reina. La frecuencia de pruebas de comportamiento puede ser semanal o mensual o una combinación de los dos (es decir, semanal cuando uno espera a ver la gran diferencia y mensual en otro lugar).
Nota: Estudios Murine de comportamiento dependen en gran medida sexo/edad/cepa, y por lo tanto es esencial para recoger los puntos de tiempo y seguir siendo constante a través de grupos experimentales. Factores ambientales (por ejemplo, olores, ruido, temperatura, humedad iluminación, etc.) afectan mucho comportamiento y ansiedad en ratones. Tratar de reducir estos factores ambientales tanto como sea posibles.
1. campo prueba
Nota: Antes de la prueba de comportamiento, los animales deben ser habituados a la habitación donde la prueba se tendrá lugar para 10-15 minutos antes del comienzo de la prueba. Asegúrese de equipo de protección personal adecuado y todo centro local se siguieron las guías de los protocolos de pruebas conductuales.
Nota: Ningún entrenamiento antes de la prueba.
- Garantizar que el ordenador y el programa OFT, funcionando y conectados correctamente a la cámara o caja de campo abierto. Haga clic en el programa smartware, el icono de campo abierto y "Aceptar". Eligió la fuente de "convertidor analógico digital" de las opciones de cámara. Haga clic en "detección" y asegúrese de que el espacio de campo abierto todo es visualizado y que las dimensiones son 30 x 30 cm.
Nota: Diseño de equipo puede variar dependiendo de las limitaciones de espacio, pero asegúrese de que la computadora y campo abierto aparato está cerca entre sí en una habitación bien iluminada para captura de vídeo adecuado - Haga clic en "calibración", "instantánea," y luego "OK" para asegurarse de que el ratón se está detectando dentro de los límites del campo abierto. Haga clic en "tiempo" establecer previamente una cantidad de tiempo para probar los ratones; en este caso, establece 5 min.
- Introduzca a los temas haciendo clic en el icono "temas". Haga clic en "programador" y resalte toda prueba temas y haga clic en las flechas verdes doble y "fase uno, sesión;" esto traerá en todos los temas para comenzar la recogida de datos.
- Coloque un ratón en el centro del campo abierto y haga clic en el icono de "Inicio" para pedir el programa para comenzar a grabar. Prueba sólo un ratón a la vez.
- Una vez que 5 min, el programa se moverá automáticamente al siguiente tema. En este caso, quite el ratón que ha completado la prueba y coloque al siguiente tema en el campo abierto. Haga clic en "Inicio".
- Limpie el equipo. Repita los pasos 1.3-1.4 para los restantes temas de prueba.
- Para analizar los datos una vez que todos los sujetos han pasado por pruebas, haga clic en el icono de "analizar" en la parte superior derecha de la pantalla. Haga clic en "analizar" otra vez y luego "informe Resumen". Opcionalmente, exportar los datos a un USB.
2. prueba de acoplamiento
Nota: El área superficial y tamaño de la malla en la MT pueden influir en rendimiento. En el MT, si un ratón se cae dentro de los primeros 10 s durante el tiempo de 2 primeros colección puntos, volverá a colocarse en la malla inmediatamente para un segundo intento. La malla utilizada aquí fue una malla de alambre, con los orificios de la malla de aproximadamente 1,5 mm de diámetro.
Nota: Ejecutar estas pruebas en la misma hora del día se recomienda, ya que los parámetros fisiológicos y bioquímicos fluctúan durante el día. Peso corporal puede influir en el rendimiento en esta prueba y por lo tanto, debe tenerse en cuenta.
- Coloque el ratón en el centro de una malla e invierta la malla por lo menos 20 cm por encima de un contenedor transparente. Una vez invertida, iniciar el temporizador.
- Tiempo y registrar el tiempo de latencia para caer. Si el ratón no cae dentro de 60 s, le dan una puntuación de 60 s y conducta no más ensayos. Permitir que el ratón para descansar durante al menos 5 minutos. Este es el final de la prueba 1.
- Limpie el equipo y durante el intervalo entre ensayo de 5 minutos, prueba un segundo ratón, si es necesario. Repita los pasos 2.1-2.2 para los ensayos 2 y 3, si es necesario (como el ratón no puntuación de 60 s, deben experimentar tres ensayos).
3. prueba del Rotarod
Nota: La superficie y el diámetro de la varilla en la RT pueden influir en rendimiento. En el RT, si un ratón se cae dentro de los primeros 10 s durante los primeros puntos de 2 colección tiempo, ponerlo en la barra inmediatamente para un segundo intento.
Nota: Ejecutar estas pruebas en la misma hora del día se recomienda, ya que los parámetros fisiológicos y bioquímicos fluctúan durante el día. Peso corporal puede influir en el rendimiento en esta prueba y por lo tanto, debe tenerse en cuenta.
- Encienda la computadora y del Citi rotarod. Asegúrese de que están correctamente conectados para grabación de datos.
- Asegúrese de que el programa está ejecutando el protocolo acelerado. Configurar la duración deseada de la prueba del rotarod a xxx (el intervalo válido es de 000 a 999); en este caso, pulsar 300 *. Establecer el número de carriles que se utilizarán para xxx (el intervalo válido es de 001 a 005); en este caso, pulse 005 *. Establecer la velocidad inicial a xxx RPM (Introduzca 3005 5 rpms el rango válido es de 001 a 045); en este caso, pulse 004 *.
- Establece la velocidad máxima en RPM xxx (entrar en 4.030 para 30 rpms el rango válido es de 001 a 045); en este caso, pulse 040 *. Ajustar la velocidad de rampa a xxx en s (Introduzca 5.030 para una rampa de 30 s a máxima velocidad el rango válido es de 000 a 999); en este caso pulsar 300 *. Coloque la unidad a modo de ratón (entre 6001 para ratón adelante y 6002 para ratón inverso); en este caso, pulse 6001 *.
- Asegúrese de que todos los carriles magnetizados son equilibrados antes de comenzar el juicio. Coloque un ratón en cada carril del rotarod.
- Pulse start para iniciar el programa. Como los ratones caen, quitarlos de sus carriles con prontitud para garantizar que ellos no "tropiece" los otros carriles.
- Permitir que los ratones a descansar para un intervalo de 10 minutos entre prueba. Este es el final de la prueba 1. Durante el intervalo entre ensayo, limpie el equipo y comenzar el juicio por el siguiente conjunto de ratones.
- Repita los pasos 4 a 6 según sea necesario. Si un ratón permanece en el rotarod para el ensayo completo de 5 minutos, no más ensayos son necesarios para ese ratón.
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Representative Results
Los animales de estudio pueden sufrir el paradigma conductual prueba semanal o mensualmente para dar cabida a los puntos de tiempo requeridos para el análisis. Vea la figura 1 para ejemplos de tiempo prueba conductual. En los datos representativos a continuación, tomado de Osmon et al. (2016), los ratones experimentaron la batería de pruebas de comportamiento mensual, comenzando a las 12 semanas de edad, hasta su extremo humano alrededor de las 40 semanas de edad. El calendario de pruebas de comportamiento a veces es crítico para un experimento, especialmente cuando la supervivencia de los no tratados versus animales tratados varía drásticamente y las comparaciones son necesarias.
Aunque estas pruebas no se utilizan únicamente para trastornos neurodegenerativos, utilizamos ratones de Sandhoff (ver figura 2). Este ratón modelo consigue cada vez más débil y descoordinada de 12-16 semanas de edad si no se tratan y normalmente requieren euthanization en 16 semanas de edad1. Los datos en 2D de la figura muestra el uso del rotarod a fin de ver cómo se están comportando los ratones tratados en comparación con los ratones heterocigotos normales. La divergencia de los dos grupos a las 40 semanas denota el principio de coordinación disminuida del grupo tratamiento en comparación con controles normales. En otros modelos de ratón que esté siendo examinado con un fenotipo suave, más expansión y especialización de esta batería de pruebas se recomienda.
Al seleccionar los resultados relevantes para su publicación, es importante mantener en dos factores principales de mente. La primera es que la métrica utilizada debe ser escogida para ser específico para el modelo animal se utiliza. La OFT, la métrica más de uso general es "el tiempo en movimiento" (como se ve en la figura 2); sin embargo, la "distancia recorrida" también es una métrica común para locomoción general. En el RR, "rpm final" y "distancia recorrida" son parámetros comúnmente usados. El segundo factor en la selección de qué métrica debe ser elegido como un resultado conveniente gira en torno a qué métrica revela la divergencia o convergencia en los resultados conductuales, dependiendo que se anticipan los resultados más significativos.
Los datos recogidos podrían analizarse mediante múltiples pruebas estadísticas, pero para constante semanales o mensuales comportamiento pruebas con los ratones de la misma, se sugiere un análisis de varianza de medidas repetidas 2 vías (RM-ANOVA de 2 vías). Las medidas repetidas ANOVA permite la evaluación longitudinal de los resultados de los mismos animales y permite la comparación de cambios en el comportamiento animal con el tiempo, así como entre grupos. También se sugiere la corrección de Bonferroni. Al comparar los tratamientos en el mismo punto, se sugiere un ANOVA unidireccional, como se ve en la figura 2.
Figura 1: ejemplos de posible cronología Experimental para las pruebas de comportamiento. Pruebas de comportamiento se pueden hacer con una variedad de líneas de tiempo, dependiendo de la necesidad experimental. La prueba puede realizarse sobre una base mensual, semanal, o combinatoria. En el ejemplo, el período de estudio dura 23 semanas, donde la semana 0 es la administración de tratamiento. Cuando la prueba se produce sobre una base mensual, las pruebas se realizan en las semanas 4, 8, 12, 16 y 20. Cuando la prueba se produce sobre una base semanal, las pruebas se llevan a cabo cada semana (semanas 1-22) antes de la meta de 23 semanas. Cuando la prueba se produce en forma combinatoria, las pruebas se realizan semanalmente en las semanas 1-8, y entonces las pruebas se realizan mensualmente en las semanas 12, 16 y 20 antes de la meta de 23 semanas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Mensuales resultados de las pruebas conductuales en animales tratados superan a los animales no tratados. A las 12 semanas, los animales tratados superan a los animales no tratados sobre el"tiempo" en el OFT (A) y en la latencia de"caer" en el MT (E). No hay diferencias estadísticas entre los animales tratados y no tratados en el "rpm rotarod final" a las 12 semanas (C). Sobre pruebas de comportamiento mensual, los ratones tratados realizan de manera similar a los controles normales heterocigotos en los OFT (B), el RR (D)y la MT (F). Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software estadístico (por ejemplo GraphPad), se realizaron pruebas ANOVA unidireccionales en el análisis de la semana 12 (2A, Cy E) y 2-way ANOVA RM pruebas se realizaron en el análisis mensual ( 2B, D, y F). Todas las barras de error son la SEM. Esta figura modificada de Osmon et al. 1 y reimpreso con el permiso de Mary Ann Liebert Publishers, Inc. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Para todas las pruebas, limpiar y desinfectar la superficie para minimizar los contagios y elementos interactivos de los ratones. También, asegúrese de que los ratones están probando dado suficientes períodos de descanso entre ensayos y comportamiento al usar el OFT, RR y Mt.
La OFT, es crítico que cada ratón se coloca en medio del campo abierto y que el programa se inicia con el lanzamiento del ratón en el centro. Asegúrese de que no hay ningunos movimientos de la mano que los sensores pueden registrar al iniciar el programa.
Para la MT, es importante contar con una barrera entre el área de la malla donde se colgará el ratón y los lados del contenedor están cayendo en. Se ha observado que cuando los ratones pueden llegar al lado del contenedor, liberan lentamente sus patas delanteras y luego la espalda patas para saltar hacia abajo. Grabar una barrera entre las paredes y el centro de la malla, considerablemente reduce este comportamiento y permite una medida más exacta de la fuerza muscular.
Solo, cada una de estas pruebas es una buena medida para locomoción general (prueba de campo abierto), fuerza muscular (test de malla) y coordinación (rotarod)2,7,8. Sin embargo, tomados en conjunto, la colección completa de estas tres pruebas de comportamiento permite la amplia evaluación de locomoción en ratones. Este grupo de pruebas independiente confirma la falta de efectos en el deterioro motor en funcionamiento motor complejo de confusión. La principal limitación de estos métodos es su evaluación general de la locomoción, que es problemático para los déficits muy concretos en el funcionamiento conductual. Además, estas pruebas, como todas las pruebas de comportamiento, están sujetas a cambios en el comportamiento debido a factores estresantes externos, tales como sonido, cambios de temperatura y ciclos de luz. Es prudente mantener un entorno consistente para todos los sujetos de prueba. Esta batería de pruebas de comportamiento se puede ampliar para incluir pruebas para la ataxia y la memoria. Otros métodos para estudiar la fuerza muscular2,8,9 incluyen realización de velocidad constante RR para correlacionar los resultados de la fuerza muscular con la MT. Para la evaluación más específica en la fuerza muscular, coordinación o ataxia, hay agarre fuerza2 y pesos pruebas15 y barra de equilibrio o marcha análisis ensayos2, respectivamente.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a la Fundación de investigación de nueva esperanza por su continuo apoyo y financiación de la investigación. También nos gustaría agradecer a Citi por apoyo financiero parcial para este trabajo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IITC Life Sciences Rotarod with Series 8 computing software | IITC Life Sciences | 755 | |
| Square Open Field 45 x 45 x 40 cm (grey color). Other floor color available: white, black. | Harvard Aparatus (PanLab) | 760190 | |
| Open Field Preconfigured Module | Harvard Aparatus (PanLab) | 760688 | |
| Smart V3.0 Software Platform | Harvard Aparatus (PanLab) | 760681 | |
| Video converter (analog/digital) | Harvard Aparatus (PanLab) | 760262 | |
| Roof fixing sys for camera | Harvard Aparatus (PanLab) | 760277 | |
| Analog Sony Camera & lenseNTSC | Harvard Aparatus (PanLab) | 760505 |
References
- Osmon, K. J., et al. Systemic Gene Transfer of a Hexosaminidase Variant Using an scAAV9.47 Vector Corrects GM2 Gangliosidosis in Sandhoff Mice. Human Gene Therapy. 27 (7), 497-508 (2016).
- Brooks, S. P., Dunnett, S. B. Tests to assess motor phenotype in mice: a user's guide. Nature Reviews, Neuroscience. 10, 519-529 (2009).
- Ma, M., Basso, D. M., Walters, P., Stokes, B. T., Moser, P. Behavioural and histological outcomes following graded spinal cord contusion injury in the C57Bl/6 mouse. Exp. Neurol. 169, 239-254 (2001).
- Menalled, L. B., et al. Early motor dysfunction and striosomal distribution of huntingtin microaggregates in Huntington's disease knock-in mice. J.Neurosci. 22, 8266-8276 (2002).
- Grusser, C., Grusser-Cornehls, U. Improvement in motor performance of Weaver mutant mice following lesion of the cerebellum. Behav. Brain Res. 97, 189-194 (1998).
- De Leonibus, E., et al. Spatial deficits in a mouse model of Parkinson's disease. Psychopharmacology (Berl). 194, 517-525 (2007).
- Morris, M., Koyama, A., Masliah, E., Mucke, L. Tau Reduction Does Not Prevent Motor Deficits in Two Mouse Models of Parkinson's Disease. PLoS ONE. 6 (12), 1-7 (2011).
- Abo-ouf, A., et al. Deletion of tumour necrosis factor-α ameliorates neurodegeneration in Sandhoff disease mice. Human Molecular Genetics. , 1-16 (2013).
- Dumont, M. Behavioral Phenotyping of Mouse Models of Neurodegeneration. Neurodegeneration : Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. 793, 229-237 (2011).
- Cabe, P. A., Tilson, H. A., Mitchell, C. L., Dennis, R. A simple recording grip strength device. Pharmacol. Biochem. 8, 101-102 (1978).
- Barnēoud, P., Loliver, J., Sanger, D., Moser, P. Quantitative motor assessment in FALS mice: a longitudinal study. Neuroreport. 8, 2861-2865 (1997).
- Lui, Y., et al. Mouse model of GM2 activator deficiency manifests cerebellar pathology and motor impairment. Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 8133-8143 (1997).
- Sango, K., et al. Mouse models of Tay-Sachs and Sandhoff diseases differ in neurologic phenotype and ganglioside metabolism. Nature Genetics. 11 (2), 170-176 (1995).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. A rotarod suitable for quantitative measurements of motor inco-ordination in naïve mice. Nauyn-Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 259 (2), 211 (1968).
- Deacon, R. M. J. Measuring the Strength of Mice. Journal of Visualized Experiments JoVE. (76), (2013).
