Summary
Beskrevet her er en iscenesat, adfærdsmæssig screening tilgang, som kan bruges til at screene for forbindelser, der udviser in vivo effektivitet på kognitive og funktionelle motoriske adfærd i transgene musemodeller af β-amyloidose og tauopati. Disse metoder er optimeret til at skærmforbindelser til aktivitet i kort- og arbejdsminneopgaver.
Abstract
Her beskriver vi en trinvis, adfærdsmæssig testmetode, som kan bruges til at screene for forbindelser, der udviser in vivo- effekt på kognitive og funktionelle motoriske adfærd i transgene musemodeller af β-amyloidose og tauopati. Paradigmet indbefatter test for spontan veksling i en Y-labyrint, ny genkendelse af genstande og leddklamring. Disse tests blev valgt fordi de: 1) forhører funktionen af kognitive eller motoriske domæner og det korrelerede neurale kredsløb, der er relevant for den humane sygdomstilstand, 2) har klart definerede endepunkter, 3) har let implementerbare kvalitetskontrolkontroller 4) kan køres i Et moderat gennemløbsformat, og 5) kræver en lille indsats fra efterforskeren. Disse metoder er designet til forskere, der søger at skærmforbindelser til aktivitet i kort- og arbejdsminneopgaver eller funktionelle motoriske adfærd i forbindelse med Alzheimers sygdomsmusimodeller. De metoder, der beskrives her, bruger adfærdstest, som engAlder en række forskellige hjerneområder, herunder hippocampus og forskellige kortikale områder. Undersøgere, der ønsker kognitive tests, der specifikt vurderer kognition medieret af en enkelt hjerneområde, kunne bruge disse teknikker til at supplere andre adfærdstest.
Introduction
Alzheimers sygdom (AD) er en progressiv neurodegenerativ lidelse, der resulterer i svækkende kognitive tilbagegang, der rammer ca. 44 millioner mennesker over hele verden. I øjeblikket er der ingen tilgængelige behandlinger for AD, der er sygdomsmodificerende, understreger det presserende behov for præklinisk opdagelse af nye terapeutiske strategier for denne sygdom. Der er blevet skabt en række forskellige transgene musemodeller, der rekapitulerer forskellige aspekter af AD 1 , 2 , herunder underskud i kognitive domæner forstyrret hos patienter 3 . Disse musemodeller repræsenterer et nyttigt værktøj til at lette effektiv screening in vivo .
Ved vurdering af en forbindelse for potentiel in vivo- effektivitet skal der træffes en trinvis tilgang, der skærmbilleder for effektivitet i passende kognitive domæner og overvåger også adfærd, som kunne påvirke de specifikke endepunkter, der anvendes til enSsess cognition. Mange transgene musemodeller af AD udviser hyperaktivitet og andre adfærd, som kan interferere med en bestemt kognitiv test og forbyde dets anvendelse ved lægemiddel screening 4 . For at en tilgang skal kunne gennemføres i et lægemiddel screeningsmiljø, bør de særlige tests, der anvendes, i det mindste have en moderat gennemgang, have klart definerede endepunkter og en procedure, der kræver minimal indgriben fra efterforskerne. Ved anvendelse af disse kriterier kan adfærdsmæssige skærmbilleder implementeres, som udviser reproducerbarhed, lav intra- og interassay variance og effektstørrelser, der er nødvendige for sammensatte screening. Detaljeret her er de metoder, vi har anvendt til at screene for forbindelser, der er effektive til at mildne de kognitive og motoriske fænotyper, der er til stede i transgene musemodeller af β-amyloidose og tauopati 5 , 6 . De beskrevne metoder er tilpasset fra almindeligt anvendte adfærdsmæssige paradigmer, der er rapporteret i lIteratur 7 med specifikke optimeringer og kontrol af kvalitetskontrol, så de kan anvendes i transgene musemodeller, der er relevante for AD. Denne protokol kan bruges sammen med en lang række dataindsamlings- og analysesystemer og antager, at efterforskeren har et kendskab til den tilknyttede software.
Protocol
Metoderne beskrevet i denne publikation blev gennemgået af den institutionelle dyrepleje- og brugskomité (IACUC) hos Hilltop Laboratory Animals for at sikre korrekt pleje, brug og human behandling af dyr i overensstemmelse med gældende føderale, statslige og lokale love og forskrifter, såsom Som de føderale dyrevelfærdsbestemmelser eller AWR'er (CFR 1985) og folkehelsepolitikken om human pleje og brug af laboratoriedyr eller PHS-politikken (PHS 1996).
1. Generelle retningslinjer for alle adfærdsmæssige vurderinger
- Før enhver dyrehåndtering skal du dække eksisterende burkort med et nyt burkort, der kun angiver den unikke, blinde dyreidentifikator.
BEMÆRK: Undersøgere, der håndterer mus under rutinemæssig forbindelse / placebo dosering, er ikke tilladt at håndtere mus for adfærdsmæssig vurdering. - Dim eller sluk for lyset og juster belysningen, så belysning på gulvet på arenaen eller labyrinten er 30-35 lux.
- FEller undersøgelser, der spænder over flere uger, registrerer legemsvægten ugentligt som en indirekte foranstaltning af det generelle helbred.
BEMÆRK: Yderligere kontrolbesøg på kappekvalitet, kropsholdning, gang og spontan fremdrift kan medtages, hvis mere robust sundhedskontrol er berettiget.
2. Habituerende mus til behandling af efterforskere
- To dage før enhver adfærdstest tester musene til håndtering. Fjern buret fra burstativet og placér det på en plan overflade.
- Fjern låget fra buret. Håndter musen nøjagtigt som den ville blive håndteret under udførelse af den kommende adfærdstest. Placer musen i en cupped hånd over hjemmet buret.
- Mål latensen at springe fra efterforskerens hånd tilbage i hjemmet. Hold mus i maksimalt 5 s.
BEMÆRK: Mus, der udviser latenser på ≥ 2 s, anses for "habituated". Mus, der udviser latenser <2 s under det første forsøg, undergår 2 ekstra habituatioN sessioner den dag. - Har musene 2 på hinanden følgende dage med behandlingsvabituation. Bemærk enhver mus, der ikke er habituated ved udgangen af den 2. dag.
3. Vurdering af rumlig arbejdshukommelse ved at måle spontan veksling i en Y-labyrint 8
- Før første brug rengøres Y-labyrinten grundigt med en ubearbejdet blegemiddel, bakteriedræbende aftørring, 70% EtOH, efterfulgt af dH 2 O 9 . Angiv tydeligt våbenens arme som 'A', 'B' & 'C' eller andre sammenlignelige unikke identifikatorer.
- Inden starten af en testsession skal du indstille dataopsamlingssystemet eller videokameraerne og oprette korrekt sporing af mus i labyrinten. Kalibrere afstanden i labyrinten ved hjælp af optagne videobilleder af en linjal eller et andet objekt med kendt længde.
BEMÆRK: Adfærdsmetoderne i denne procedure vil fungere med en række dataindsamlingssystemer, og forfatterne antager anyoNe udfører denne procedure er dygtig i brugen af deres valgte dataindsamlingssystem. Effektanalyser indikerer at stikprøvestørrelser på 10-15 mus pr. Gruppe er påkrævet for en β ≤0,2. - Fjern buret fra stativet og læg det forsigtigt på et bord i nærheden af Y-labyrinten. Fjern musen fra sit hjem bur og læg den forsigtigt i en arm i Y-labyrinten, der vender mod midten. Har efterforskeren skridt langt nok væk fra labyrinten, så musen ikke kan se efterforskeren.
- Aktivér data- / videooptagelsessystemet umiddelbart efter placeringen af musen i labyrinten.
- Tryk på afspilning og registrer den spontane adfærd for hver mus i en periode på 10 minutter. Når en session er færdig, skal du forsigtigt placere musen tilbage i sit hjemmebure og returnere buret til stativet.
- Rengør labyrinten grundigt mellem hver session med en ubearbejdet blegemiddel, bakteriedræbende aftørring, 70% EtOH, efterfulgt af dH20. Gentag fra trin 3.4 for at vurdere alle mikrofonere.
- Når alle mus har afsluttet udforskningen af Y-labyrinten, analyserer du dataene fra opkøbssystemet eller manuelt scorer videoerne fra sessionerne. En arm indtræden opstår, når alle 4 pote af musen krydser grænsen for den centrale zone og ind i armen og dyrets snoet er orienteret mod armens ende.
BEMÆRK: Endpoints, der skal analyseres, omfatter: Den samlede afstand, der er tilbagelagt i labyrinten, den samlede tilbagelagte afstand inden for hver arm (inklusive den centrale zone), den samlede tid i hver arm (inklusive den centrale zone), det samlede antal armposter, antal Indtastninger foretaget i hver arm, og en sekventiel liste over våben indlagt for at vurdere antallet af foretagne alternativer. - En spontan veksling opstår, når en mus kommer ind i en anden arm af labyrinten i hver af 3 på hinanden følgende armposter. Spontan alternation% beregnes derefter med følgende formel.
BEMÆRK: For eksempel, jegF rækkefølgen af arm entry var: ABCCBABCABC, undersøgeren ville score i alt 6 spontane alternativer (i orden: ABC, CBA, ABC, BCA, CAB, ABC). Med i alt 11 armposter ville den spontane vekselvirkning være 67%. - Gør følgende kvalitetskontrolkontrol for at sikre, at dataene repræsenterer en objektiv vurdering af spontan vekselvirkning.
- Udfør en Pearsons korrelation af spontan veksling% til både den samlede afstandsrejse og antallet af armposter foretaget.
BEMÆRK: Hvis der er en signifikant korrelation af spontan veksling% til begge parametre, skal dataene undersøges nærmere på grund af den potentielle påvirkning af hyperdynamisk bevægelse på det tilsyneladende kognitive endepunkt 10 . - Analyser antallet af indgange i hver arm med en 1-vejs ANOVA-test.
BEMÆRK: Hvis denne analyse er signifikant, vil dette indikere tilstedeværelse af indikatorer i miljøet, der tiltrak mus til et bestemt områdePå labyrinten.
- Udfør en Pearsons korrelation af spontan veksling% til både den samlede afstandsrejse og antallet af armposter foretaget.
4. Vurdering af Intermediate-Term Recognition Memory ved at måle Novel Object Recognition 11 , 12 , 13
- For hver fase af denne test skal du grundigt rense åbent feltarena med en ucentret blegemiddel, bakteriedræbende affald, 70% EtOH efterfulgt af dH20, inden den første gang anvendes.
- En dag forud for objektets eksponering, habituere musene til open field arenaen.
- Inden starten af habituation sessionen skal du oprette dataindsamlingssystemet eller videokameraerne og bekræfte korrekt sporing af mus i labyrinten. Kalibrere afstanden i arenaen ved hjælp af optagne videobilleder af en linjal eller et andet objekt med kendt længde. Marker hjørnerne af arenaen i softwaren for at tillade scoring af positionelle forspændinger.
BEMÆRK: Adfærdsmetoderne i denne procedure vil fungere med en række dataopsamlingssystemerStammer og forfatterne antager, at enhver, der udfører denne procedure, er dygtig i brugen af deres valgte dataindsamlingssystem. Effektanalyser indikerer, at prøvestørrelser på 15-20 mus pr. Gruppe er påkrævet for en β ≤0,2. - Fjern buret fra stativet og læg forsigtigt på et bord i nærheden af arenaen.
- Fjern musen fra hjemmehuset og læg forsigtigt musen i midten af arenaen. Tænd sporingssoftwaren og / eller videooptagelsessystemet umiddelbart efter at musen er kommet ind i arenaen.
- Lad musene frit udforske arenaen i 30 minutter.
BEMÆRK: I denne periode vil efterforskere ikke forstyrre musene. - Efter habituation sessionen placerer mus musen tilbage i deres hjemmebure og rengør arena grundigt med en ucentret blegemiddel, bakteriedræbende tørring, 70% EtOH efterfulgt af dH20.
- Gentag fra trin 4.2.2, indtil alle mus er blevet habitueret til arenaen.
- Efter alle mus har været vaneUated til arenaen, analysere videoen.
BEMÆRK: Endpoints, der skal analyseres, omfatter den samlede afstand, der er tilbagelagt i arenaen og tid brugt i nærheden af hvert hjørne. Hvis det er relevant for musemodellen, er stereotype adfærd inkluderet i disse analyser ( dvs. myoklonisk hjørnespring, cirkling osv. ). Mus, der udviser forspændinger i tiden brugt i bestemte områder af arenaen, er udelukket fra yderligere eksperimenter, da dette vil påvirke objektudforskning.
BEMÆRK: Den første fase af ny genstandsgenkendelse involverer at fortælle mus til en genstand. Heri betegnes denne del af den hidtil ukendte objektgenkendelsesprocedure som prøvefasen. - Inden starten af en prøvefasesession placeres genstande i arenaen og fastgøres dem til gulvet med en monteringspose, så dyr ikke kan bevæge objekterne. Juster to identiske objekter til en bestemt væg med tilstrækkelig afstand mellem væggene og genstande, så musene frit kan udforske objekterne fra al angstles.
- Indstil dataindsamlingssystemet eller videokameraerne og bekræft korrekt sporing af mus og objekter i labyrinten. Kalibrere afstanden i arenaen ved hjælp af optagne videobilleder af en linjal eller et andet objekt med kendt længde.
- Marker hjørnerne af arenaen i softwaren for at tillade scoring af positionelle forspændinger. Markér objekter i software og spor deres eksplorative adfærd separat for hvert objekt ( dvs. "Objekt A" og "Objekt B").
- Fjern buret fra stativet og læg det forsigtigt på et bord i nærheden af arenaen.
- Fjern musen fra hjemmeburen og læg den forsigtigt ind i arenaens centrum mod objekterne.
- Tillad musen at frit udforske objekterne i 15 minutter. I løbet af denne periode forstyrrer ikke musene.
- I slutningen af sessionen skal du forsigtigt placere musen tilbage i sit hjem bur. Rengør arenaen og genstande med 70% EtOH og dH 2 O. Placer disse genstande tilbage i thE arena.
- Gentag trin 4.2.11, indtil alle mus er bekendt med et objekt.
- Når alle mus er blevet fortrolig med et objekt, skal du analysere videoerne.
BEMÆRK: Objektundersøgelser tælles, når følgende kriterier er opfyldt: musen er orienteret mod objektet, snuten er inden for 2 cm af objektet, midterpunktet af dyrets krop er over 2 cm fra objektet og de tidligere kriterier Er blevet opfyldt i mindst 1 s. Desuden, hvis et dyr har opfyldt udforskningskriterierne, men udviser immobilitet i> 10 s, anses det forsøgende forsøg for at være færdigt. - Beregn et objekt bias score for hver mus som følger.
BEMÆRK: Mus, der udviser en objekt-bias-score under 20% eller over 80%, er udelukket fra yderligere forsøg.
- Inden starten af habituation sessionen skal du oprette dataindsamlingssystemet eller videokameraerne og bekræfte korrekt sporing af mus i labyrinten. Kalibrere afstanden i arenaen ved hjælp af optagne videobilleder af en linjal eller et andet objekt med kendt længde. Marker hjørnerne af arenaen i softwaren for at tillade scoring af positionelle forspændinger.
- Den endelige fase af ny genstandsgenkendelse involverer vurdering af sonderende adfærdRettet mod både et nyt og velkendt objekt i miljøet, der her refereres til som testfasen. Denne fase udføres 2-3 timer efter afslutning af prøvefasen.
- Inden starten af en testfasesession placeres genstande i arenaen og fastgør dem til gulvet, så dyrene ikke kan bevæge objekterne.
- Placer objekterne i samme position i arenaen i forhold til prøvefasen 13 .
- Balancer den relative position af nye og kendte objekter på tværs af genotyper og behandlingsgrupper.
- Sørg for, at der er nok afstand mellem væggene og genstande, så musene frit kan udforske objekterne fra alle vinkler.
- Indstil dataindsamlingssystemet og / eller videokameraerne. Bekræft korrekt sporing af mus og objekter i labyrinten. Kalibrere afstande i arenaen ved hjælp af optagne videobilleder af en linjal eller et andet objekt med kendt længde.
- Markér hjørner af arenaen i softwEr at tillade scoring af positionelle forstyrrelser. Markér objekter i software og spor sonderende adfærd for hvert objekt individuelt ( dvs. "Novel" og "Familiar").
- Fjern buret fra stativet og læg det forsigtigt på et bord i nærheden af arenaen.
- Sæt forsigtigt dyrene ind i arenaens centrum mod objekterne. Optag mus, der frit udforsker objekter i 10 minutter.
- Ved afslutningen af testperioden fjerner du mus fra arenaen og placerer mus tilbage i deres hjemmebure. Rengør arenaen og genstande grundigt med en ubearbejdet blegemiddelkludsmiddel, 70% EtOH og dH 2O efter hver session.
- Gentag fra trin 4.4.3, indtil alle dyr er blevet vurderet.
- Når objektudforskning er målt for alle mus, analyseres videoer.
BEMÆRK: Objektundersøgelser tælles, når følgende kriterier er opfyldt: musen er orienteret mod objektet, snuten er inden for 2 cm af objektet, midtpunktet afDyrets krop er over 2 cm fra objektet, og de tidligere kriterier er blevet opfyldt i mindst 1 s. Desuden, hvis et dyr har opfyldt udforskningskriterierne, men udviser immobilitet i> 10 s, anses det forsøgende forsøg for at være færdigt. - Bedøm ny genkendelse af genkendelse ved at sammenligne tid, der bruges til at udforske romanen til kendt objekt. Tre metoder er almindeligt rapporteret i litteraturen.
- Analyser rå tid ved at udforske både nye og velkendte objekter ved hjælp af en gentagen målingstest. Denne metode anvendes bedst, når genotype og / eller behandling ikke påvirker den samlede efterforskningstid.
- Beregn nyheds præference ved hjælp af ligningen:
BEMÆRK: Dette giver den procentdel af tid, der bruges til at udforske det nye objekt i forhold til det samlede tidsforbrug af objekter. Værdier spænder fra 0% (ingen udforskning af nyt objekt) til 100% (kun efterforskning af romanobjektetJect), med en værdi på 50%, der angiver lige tid til at udforske nye og velkendte objekter. - Beregn diskriminationsindeks 11 ved hjælp af ligningen:
BEMÆRK: Dette giver forskellen i den tid, der bruges til at udforske de nye og velkendte objekter i forhold til den samlede tid, der bruges til at udforske objekter. Værdier spænder fra -1 (udforskning kun af det kendte objekt) til +1 (udforskning kun af det nye objekt, med en værdi på 0, der angiver lige tid til at udforske nye og kendte objekter.
- Fjern dyr, der ikke deltager i testsessionen på grund af hyperdynamisk bevægelse eller andre stereotyper, fra betragtning 11 .
BEMÆRK: Kriterier anvendt til fjernelse skal være objektive og bestemmes a priori for musemodellen ( dvs. <5 th percentil for total efterforskningstid og enten> 100 gennemsnitDrej vinkel under test session eller> 50th percentil tid udviser myoklonisk hjørnespring).
- Inden starten af en testfasesession placeres genstande i arenaen og fastgør dem til gulvet, så dyrene ikke kan bevæge objekterne.
5. Vurdering af corticospinalfunktion hos mus med limbinding 14
- Video dokument hele sessionen. Optag videoen ved hjælp af en bærbar håndholdt enhed ( f.eks . Smartphone eller tilsvarende).
BEMÆRK: Effektanalyser indikerer at stikprøvestørrelser på 10-15 mus pr. Gruppe er påkrævet for en β ≤0,2. - Fjern husburet fra stativet og læg det på et bord. Dokumenter dyrets id i videoen før næste trin.
- Fjern forsigtigt musen fra buret og suspender ved halen i 5-10 s. Videoen skal registrere dyrets bag og forpaws mens de er suspenderet.
- Efter at have fanget mindst 5 s af video, skal du placere musen tilbage i sit hjemmebure og returnere buret til stativet.
- Rens bordet. Gentag fra trin 5.2, indtil alle mus er blevet rekord d.
- Resultatlid klatrer fra videoer af mus suspenderet af deres hale på en skala fra 0-4 (se tabel 1 for beskrivelse af scoring). Undersøg videoer af suspenderede mus og tildel derefter en score baseret på følgende kriterier.
- Ingen limklamper. Normal flugtudvidelse. Et bageste lem udviser ufuldstændig spredning og tab af mobilitet. Toes udviser normal splay.
- Begge bagerste lemmer udviser ufuldstændig spredning og tab af mobilitet. Toes udviser normal splay.
- Begge bagerste lemmer udviser clasping med krøllede tæer og uendelighed.
- Forelimbs og baglegemer udviser clasping og krydses, krøllede tæer og umobilitet.
- Alle mus er scoret af 2 uafhængige efterforskere. Enhver mus, hvor de 2 scoringer adskiller sig med mere end 1 point, redigeres igen.
- Scorer, der adskiller sig, er gennemsnitlige.
P_upload / 55523 / 55523table1.jpg "/>
Tabel 1: Beskrivelse af Limb Clasping Scores.
Representative Results
Ældre Tg2576 mus udviser robuste underskud i spontane veksler foretaget i en Y-labyrint 15 , 16 , en fænotype, som kan replikeres ved anvendelse af de her beskrevne fremgangsmåder ( Figur 1A ). Mens der ses en tendens til øgede armposter i disse mus ( figur 1B ), påvirker hyperaktiviteten, der observeres i denne linje af mus, ikke den spontane vekslingshastighed ( figur 1C ). I modsætning hertil synes ældre rTg4510-mus at udvise øget spontan veksling, når de placeres i en Y-labyrint ( Figur 1D ). Dette skyldes ekstrem hyperaktivitet ( Figur 1E ) og stereotypi 10 , som signifikant interfererer med måling af spontan vekselvirkning ( Figur 1F ). Når man først vurderer mus i denne opgave, er det afgørende at sikre, at armindgange og / eller tilbagelagt distance ikke erSignifikant korreleret med den spontane vekslingshastighed.
Forud for vurdering af ny genkendelse af genstande er musene opstillet til arenaen, hvor testen vil blive udført. Under habituationen kan hyperaktivitet ( Figur 2A ) og andre stereotype adfærd relevante for musemodellen vurderes. Under prøvefasen er det kritisk at måle udforskningen af hvert objekt separat, så mus, som udviser signifikante forstyrrelser i sonderende adfærd, kan udelukkes fra yderligere vurdering ( figur 2B , åbne cirkler). Ny genstandsgenkendelse vurderes ved at sammenligne udforskning af et velkendt og nyt objekt og analyseres generelt på tre forskellige måder. Hvis den samlede sonderende tid er sammenlignelig på tværs af genotyper og / eller behandlingsgrupper, kan rå tid på at udforske hvert objekt og en passende gentagen måling test bruges til at bestemme, om der var forskelle i nyt objekt rØkognition ( figur 2C ). Hvis en bestemt musestamme udviser forskelle i total sonderende tid, kan ny genkendelse genkendes ved anvendelse af enten nyhedspræference ( figur 2D ) eller diskriminationsindeks ( figur 2E ).
Limb clasping er en funktionel motor test, der kvantificerer underskud i corticospinal funktion. Limb clasping, som ikke er en kognitiv foranstaltning, observeres i adskillige transgene tau-musemodeller 6 , 17 , 18 , 19 og recapitulerer nogle af de funktionelle motoriske underskud, der observeres i sen-fase-AD-patienter. Suspension af mus ved halen fremkalder et flugt respons ( figur 3A , "0"). Underskud i evnen til at splitte bagbenene og udvide tæerne er scoret ud fra deres sværhedsgrad på en skala fra 0-4 ( Figur 3A). Ved anvendelse af fremgangsmåden beskrevet heri kan man observere signifikant lemmerklamring i rTg4510-mus ( figur 3B ).
Figur 1: Spontan Alternation i Y-labyrinten. ( A ) Når de placeres i en Y-labyrint, anvender mus en tabsforskydningsstrategi, der resulterer i et udforskningsmønster, hvor hver arm udforskes kun én gang for hver 3 armposter. Ældre Tg2576 mus udviser et signifikant underskud i spontan veksling. Ved anvendelse af procedurerne beskrevet i denne metode blev en signifikant genopretning af spontan vekselvirkning observeret efter behandling med en proprietær forbindelse. Data blev analyseret ved anvendelse af 1-vejs ANOVA og post-hoc sammenligninger med Tg-PBS blev udført ved anvendelse af Dunnett's test. ** p <0,01. Fejlstænger angiver SEM. ( B ) Antal armposter var ikke signifikant anderledes end nogenAf de grupper, der blev overvåget i dette forsøg. Data blev analyseret ved anvendelse af 1-vejs ANOVA test. Fejlstænger angiver SEM. ( C ) Der var ingen sammenhæng mellem spontan vekselvirkning og antallet af armindgange lavet, hvilket tyder på, at eventuelle forskelle i spontan lokomotorisk aktivitet ikke påvirker kvantificering af spontan veksling. Korrelationstest blev udført ved anvendelse af Pearsons korrelationsanalyse. ( D ) Når de placeres i en Y-labyrint, synes rTg4510-mus (6 måneder) at udvise signifikant mere spontan vekselvirkning i forhold til littermate WT-mus. Data blev analyseret ved 1-vejs ANOVA, og post-hoc sammenligninger med Tg-PBS blev udført under anvendelse af Dunnett's test. ** p <0,01. Fejlstænger angiver SEM. ( E ) rTg4510 mus gjorde signifikant flere armposter på grund af deres ekstreme hyperdynamiske bevægelse. Data blev analyseret ved 1-vejs ANOVA, og post-hoc sammenligninger med Tg-PBS blev udført under anvendelse af Dunnett's test. *** p <0,001. Fejlstænger angiver SEM. ( F ) Spontan vekslingsadfærd, der er signifikant korreleret med armposter, hvilket indikerer den hyperdynamiske locomotoriske fænotype obskyret ægte spontan vekselvirkning. Korrelationstest blev udført ved anvendelse af Pearsons korrelationsanalyse (r = 0,7, p <0,0001). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Ny genkendelse af genstande. ( A ) Arenavabituation tillader måling af spontan bevægelse og andre stereotype adfærd relevante for en bestemt musemodel. Her udviser alderen Tg2576 mus (22 måneder) signifikant mere spontan lokomotion i forhold til littermate WT mus. Data blev analyseret ved 1-vejs ANOVA og post-hoc sammenligninger til Tg-Veh blev udført under anvendelse af Dunnett 'S test. ** p <0,01. Fejlstænger angiver SEM. ( B ) Under prøvefasen blev sporing af to identiske objekter sporet separat. Mus, der udviser store forspændinger mod udforskning af en af de to objekter (åbne cirkler), blev udelukket fra testfasen. ( C - E ) Nylig genkendelse blev vurderet ved at måle udforskningen af et nyt og kendt objekt. Ny genstandsgenkendelse blev vurderet ved hjælp af ( C ) råt efterforskningstid, ( D ) nyhedspræference eller ( E ) diskriminationsindeks. Data i panel C blev analyseret ved anvendelse af en 2-vejs ANOVA med gentagne foranstaltninger, og parvise sammenligninger blev lavet ved anvendelse af Sidaks test. Data i paneler DE blev analyseret med en 1-vejs ANOVA og post-hoc sammenligninger til Tg-Veh blev fremstillet ved brug af Dunnett's test. * P <0,05, ** p <0,01. Fejlstænger angiver SEM. Klik venligst påHer for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Limb Clasping. ( A ) Repræsentative billeder af mus, der udviser forskellige grader af lemmer, som beskrevet i tabel 1. ( B ) rTg4510-mus (6 måneder) udviser signifikant lemklamring i forhold til littermate WT-mus som scoret ved anvendelse af disse metoder. Data blev analyseret under anvendelse af en 1-vejs ANOVA og post-hoc sammenligninger med Tg-PBS blev udført under anvendelse af Dunnett's test. *** p <0,001, **** p <0,0001. Fejlstænger angiver SEM. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Betydningen af teknikken med respekt for eksisterende metoder
Denne procedure er designet til at screene for in vivo- aktivitet af forbindelser i transgene musemodeller af p-amyloidose og tauopati. Den benyttede fremgangsmåde anvendt her sikrer påvisning af effektive forbindelser i kognitive domæner, der er relevante for AD 3 . Desuden bruger den tilgang, der er beskrevet her, adfærdstests, der har klart definerede endepunkter, let implementerbare kvalitetskontrolkontroller, kan køres i et moderat gennemløbsformat og kræver lidt intervention fra efterforskeren. Disse egenskaber resulterer i analyser, der udviser god reproducerbarhed hos dyr og tværs af kohorter, hvilket resulterer i lave intra- og interassay varians og effektstørrelser (2 ≤ f ≤ 6), som er robuste nok til at understøtte adfærdsmæssig profilering i et lægemiddelopdagelsesmiljø.
Kritiske trin inden for Protocol
Mange musemodeller til brug for AD-lægemiddelforskning udviser adfærd i overensstemmelse med øget angst og aggression. Dette gør håndteringshabituation afgørende for at udføre nogen af de adfærdstest, der beskrives her. Da disse test er afhængige af umotiveret adfærd, kan en grov behandling af efterforskeren på grund af en hyperaktiv og angst eller aggressiv mus betydeligt påvirke ydeevnen. Højere angst kan resultere i manglende udførelse af opgaven, hvilket reducerer testets samlede effekt. Desuden er lysniveauer i arenaen afgørende for at lette den spontane bevægelse, der er nødvendig for hver test. Lyst lys har tendens til at øge angst og undertrykke fremdrift i gnavere, derfor bør man sørge for at justere omgivende lysniveauer til 30-35 lux i arenaen.
Et andet kritisk aspekt af proceduren er minimering af stærke miljøindikatorer, der ville forstyrre et dyrs evne til at udføre opgaverne. Rengøring afArena og genstande mellem kørsler er afgørende, da mus er tiltrukket af nye dufte i miljøet. Manglende grundig rengøring af arenaen og genstande kan resultere i kvældende spontan aktivitet af musen og maskering af ægte kognitiv ydeevne. Undersøgere bør også minimere brugen af personlige hygiejneprodukter og colognes / parfumer, når de udfører disse procedurer. Endelig udviser gnagere robuste daglige og cirkadiske ændringer i mange åbenlyse adfærd 20 herunder læring og hukommelse 21 . For at minimere varians på grund af daglige rytmer i basal adfærd og kognitiv ydeevne, bør alle forsøg udføres på samme tid på dagen på tværs af kohorter og undersøgelser.
Yderligere specifikt med hensyn til ny genkendelse af genstand er forsinkelsesintervallet mellem prøve og testfase og udvælgelse og placering af objekter i miljøet kritiske parametre. Hukommelsen findes i 3 forskellige former: kort sigt memOry (STM), mellemliggende sigtminne (ITM) og langtidshukommelse (LTM) 22 , 23 . Ændring af intervallet mellem prøve og testfaser fra minutter (STM) til timer (ITM) eller dage (LTM) ændrer den type hukommelse, der testes ved proceduren 12 . Desuden bør mange genstande screenes i en testkohort af mus for potentielle forstyrrelser ved udforskning inden kørsel af den nye genstandsgenkendelsestest. Et objekt, der er overdrevent attraktivt eller afstødende for testkohorten, kan ikke bruges ved vurdering af ny genkendelse af genstande. Ideelt vil alle objekter, der vil blive anvendt i testen, placeres i en arena, fremkalde lige efterforskningstider fra en naiv kohort af mus. Utilstrækkelig test og optimering af objekter kan betydeligt reducere kraften i ny genkendelse af genstande.
Ændringer og fejlfinding
Der er flere faktorer, der kan øgeTilsyneladende variabilitet i de kognitive tests, der er beskrevet her. Mange musemodeller af AD udviser hyperdynamisk bevægelse 3, som kan maske eller ændre adfærd målt som det kognitive endepunkt. Derudover er der voksende tegn på, at køn 24 , 25 , 26 og endda moral genotype 27 kan påvirke udvikling og progression af neuropatologi og kognitive fænotyper i AD musemodeller. Uventet variabilitet eller manglende gennemførelse af adfærdsmæssige opgaver kan skyldes nogen af disse faktorer. Når man først gennemfører en bestemt adfærdstest, skal resultaterne altid stratificeres efter køn, alder og, hvis det er relevant, moderens genotype. Endvidere skal de kvalitetskontroller, der skitseres i denne procedure, altid udføres for at sikre, at hyperaktivitet eller anden stereotyp adfærd ikke forstyrrer kvantificering af kognitive endepunkter.
konvolutStrygning kan også påvirke spontane udforskende opførsel af gnavere. Dufte eller lyde, der ikke kan påvises for forskere, kan tiltrække eller afvise mus, skevende resultater af kognitive tests, som er afhængige af spontan adfærd. Når man i første omgang etablerer Y-labyrint eller ny genkendelse af genstand, er det afgørende at udføre kontrolforanstaltningerne for at sikre, at der ikke er positionelle forstyrrelser ved udforskning af genstande og / eller miljø. Hvis der observeres positionelle forstyrrelser, skal forskerne grundigt undersøge miljøet og potentielt justere belysning, arena placering, placering af testrum i forhold til andre rum i anlægget ( dvs. ikke nær et højt trafikområde eller tungt udstyr) og arenarensningsprocedurer.
Habituation til testmiljøet er nøglen til opnåelse af optimal ydeevne i den nye genkendelsesprøve. For eksempel kan lave samlede udforskningstider skyldes utilstrækkelig habituation. Som et alternativ til procUdgaver der skitseres her for håndtering (afsnit 2) og arena (afsnit 4.2) tilpasning, behandling til håndtering og testmiljøet kan udføres som 3, 5 min sessioner om dagen i 2 på hinanden følgende dage.
Begrænsninger af teknikken
Som ved enhver procedure har disse adfærdsmæssige test begrænsninger. Disse procedurer er blevet anvendt, fordi de tester funktionen af forskellige kortikale regioner og hippocampus. Hvis musemodellen ikke udviser funktionelle underskud i hjernegrupper probed af disse tests, vil disse teknikker ikke være nyttige. Desuden har vi valgt kognitive tests, der sondrer korttidshukommelse. Hvis virkningsmekanismen for forbindelsen under præklinisk vurdering ikke forventes at påvirke korttidshukommelsen, skal disse procedurer ændres i overensstemmelse hermed ( dvs. øge prøve-testfaseintervallet for at teste langvarig hukommelse). Endelig bruger disse tests umotiverede adfærd. Derfor, hvis en musemodel er excesSively hyperaktiv eller viser andre stereotype adfærd, der forhindrer efterforskning af miljøet, er disse procedurer måske ikke optimalt. Som et alternativ kunne man bruge frygtkonditionering til Tg2576 eller andre β-amyloidose-musemodeller eller den rumlige vandlabyrette til rTg4510 eller andre musemodeller af tauopati 3 .
Fremtidige applikationer
Når disse procedurer er blevet godkendt i laboratoriet, kan der foretages adskillige modifikationer eller forlængelser for at vurdere yderligere kognitive og funktionelle motoriske foranstaltninger. For eksempel kan du ændre den nye objektgenkendelsesopgave for at bestemme, om en mus kan genkende en ændring i placeringen af et objekt 13 . Alternativt kan man i stedet for at bruge objekter bruge andre mus og gennemføre en test af social anerkendelse. Med hensyn til lemmer og motorfunktion kan man supplere denne test med ledningshængden og / eller grebstyrketesten. TesteneDetaljeret i denne fremgangsmåde danner en fast base til screening for forbindelser, der har in vivo- effektivitet i translationelle musemodeller for AD og kan tilpasses eller modificeres på mange måder for bedst at forhøre en bestemt musemodel eller opfylde behovene hos et unikt lægemiddelopdagelsesprogram .
Disclosures
JM Levenson er ansat af Proclara Biosciences, Inc. C. Miedel, J. Patton, A. Miedel og E. Miedel er ansat hos Hilltop Laboratory Animals.
Acknowledgments
Forfatterne har ingen anerkendelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Topscan Lite-High Throughput | Cleversys | Automated behavioral analysis. Includes cameras and video acquisition system, laptop. | |
| ObjectScan | Cleversys | Software module for accurate object exploration quantification | |
| Open field for mouse | Cleversys | CSI-OF-M | Arena for novel object recognition |
| Y-maze for mouse | Custom | Arms: 30 cm long, 10 cm wide, 20 cm high walls, placed 120 deg apart. | |
| Camera mount for open field | Custom | Custom | 76 cm tall, 115 cm wide, cameras mounted @ 30 cm in from either side. Two mounts, each covers two boxes. |
| Camera mount for Y-maze | Custom | Custom | 76 cm tall, 115 cm wide, cameras mounted @ 30cm in from either side. One mount covers two mazes. |
| Marbles | Inperial Toy | 8565 | Standard (15.5 mm Dia) glass marbles. |
| Dice | Cardinal Industries | 770 | Standard (0.650 inch) white dice with black dots. |
| LOCTITE Fun-Tak | Henkel | B018A3AG0W | Standard blue sticky tak |
| EtOH | Nexeo Solutions | 82452 | 100% Ethanol Diluted to 70% using distilled Water |
| dH2O | Tulpenhocken Spring Water Co. | - | PA D.E.P. #31, NJ D.O.H. #0049, NYSHD Cert. #320 |
| Paper towels | Procter & Gamble | B019DM86LA | Bounty, White |
| Handheld video camera | Apple, Inc. | MKV92LL/A | Acquisition of Limb clasping video, Iphone 6S Plus (or functional equivalent). |
| Gloves | SafePOINT, L.L.C. | GL640-2 | Standard, Powder free Latex Gloves, Medium |
| Light meter | Dr. Meter | LX1330B | Lighting @ the bottom of Open Field= 35 LUX, Lighting @ bottom of Y-Maze= 32 LUX |
| Bleach germicidal wipes | Clorox | Sterilization of equipment during & after use |
References
- Elder, G. A., Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R. Transgenic mouse models of Alzheimer's disease. Mt Sinai J Med. 77 (1), 69-81 (2010).
- Onos, K. D., Sukoff Rizzo, S. J., Howell, G. R., Sasner, M. Toward more predictive genetic mouse models of Alzheimer's disease. Brain Res Bull. 122, 1-11 (2016).
- Webster, S. J., Bachstetter, A. D., Nelson, P. T., Schmitt, F. A., Van Eldik, L. J. Using mice to model Alzheimer's dementia: an overview of the clinical disease and the preclinical behavioral changes in 10 mouse models. Front Genet. 5, 88 (2014).
- Rodgers, S. P., Born, H. A., Das, P., Jankowsky, J. L. Transgenic APP expression during postnatal development causes persistent locomotor hyperactivity in the adult. Mol Neurodegener. 7, 28 (2012).
- Hsiao, K., et al. Correlative memory deficits, Abeta elevation, and amyloid plaques in transgenic mice. Science. 274 (5284), 99-102 (1996).
- Santacruz, K., et al. Tau suppression in a neurodegenerative mouse model improves memory function. Science. 309 (5733), 476-481 (2005).
- Crawley, J. N. What's wrong with my mouse? : behavioral phenotyping of transgenic and knockout mice. 2nd edn. , Wiley-Interscience. (2007).
- Hughes, R. N. The value of spontaneous alternation behavior (SAB) as a test of retention in pharmacological investigations of memory. Neurosci Biobehav Rev. 28 (5), 497-505 (2004).
- Rutala, W. A., Weber, D. J. Guideline for disinfection and sterilization in healthcare facilities. Centers for Disease Control. , (2008).
- Wes, P. D., et al. Tau overexpression impacts a neuroinflammation gene expression network perturbed in Alzheimer's disease. PLoS One. 9 (8), 106050 (2014).
- Ennaceur, A., Delacour, J. A new one-trial test for neurobiological studies of memory in rats. 1: Behavioral data. Behav Brain Res. 31 (1), 47-59 (1988).
- Taglialatela, G., Hogan, D., Zhang, W. R., Dineley, K. T. Intermediate- and long-term recognition memory deficits in Tg2576 mice are reversed with acute calcineurin inhibition. Behav Brain Res. 200 (1), 95-99 (2009).
- DeVito, L. M., Eichenbaum, H. Distinct contributions of the hippocampus and medial prefrontal cortex to the "what-where-when" components of episodic-like memory in mice. Behav Brain Res. 215 (2), 318-325 (2010).
- Lalonde, R., Strazielle, C. Brain regions and genes affecting limb-clasping responses. Brain Res Rev. 67 (1-2), 252-259 (2011).
- King, D. L., Arendash, G. W. Behavioral characterization of the Tg2576 transgenic model of Alzheimer's disease through 19 months. Physiol Behav. 75 (5), 627-642 (2002).
- Lalonde, R., Lewis, T. L., Strazielle, C., Kim, H., Fukuchi, K. Transgenic mice expressing the betaAPP695SWE mutation: effects on exploratory activity, anxiety, and motor coordination. Brain Res. 977 (1), 38-45 (2003).
- Lewis, J., et al. Neurofibrillary tangles, amyotrophy and progressive motor disturbance in mice expressing mutant (P301L) tau protein. Nat Genet. 25 (4), 402-405 (2000).
- Spittaels, K., et al. Prominent axonopathy in the brain and spinal cord of transgenic mice overexpressing four-repeat human tau protein. Am J Pathol. 155 (6), 2153-2165 (1999).
- Terwel, D., et al. Changed conformation of mutant Tau-P301L underlies the moribund tauopathy, absent in progressive, nonlethal axonopathy of Tau-4R/2N transgenic mice. J Biol Chem. 280 (5), 3963-3973 (2005).
- Merrow, M., Spoelstra, K., Roenneberg, T. The circadian cycle: daily rhythms from behaviour to genes. EMBO Rep. 6 (10), 930-935 (2005).
- Smarr, B. L., Jennings, K. J., Driscoll, J. R., Kriegsfeld, L. J. A time to remember: the role of circadian clocks in learning and memory. Behav Neurosci. 128 (3), 283-303 (2014).
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
- Stough, S., Shobe, J. L., Carew, T. J. Intermediate-term processes in memory formation. Curr Opin Neurobiol. 16 (6), 672-678 (2006).
- Stevens, L. M., Brown, R. E. Reference and working memory deficits in the 3xTg-AD mouse between 2 and 15-months of age: a cross-sectional study. Behav Brain Res. 278, 496-505 (2015).
- Yue, X., et al. Brain estrogen deficiency accelerates Abeta plaque formation in an Alzheimer's disease animal model. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (52), 19198-19203 (2005).
- McAllister, C., et al. Genetic targeting aromatase in male amyloid precursor protein transgenic mice down-regulates beta-secretase (BACE1) and prevents Alzheimer-like pathology and cognitive impairment. J Neurosci. 30 (21), 7326-7334 (2010).
- Blaney, C. E., Gunn, R. K., Stover, K. R., Brown, R. E. Maternal genotype influences behavioral development of 3xTg-AD mouse pups. Behav Brain Res. , 40-48 (2013).
