Summary
Здесь описан поэтапный подход к поведенческому скринингу, который может быть использован для скрининга соединений, которые проявляют in vivo эффективность когнитивного и функционального моторного поведения в моделях β-амилоидоза трансгенной мыши и таупатии. Эти методы оптимизированы для скрининга соединений для работы в краткосрочных и рабочих задачах памяти.
Abstract
Здесь мы описываем поэтапный подход к поведенческому тестированию, который можно использовать для скрининга соединений, которые демонстрируют эффективность in vivo в отношении когнитивных и функциональных моторных поведений в моделях β-амилоидоза трансгенной мыши и таупатии. Парадигма включает тесты для спонтанного чередования в Y-лабиринте, распознавании новых объектов и скреплении конечностей. Эти тесты были выбраны потому, что они: 1) опрашивают функцию когнитивных или моторных доменов и коррелируют нейронные цепи, относящиеся к состоянию заболевания человека, 2) имеют четко определенные конечные точки; 3) имеют легко осуществимые проверки контроля качества; 4) могут быть запущены в Умеренный формат пропускной способности и 5) требуют небольшого вмешательства со стороны исследователя. Эти методы предназначены для исследователей, ищущих экранирование соединений для работы в краткосрочных и рабочих задачах памяти, или функциональных моторных поведениях, связанных с моделями мышей болезни Альцгеймера. Методы, описанные здесь, используют поведенческие тесты, которыеВозраст ряда различных областей мозга, включая гиппокамп и различные области коры. Исследователи, которые хотят когнитивных тестов, которые конкретно оценивают познание, опосредованное одним участком мозга, могут использовать эти методы для дополнения других поведенческих тестов.
Introduction
Болезнь Альцгеймера (AD) является прогрессирующим нейродегенеративным заболеванием, приводящим к ослаблению когнитивного расстройства, которое затрагивает примерно 44 миллиона человек во всем мире. В настоящее время нет доступных методов лечения АД, которые являются модификаторами болезни, подчеркивая настоятельную необходимость доклинического открытия новых терапевтических стратегий для этого заболевания. Было создано несколько различных моделей трансгенных мышей, которые повторяют различные аспекты AD 1 , 2 , включая дефициты когнитивных доменов, нарушенных у пациентов 3 . Эти мышиные модели представляют собой полезный инструмент для эффективного скрининга in vivo .
При оценке соединения для потенциальной эффективности in vivo следует использовать поэтапный подход, который обеспечивает эффективность в соответствующих когнитивных областях, а также контролирует поведение, которое может влиять на конкретные конечные точки, используемые дляПознания. Многие модели трансгенных мышей AD проявляют гиперактивность и другие формы поведения, которые могут влиять на определенный когнитивный тест, и запрещают его использование при скрининге лекарств 4 . Более того, для подхода, который должен быть реализован в среде скрининга лекарств, конкретные используемые тесты должны поддерживать по меньшей мере умеренную пропускную способность, иметь четко определенные конечные точки и процедуру, которая требует минимального вмешательства со стороны исследователей. Используя эти критерии, могут быть реализованы поведенческие экраны, которые демонстрируют воспроизводимость, низкие внутри- и межаналитические отклонения и размеры эффекта, необходимые для скрининга соединений. Подробно описаны методы, которые мы использовали для скрининга соединений, эффективных для смягчения когнитивных и моторных фенотипов, присутствующих в моделях β-амилоидоза трансгенной мыши и таупатии 5,6 . Описанные методы адаптированы из общепринятых поведенческих парадигм, описанных в lIterature 7 со специфическими оптимизациями и проверками контроля качества, чтобы они могли использоваться в моделях трансгенных мышей, относящихся к AD. Этот протокол может использоваться с различными системами сбора и анализа данных и предполагает, что исследователь имеет опыт работы с соответствующим программным обеспечением.
Protocol
Методы, подробно описанные в этой публикации, были рассмотрены Комитетом по уходу за животными и их использованием (IACUC) в Hilltop Laboratory Animals для обеспечения надлежащего ухода, использования и гуманного обращения с животными в соответствии с применимыми федеральными, государственными и местными законами и Как федеральные правила по охране животного мира или AWR (CFR 1985), и политика службы здравоохранения по гуманному уходу и использованию лабораторных животных, или PHS Policy (PHS 1996).
1. Общие руководящие принципы для всех поведенческих оценок
- Перед тем, как обращаться с животными, накройте существующие карты клеток новой картой-картой, которая указывает только на уникальный идентификатор слепых животных.
ПРИМЕЧАНИЕ. Исследователям, которые обрабатывают мышей во время обычной дозировки соединения / плацебо, не разрешается манипулировать мышами для оценки поведения. - Потушите или выключите верхние огни и отрегулируйте освещение так, чтобы освещение на полу арены или лабиринта составляло 30-35 люкс.
- FИли исследования, которые охватывают несколько недель, регистрируют вес тела еженедельно в качестве косвенного показателя общего состояния здоровья.
ПРИМЕЧАНИЕ. Дополнительные проверки на клетке по качеству шерсти, позе, походке и спонтанной локомоции могут быть включены, если требуется более надежная проверка здоровья.
2. Принуждение мышей к обращению со стороны следователей
- За два дня до какого-либо поведенческого теста приучите мышей к обработке. Удалите клетку из стойки клетки и поместите ее на ровную поверхность.
- Снимите крышку с клетки. Управляйте мышью точно так, как она будет обрабатываться во время предстоящего поведенческого теста. Поместите мышь в чашевидную руку над домашней клеткой.
- Измерьте задержку, чтобы перейти от руки исследователя обратно в клетку. Удерживайте мышей максимум 5 с.
ПРИМЕЧАНИЕ. Мыши с латентностью ≥2 с считаются «привычными». Мыши с латентностью <2 с в течение первого испытания подвергались еще 2-му методу привыканияN сессий в этот день. - Попросите у мышей пройти 2 последовательных дня лечения. Обратите внимание на любую мышь, которая не привыкла к концу 2 -го дня.
3. Оценка пространственной рабочей памяти путем измерения спонтанного чередования в Y-лабиринте 8
- Перед первым использованием тщательно очистите лабиринт Y с помощью неконцентрированной протирочной салфетки отбеливателя, 70% EtOH, а затем dH 2 O 9 . Четко обозначьте лабиринты лабиринта как «A», «B» и «C» или другие сопоставимые уникальные идентификаторы.
- Перед началом сеанса тестирования установите систему сбора данных или видеокамер и настройте правильное отслеживание мышей в лабиринте. Откалибруйте расстояние в лабиринте, используя захваченные видеоизображения линейки или другого объекта известной длины.
ПРИМЕЧАНИЕ. Поведенческие методы в этой процедуре будут работать с различными системами сбора данных, и авторы предполагают anyoПри выполнении этой процедуры специалист использует выбранную им систему сбора данных. Анализ мощности показывает, что для β ≤ 0,2 требуется размер выборки 10-15 мышей на группу. - Удалите клетку из стойки и аккуратно положите ее на стол в непосредственной близости от Y-лабиринта. Выньте мышь из своей клетки и аккуратно поместите ее в одну руку Y-лабиринта, обращенной к центру. Попросите следователя шагнуть достаточно далеко от лабиринта, чтобы мышь не могла видеть следователя.
- Активируйте систему сбора данных / видео сразу после помещения мыши в лабиринт.
- Нажмите воспроизведение и запишите спонтанное поведение для каждой мыши в течение 10 минут. Как только сессия будет завершена, аккуратно поместите мышь обратно в ее клетку и верните клетку в стойку.
- Тщательно очищайте лабиринт между каждой сессией с помощью неконцентрированной бактерицидной салфетки отбеливателя, 70% EtOH, затем dH 2 O. Повторите процедуру с шага 3.4 для оценки всех микрофонове.
- Как только все мыши завершили исследование Y-лабиринта, проанализируйте данные из системы сбора данных или вручную запишите видео сеансов. Вхождение в руку происходит, когда все 4 лапы мыши пересекают порог центральной зоны и в руку, а морда животного ориентирована к концу руки.
ПРИМЕЧАНИЕ. Конечные точки, которые будут анализироваться, включают в себя: общее расстояние, пройденное в лабиринте, общее расстояние, пройденное внутри каждого плеча (включая центральную зону), общее время, проведенное в каждом плече (включая центральную зону), общее количество ручных операций, количество Записи, сделанные в каждой руке, и последовательный список рук, введенных для оценки количества произведенных чередований. - Самопроизвольное чередование происходит, когда мышь входит в другое плечо лабиринта в каждом из трех последовательных элементов руки. Затем спонтанное чередование% вычисляется по следующей формуле.
ПРИМЕЧАНИЕ. Например, iF порядок ввода руки был: ABCCBABCABC, следователь оценивал в общей сложности 6 спонтанных чередований (по порядку: ABC, CBA, ABC, BCA, CAB, ABC). В общей сложности 11 позиций руки, спонтанное чередование% будет 67%. - Проведите следующие проверки контроля качества, чтобы убедиться, что данные представляют собой объективную оценку спонтанного чередования.
- Выполните корреляцию Пирсона спонтанного чередования% как для общего пройденного расстояния, так и для количества сделанных записей в руке.
ПРИМЕЧАНИЕ. Если имеется значительная корреляция спонтанного изменения% с любым параметром, данные следует дополнительно изучить из-за потенциального влияния гипердинамической локомоции на кажущуюся когнитивную конечную точку 10 . - Проанализируйте количество записей, внесенных в каждую руку с помощью одностороннего теста ANOVA.
ПРИМЕЧАНИЕ. Если этот анализ значителен, то это будет указывать на наличие сигналов в среде, которые привлекают мышей к определенной областиНа лабиринте.
- Выполните корреляцию Пирсона спонтанного чередования% как для общего пройденного расстояния, так и для количества сделанных записей в руке.
4. Оценка памяти промежуточного восприятия путем измерения распознавания новых объектов 11 , 12 , 13
- Для каждой фазы этого испытания тщательно очистите арену открытого поля неконцентрированной бактерицидной салфеткой отбеливателя, 70% EtOH, а затем dH 2 O до начала использования.
- За один день до экспозиции объекта приучите мышей к открытой арене поля.
- Перед началом сеанса привыкания, настройте систему сбора данных или видеокамеры и подтвердите правильное отслеживание мышей в лабиринте. Откалибруйте расстояние на арене, используя захваченные видеоизображения линейки или другого объекта известной длины. Отметьте углы арены в программном обеспечении, чтобы можно было подсчитать позиционные отклонения.
ПРИМЕЧАНИЕ. Поведенческие методы в этой процедуре будут работать с различными системами сбора данныхИ авторы предполагают, что каждый, кто выполняет эту процедуру, хорошо владеет выбранной ими системой сбора данных. Анализ мощности показывает, что для β ≤ 0,2 требуется размер выборки 15-20 мышей на группу. - Удалите клетку из стойки и аккуратно положите на стол в непосредственной близости от арены.
- Удалите мышь из домашней клетки и аккуратно поместите мышь в центр арены. Включите программное обеспечение отслеживания и / или систему видеозаписи сразу после помещения мыши в арену.
- Позвольте мышам свободно исследовать арену в течение 30 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ. В течение этого периода следователи не будут мешать мышам. - После сеанса привыкания помещайте мышей обратно в их домашнюю клетку и тщательно очищайте арену нежирной бактерицидной салфеткой отбеливателя, 70% EtOH, а затем dH 2 O.
- Повторите с шага 4.2.2, пока все мыши не привыкли к арене.
- Ведь мыши были привычкойПроанализируйте видео.
ПРИМЕЧАНИЕ. Конечные точки для анализа включают общее расстояние, пройденное на арене, и время, проведенное возле каждого угла. Если это относится к модели мыши, в эти анализы включаются стереотипные поведения ( т . Е. Миоклонические прыжки в угол, кружение и т . Д.). Мыши, проявляющие предубеждения во времени, проведенном в определенных регионах арены, исключаются из дальнейших экспериментов, поскольку это будет влиять на исследование объекта.
ПРИМЕЧАНИЕ. Первая фаза распознавания новых объектов включает знакомство с объектом. Здесь эта часть новой процедуры распознавания объектов будет упоминаться как фаза выборки. - Перед началом сеанса пробной фазы поместите объекты на арену и закрепите их на полу с помощью монтажной замазки, чтобы животные не могли перемещать объекты. Выровняйте два идентичных объекта с определенной стеной с достаточным расстоянием между стенами и объектами, чтобы мыши могли свободно исследовать объекты со всех угловле.
- Настройте систему сбора данных или видеокамер и подтвердите правильное отслеживание мышей и объектов в лабиринте. Откалибруйте расстояния на арене, используя захваченные видеоизображения линейки или другого объекта известной длины.
- Отметьте углы арены в программном обеспечении, чтобы можно было подсчитать позиционные отклонения. Отметить объекты в программном обеспечении и отслеживать их исследовательское поведение отдельно для каждого объекта ( т.е. «Объект A» и «Объект B»).
- Удалите клетку из стойки и аккуратно положите ее на стол в непосредственной близости от арены.
- Удалите мышь из домашней клетки и аккуратно поместите ее в центр арены, лицом к объектам.
- Позвольте мыши свободно исследовать объекты в течение 15 мин. В течение этого периода не беспокоить мышей.
- В конце сеанса аккуратно поместите мышь обратно в ее клетку. Очистите арену и объекты с помощью 70% EtOH и dH 2 O. Поместите эти предметы обратно в thЭлектронной арене.
- Повторите шаг 4.2.11, пока все мыши не познакомятся с объектом.
- Как только все мыши были ознакомлены с объектом, проанализируйте видео.
ПРИМЕЧАНИЕ. Исследования объектов подсчитываются при соблюдении следующих критериев: мышь ориентирована на объект, рыло находится в пределах 2 см от объекта, средняя точка тела животного находится за 2 см от объекта, а предыдущие критерии Были выполнены не менее 1 с. Кроме того, если животное удовлетворяет критериям исследования, но проявляет неподвижность в течение> 10 с, то поисковый бой считается законченным. - Рассчитайте оценку смещения объекта для каждой мыши следующим образом.
ПРИМЕЧАНИЕ. Мыши, у которых показатель смещения объектов ниже 20% или выше 80%, исключаются из дальнейшего эксперимента.
- Перед началом сеанса привыкания, настройте систему сбора данных или видеокамеры и подтвердите правильное отслеживание мышей в лабиринте. Откалибруйте расстояние на арене, используя захваченные видеоизображения линейки или другого объекта известной длины. Отметьте углы арены в программном обеспечении, чтобы можно было подсчитать позиционные отклонения.
- Заключительный этап нового распознавания объектов включает в себя оценку исследовательского поведенияНаправленный как на новый, так и на знакомый объект в окружающей среде, называемый здесь этапом тестирования. Эта фаза проводится через 2-3 часа после завершения фазы образца.
- Перед началом сеанса тестовой фазы поместите объекты на арену и закрепите их на полу так, чтобы животные не могли перемещать объекты.
- Поместите объекты в одну и ту же позицию на арену относительно фазы 13 выборки.
- Балансируйте относительное положение новых и знакомых объектов в генотипах и группах лечения.
- Обеспечьте достаточное расстояние между стенами и объектами, чтобы мыши могли свободно исследовать объекты со всех сторон.
- Настройте систему сбора данных и / или видеокамер. Подтвердите правильное отслеживание мышей и объектов в лабиринте. Откалибруйте расстояния на арене, используя захваченные видеоизображения линейки или другого объекта известной длины.
- Отметить углы арены в программном обеспеченииДолжны допускать скоринг позиционных смещений. Отмечайте объекты в программном обеспечении и отслеживайте поведение для каждого объекта отдельно ( например , «Роман» и «Знакомый»).
- Удалите клетку из стойки и аккуратно положите ее на стол в непосредственной близости от арены.
- Осторожно поместите животных в центр арены, лицом к объектам. Запись мышей свободно исследовать объекты в течение 10 мин.
- В конце тестового сеанса удалите мышей с арены и поместите мышей обратно в их клетку. Тщательно очистите арену и предметы с неотбеленной бактерицидной салфеткой отбеливателя, 70% EtOH и dH 2 O после каждого сеанса.
- Повторите с шага 4.4.3, пока все животные не будут оценены.
- Как только исследование объекта измеряется для всех мышей, видео анализируется.
ПРИМЕЧАНИЕ. Исследования объектов подсчитываются при соблюдении следующих критериев: мышь ориентирована на объект, рыло находится в пределах 2 см от объекта, в серединеТело животного находится за 2 см от объекта, а предыдущие критерии выполнены в течение по крайней мере 1 с. Кроме того, если животное удовлетворяет критериям исследования, но проявляет неподвижность в течение> 10 с, то поисковый бой считается законченным. - Оцените новое распознавание объектов, сравнивая время, потраченное на изучение романа, на знакомый объект. В литературе часто упоминаются три метода.
- Проанализируйте сырое время, потраченное на изучение как новых, так и знакомых объектов, используя тест повторяющихся измерений. Этот метод лучше всего использовать, когда генотип и / или лечение не влияют на общее время исследования.
- Рассчитайте новизну предпочтения, используя уравнение:
ПРИМЕЧАНИЕ. Это обеспечивает процент времени, затраченного на исследование нового объекта, относительно общего времени исследования объектов. Значения варьируются от 0% (без исследования нового объекта) до 100% (исследование только нового обрезаJect), со значением 50%, указывающим равное время, потраченное на исследование новых и знакомых объектов. - Вычислить индекс дискриминации 11 , используя уравнение:
ПРИМЕЧАНИЕ. Это дает разницу во времени, потраченном на изучение новых и знакомых объектов по сравнению с общим временем, потраченным на исследование объектов. Значения варьируются от -1 (исследование только знакомого объекта) до +1 (исследование только нового объекта со значением 0, указывающим равное время, потраченное на исследование новых и знакомых объектов.
- Удалите животных, которые не участвуют в испытательном сеансе из-за гипердинамической локомоции или других стереотипов, из рассмотрения 11 .
ПРИМЕЧАНИЕ. Критерии, используемые для удаления, должны быть объективными и определяться априорно для модели мыши ( то есть <5 -й процентили для общего времени исследования и либо> 100 среднихУгол поворота во время сеанса тестирования или> 50 -й процентиль времени, демонстрирующий миоклонический прыжок в угол).
- Перед началом сеанса тестовой фазы поместите объекты на арену и закрепите их на полу так, чтобы животные не могли перемещать объекты.
5. Оценка кортикоспинальной функции у мышей с защемлением конечностей 14
- Видео документирует весь сеанс. Запишите видео с помощью портативного переносного устройства ( например , смартфона или аналогичного устройства).
ПРИМЕЧАНИЕ. Анализ мощности показывает, что для β ≤ 0,2 требуется размер выборки 10-15 мышей на группу. - Удалите клетку из стойки и поместите ее на стол. Документируйте идентификатор животного в видео до следующего шага.
- Аккуратно вытащите мышь из клетки и подвешите хвостом в течение 5-10 с. Видео должно записывать задние лапы и передние лапы животного при приостановке.
- После съемки по крайней мере 5 секунд видео, верните мышь обратно в ее клетку и верните клетку в стойку.
- Почистить стол. Повторите с шага 5.2, пока все мыши не будут записаны д.
- Оценка конечности с помощью видеороликов мышей, подвешенных на хвосте по шкале от 0 до 4 (см. Таблицу 1 для описания выигрыша). Изучите видеоролики приостановленных мышей, а затем присвойте оценку на основе следующих критериев.
- Нет обхвата конечностей. Нормальное расширение для эвакуации. Одна задняя конечность обнаруживает неполную потерю и потерю подвижности. Пальцы показывают нормальный разрез.
- Обе задние конечности демонстрируют неполную силу и потерю подвижности. Пальцы показывают нормальный разрез.
- Обе задние конечности демонстрируют складки с загнутыми пальцами и неподвижность.
- Передние конечности и задние конечности демонстрируют складки и скрещены, скрученные пальцы ног и неподвижность.
- Все мыши оцениваются двумя независимыми исследователями. Любую мышь, в которой 2 балла отличаются более чем на 1 очко, снова восстанавливается.
- Оценки, которые отличаются, усредняются.
P_upload / 55523 / 55523table1.jpg "/>
Таблица 1: Описание показателей конечности.
Representative Results
У пожилых мышей Tg2576 наблюдаются устойчивые нарушения в спонтанном чередовании, сделанные в лабиринте Y-лабиринт 15 , 16 , фенотип, который может быть реплицирован с использованием методов, подробно описанных здесь ( рисунок 1A ). Несмотря на то, что у этих мышей наблюдалась тенденция к увеличению введений в руку ( рис. 1В ), гиперактивность, наблюдаемая у этой линии мышей, не влияла на скорость спонтанного чередования ( рис. 1С ). Напротив, у старых мышей rTg4510, по-видимому, наблюдается повышенное спонтанное чередование при размещении в Y-лабиринте ( рис. 1D ). Это связано с крайней гиперактивностью ( рис. 1E ) и стереотипией 10 , что значительно мешает измерению спонтанного чередования ( рис. 1F ). При первоначальной оценке мышей в этой задаче крайне важно убедиться, что входы рук и / или пройденное расстояние не являютсяЗначительно коррелировал со скоростью спонтанного чередования.
Перед оценкой распознавания новых объектов мышей приучают к арене, где будет проводиться тест. Во время привыкания можно оценить гиперактивность ( рисунок 2A ) и другие стереотипные поведения, относящиеся к мышиной модели. Во время выборки очень важно измерить разведку каждого объекта отдельно, чтобы мышам, которые демонстрировали значительные отклонения в исследовательском поведении, можно было исключить из дальнейшей оценки ( рис. 2В , открытые круги). Новое распознавание объектов оценивается путем сравнения исследования знакомого и нового объекта и обычно анализируется тремя различными способами. Если полное исследовательское время сопоставимо по генотипам и / или группам лечения, тогда необработанное время, исследующее каждый объект, и соответствующие тесты с повторными измерениями могут использоваться для определения наличия различий в новом объекте r( Рис. 2С ). Если конкретный штамм мыши обнаруживает различия в общем исследовательском времени, новое распознавание объекта можно оценить с использованием либо предпочтения новизны ( рис. 2D ), либо индекса дискриминации ( рисунок 2E ).
Закрепление конечности является функциональным моторным тестом, который количественно определяет дефицит кортикоспинальной функции. Обхват конечности, который не является когнитивной мерой, наблюдается у нескольких трансгенных моделей мышей-тау 6 , 17 , 18 , 19 и повторяет некоторые функциональные двигательные дефициты, наблюдаемые у пациентов поздней стадии БА. Подвеска мышей хвостом вызывает отклик на побег ( рис. 3А , «0»). Недостатки в способности раздвигать задние конечности и расширять пальцы ног оцениваются по степени тяжести по шкале от 0 до 4 ( рис. 3).А). Используя описанную здесь методику, можно наблюдать значительную фиксацию конечности у мышей rTg4510 ( фиг. 3B ).
Рисунок 1: Спонтанное чередование в Y-лабиринте. ( A ) Когда мы помещаемся в Y-лабиринт, мыши применяют стратегию поиска потерянного сдвига, которая приводит к шаблону исследования, при котором каждая рука исследуется только один раз для каждых 3-х позиций руки. У пожилых мышей Tg2576 наблюдается значительный дефицит спонтанного чередования. Используя процедуры, описанные в этом методе, значительное восстановление спонтанного чередования наблюдалось после обработки патентованным соединением. Данные анализировали с использованием однофакторного дисперсионного анализа и послеоперационные сравнения с Tg-PBS проводили с использованием теста Даннетта. ** p <0,01. Полосы ошибок показывают SEM. ( B ) Количество записей рук не было существенноИз групп, контролируемых в этом эксперименте. Данные анализировали с использованием однофакторного теста ANOVA. Полосы ошибок показывают SEM. ( C ) Не было никакой корреляции между спонтанным чередованием и количеством сделанных записей руки, что указывает на то, что любые различия в спонтанной двигательной активности не влияют на количественное определение спонтанного чередования. Корреляционный тест проводили с использованием корреляционного анализа Пирсона. ( D ) Когда мы помещаем в Y-лабиринт, у мышей rTg4510 (6 месяцев) наблюдается значительно более спонтанное чередование мышей с мышами-однолетниками. Данные анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа и сравнивали с Tg-PBS с помощью теста Dunnett. ** p <0,01. Полосы ошибок показывают SEM. ( E ) Мыши rTg4510 сделали значительно больше входов в руки из-за их экстремальной гипердинамической подвижности. Данные анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа и сравнивали с Tg-PBS с помощью теста Dunnett. *** p <0,001. Полосы ошибок указывают на SEM. ( F ) Спонтанное чередование поведения достоверно коррелировало с записями рук, что указывает на гипердинамический локомоторный фенотип, скрывающий истинное спонтанное чередование. Корреляционное испытание проводили с использованием корреляционного анализа Пирсона (r = 0,7, p <0,0001). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Новое распознавание объектов. ( A ) Привычка Арены позволяет измерять спонтанную локомоцию и другие стереотипные поведения, относящиеся к конкретной модели мыши. Здесь у старых Tg2576 мышей (22 месяца) наблюдалось значительно более спонтанное передвижение по сравнению с мышами-одноплодными мышами. Данные анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа и послеоперационные сравнения с Tg-Veh проводили с использованием Dunnett 'S. ** p <0,01. Полосы ошибок показывают SEM. ( B ) На этапе выборки исследование двух одинаковых объектов отслеживалось отдельно. Мыши, которые демонстрируют большие уклоны к исследованию одного из двух объектов (открытых кругов), были исключены из тестовой фазы. ( C - E ) Признание нового объекта оценивалось путем измерения исследования нового и знакомого объекта. Новое распознавание объектов оценивали с использованием ( C ) времени исследования сырья, ( D ) предпочтения новизны или ( E ). Данные на панели С анализировали с использованием двухфакторного дисперсионного анализа с повторными измерениями и проводили парные сравнения с использованием теста Сидака. Данные в панелях DE анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа и сравнивали с Tg-Veh после испытаний с использованием теста Даннетта. * Р <0,05, ** р <0,01. Полосы ошибок показывают SEM. Пожалуйста, нажмитеЗдесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Закрепление конечности. ( A ) Характерные изображения мышей с различными степенями защемления конечностей, как описано в таблице 1. ( B ) Мыши rTg4510 (6 месяцев) демонстрируют значительную фиксацию конечности по отношению к мышам-пометам, полученным с помощью мышей, с использованием этих методов. Данные анализировали с использованием однофакторного дисперсионного анализа и послеоперационных сравнений с Tg-PBS проводили с использованием теста Даннетта. *** p <0,001, **** p <0,0001. Полосы ошибок показывают SEM. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
Значение техники в отношении существующих методов
Эта процедура была разработана для скрининга in vivo активности соединений в моделях β-амилоидоза трансгенной мыши и таупатии. Поэтапный подход, используемый здесь, обеспечивает обнаружение эффективных соединений в когнитивных доменах, имеющих отношение к AD 3 . Более того, подход, описанный здесь, использует тесты поведения, которые имеют четко определенные конечные точки, легко реализуемые проверки контроля качества, могут выполняться в умеренном формате пропускной способности и не требуют вмешательства со стороны исследователя. Эти характеристики приводят к исследованиям, которые демонстрируют хорошую воспроизводимость у животных и в когортах, что приводит к низкой дисперсии и размерам внутри- и межпроцедурного анализа (2 ≤ f ≤ 6 ), которые достаточно устойчивы, чтобы поддерживать поведенческое профилирование в среде обнаружения лекарств.
Критические шаги в Protocol
Многие мышиные модели, используемые для открытия лекарств AD, демонстрируют поведение, соответствующее повышенной тревожности и агрессии. Это делает использование привыкания необходимым для выполнения любого из описанных здесь тестов поведения. Поскольку эти тесты основаны на немотивированном поведении, грубое обращение исследователя из-за гиперактивной и тревожной или агрессивной мыши может существенно повлиять на производительность. Повышенная тревожность может привести к неспособности выполнить задачу, уменьшая общую силу теста. Кроме того, уровни освещенности на арене необходимы для того, чтобы облегчить спонтанную локомоцию, необходимую для каждого теста. Яркий свет, как правило, усиливает беспокойство и подавляет двигательную активность у грызунов, поэтому следует принять меры для регулировки уровня освещенности до 30-35 люкс на арене.
Другим критическим аспектом процедуры является минимизация сильных экологических сигналов, которые могли бы помешать способности животного выполнять задачи. ОчисткаАрене и объектах в промежутках между прогонами очень важно, поскольку мышей привлекают новые ароматы в окружающей среде. Невозможность тщательно очистить арену и объекты может привести к искажению спонтанной активности мыши и маскировке истинной познавательной способности. Следователи также должны минимизировать использование продуктов личной гигиены и одеколонов / парфюмерии при выполнении этих процедур. Наконец, грызуны демонстрируют сильные суточные и суточные изменения во многих открытых проявлениях 20, включая обучение и память 21 . Поэтому, чтобы минимизировать дисперсию из-за суточных ритмов в базальном поведении и когнитивной деятельности, все тесты должны проводиться в одно и то же время суток в когортах и исследованиях.
Кроме того, в частности, в отношении нового распознавания объектов, критическим параметром является интервал задержки между выборкой и тестовой фазой, а также выбор и размещение объектов в среде. Память существует в 3 различных формах: краткосрочная memOry (STM), промежуточной памяти (ITM) и долговременной памяти (LTM) 22 , 23 . Изменение интервала между выборкой и фазами тестирования от минут (STM) до часов (ITM) или дней (LTM) изменит тип памяти, проверенной процедурой 12 . Более того, перед запуском нового теста распознавания объектов многие объекты должны быть проверены в тестовой когорте мышей для потенциальных уклонов в исследовании. Объект, который является чрезмерно привлекательным или отталкивающим для испытуемой когорты, не может использоваться при оценке нового распознавания объектов. В идеале все объекты, которые будут использоваться в тесте, когда они помещены на арену, будут вызывать равное время исследования у наивной когорты мышей. Неадекватное тестирование и оптимизация объектов могут значительно снизить возможности распознавания новых объектов.
Модификации и устранение неполадок
Существует несколько факторов, которые могут увеличитьКажущуюся вариабельность описанных здесь когнитивных тестов. Многие мышиные модели AD демонстрируют гипердинамическую локомоцию 3, которая может маскировать или изменять поведение, измеряемое как когнитивная конечная точка. Более того, все больше доказательств того, что секс 24 , 25 , 26 и даже материнский генотип 27 могут влиять на развитие и прогрессирование невропатологии и когнитивных фенотипов в моделях мышей AD. Неожиданная изменчивость или невозможность реализации поведенческой задачи может быть вызвана любым из этих факторов. При первом внедрении определенного поведенческого теста результаты всегда должны быть стратифицированы по полу, возрасту и, если применимо, материнскому генотипу. Кроме того, проверки качества, изложенные в этой процедуре, всегда должны выполняться для обеспечения того, чтобы гиперактивность или другие стереотипные поведения не мешали количественной оценке когнитивных конечных точек.
EnvГлажение может также влиять на спонтанное исследовательское поведение грызунов. Запахи или звуки, которые не поддаются обнаружению у исследователей, могут притягивать или отталкивать мышей, искажая результаты когнитивных тестов, которые полагаются на спонтанное поведение. При первоначальном установлении Y-лабиринта или распознавании нового объекта важно выполнение контрольных мер для обеспечения отсутствия позиционных смещений при исследовании объектов и / или окружающей среды. Если наблюдаются позиционные отклонения, следователи должны тщательно исследовать окружающую среду и, возможно, отрегулировать освещение, размещение арены, расположение испытательной комнаты относительно других помещений на объекте ( т.е. не вблизи зоны интенсивного трафика или тяжелого оборудования) и процедур уборки арены.
Привыкание к среде тестирования является ключом к достижению оптимальной производительности в новом тесте распознавания объектов. Например, низкие общие сроки исследования могут быть вызваны неадекватным привыканием. В качестве альтернативы процессуМетоды, описанные здесь для обработки (раздел 2) и арена (раздел 4.2), привыкание к обработке и окружающая среда могут быть выполнены в виде 3, 5-минутных сеансов в день в течение двух последовательных дней.
Ограничения техники
Как и в любой процедуре, эти поведенческие тесты имеют ограничения. Эти процедуры были применены, потому что они проверяют функцию различных областей коры и гиппокампа. Если модель мыши не обнаруживает функционального дефицита в областях мозга, исследованных этими тестами, то эти методы не будут полезными. Более того, мы выбрали когнитивные тесты, которые исследуют кратковременную память. Если предполагается, что механизм действия соединения при доклинической оценке не влияет на кратковременную память, то эти процедуры должны быть соответствующим образом модифицированы ( т . Е. Увеличивать интервал фазы тестирования образца для проверки долговременной памяти). Наконец, эти тесты используют немотивированное поведение. Поэтому, если модель мышиГиперактивны или отображают другие стереотипные поведения, препятствующие исследованию окружающей среды, тогда эти процедуры могут быть не оптимальными. В качестве альтернативы можно использовать кондиционирование страха для Tg2576 или других моделей мышей β-амилоидоза или пространственного водного лабиринта для rTg4510 или других моделей мышей таупатии 3 .
Будущие приложения
После того, как эти процедуры были успешно приняты в лаборатории, могут быть сделаны несколько модификаций или расширений для оценки дополнительных когнитивных и функциональных двигательных мер. Например, изменение новой задачи распознавания объектов, чтобы определить, может ли мышь распознать изменение в размещении объекта 13 . В качестве альтернативы вместо использования объектов можно использовать других мышей и внедрить тест социального признания. Что касается сгибания конечностей и двигательной функции, можно было бы дополнить этот тест с помощью тестов на провисновение и / или сжатие проводов. ТестыПодробно описанные в этом методе, образуют прочную основу для скрининга соединений, которые обладают in vivo эффективностью в моделях трансляционной мыши для AD, и могут быть адаптированы или модифицированы многими способами, чтобы наилучшим образом опрашивать конкретную модель мыши или отвечать потребностям уникальной программы обнаружения лекарств ,
Disclosures
JM Levenson работает в Proclara Biosciences, Inc. C. Miedel, J. Patton, A. Miedel и E. Miedel работают в лаборатории Hilltop Laboratory Animals.
Acknowledgments
У авторов нет подтверждений.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Topscan Lite-High Throughput | Cleversys | Automated behavioral analysis. Includes cameras and video acquisition system, laptop. | |
| ObjectScan | Cleversys | Software module for accurate object exploration quantification | |
| Open field for mouse | Cleversys | CSI-OF-M | Arena for novel object recognition |
| Y-maze for mouse | Custom | Arms: 30 cm long, 10 cm wide, 20 cm high walls, placed 120 deg apart. | |
| Camera mount for open field | Custom | Custom | 76 cm tall, 115 cm wide, cameras mounted @ 30 cm in from either side. Two mounts, each covers two boxes. |
| Camera mount for Y-maze | Custom | Custom | 76 cm tall, 115 cm wide, cameras mounted @ 30cm in from either side. One mount covers two mazes. |
| Marbles | Inperial Toy | 8565 | Standard (15.5 mm Dia) glass marbles. |
| Dice | Cardinal Industries | 770 | Standard (0.650 inch) white dice with black dots. |
| LOCTITE Fun-Tak | Henkel | B018A3AG0W | Standard blue sticky tak |
| EtOH | Nexeo Solutions | 82452 | 100% Ethanol Diluted to 70% using distilled Water |
| dH2O | Tulpenhocken Spring Water Co. | - | PA D.E.P. #31, NJ D.O.H. #0049, NYSHD Cert. #320 |
| Paper towels | Procter & Gamble | B019DM86LA | Bounty, White |
| Handheld video camera | Apple, Inc. | MKV92LL/A | Acquisition of Limb clasping video, Iphone 6S Plus (or functional equivalent). |
| Gloves | SafePOINT, L.L.C. | GL640-2 | Standard, Powder free Latex Gloves, Medium |
| Light meter | Dr. Meter | LX1330B | Lighting @ the bottom of Open Field= 35 LUX, Lighting @ bottom of Y-Maze= 32 LUX |
| Bleach germicidal wipes | Clorox | Sterilization of equipment during & after use |
References
- Elder, G. A., Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R. Transgenic mouse models of Alzheimer's disease. Mt Sinai J Med. 77 (1), 69-81 (2010).
- Onos, K. D., Sukoff Rizzo, S. J., Howell, G. R., Sasner, M. Toward more predictive genetic mouse models of Alzheimer's disease. Brain Res Bull. 122, 1-11 (2016).
- Webster, S. J., Bachstetter, A. D., Nelson, P. T., Schmitt, F. A., Van Eldik, L. J. Using mice to model Alzheimer's dementia: an overview of the clinical disease and the preclinical behavioral changes in 10 mouse models. Front Genet. 5, 88 (2014).
- Rodgers, S. P., Born, H. A., Das, P., Jankowsky, J. L. Transgenic APP expression during postnatal development causes persistent locomotor hyperactivity in the adult. Mol Neurodegener. 7, 28 (2012).
- Hsiao, K., et al. Correlative memory deficits, Abeta elevation, and amyloid plaques in transgenic mice. Science. 274 (5284), 99-102 (1996).
- Santacruz, K., et al. Tau suppression in a neurodegenerative mouse model improves memory function. Science. 309 (5733), 476-481 (2005).
- Crawley, J. N. What's wrong with my mouse? : behavioral phenotyping of transgenic and knockout mice. 2nd edn. , Wiley-Interscience. (2007).
- Hughes, R. N. The value of spontaneous alternation behavior (SAB) as a test of retention in pharmacological investigations of memory. Neurosci Biobehav Rev. 28 (5), 497-505 (2004).
- Rutala, W. A., Weber, D. J. Guideline for disinfection and sterilization in healthcare facilities. Centers for Disease Control. , (2008).
- Wes, P. D., et al. Tau overexpression impacts a neuroinflammation gene expression network perturbed in Alzheimer's disease. PLoS One. 9 (8), 106050 (2014).
- Ennaceur, A., Delacour, J. A new one-trial test for neurobiological studies of memory in rats. 1: Behavioral data. Behav Brain Res. 31 (1), 47-59 (1988).
- Taglialatela, G., Hogan, D., Zhang, W. R., Dineley, K. T. Intermediate- and long-term recognition memory deficits in Tg2576 mice are reversed with acute calcineurin inhibition. Behav Brain Res. 200 (1), 95-99 (2009).
- DeVito, L. M., Eichenbaum, H. Distinct contributions of the hippocampus and medial prefrontal cortex to the "what-where-when" components of episodic-like memory in mice. Behav Brain Res. 215 (2), 318-325 (2010).
- Lalonde, R., Strazielle, C. Brain regions and genes affecting limb-clasping responses. Brain Res Rev. 67 (1-2), 252-259 (2011).
- King, D. L., Arendash, G. W. Behavioral characterization of the Tg2576 transgenic model of Alzheimer's disease through 19 months. Physiol Behav. 75 (5), 627-642 (2002).
- Lalonde, R., Lewis, T. L., Strazielle, C., Kim, H., Fukuchi, K. Transgenic mice expressing the betaAPP695SWE mutation: effects on exploratory activity, anxiety, and motor coordination. Brain Res. 977 (1), 38-45 (2003).
- Lewis, J., et al. Neurofibrillary tangles, amyotrophy and progressive motor disturbance in mice expressing mutant (P301L) tau protein. Nat Genet. 25 (4), 402-405 (2000).
- Spittaels, K., et al. Prominent axonopathy in the brain and spinal cord of transgenic mice overexpressing four-repeat human tau protein. Am J Pathol. 155 (6), 2153-2165 (1999).
- Terwel, D., et al. Changed conformation of mutant Tau-P301L underlies the moribund tauopathy, absent in progressive, nonlethal axonopathy of Tau-4R/2N transgenic mice. J Biol Chem. 280 (5), 3963-3973 (2005).
- Merrow, M., Spoelstra, K., Roenneberg, T. The circadian cycle: daily rhythms from behaviour to genes. EMBO Rep. 6 (10), 930-935 (2005).
- Smarr, B. L., Jennings, K. J., Driscoll, J. R., Kriegsfeld, L. J. A time to remember: the role of circadian clocks in learning and memory. Behav Neurosci. 128 (3), 283-303 (2014).
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
- Stough, S., Shobe, J. L., Carew, T. J. Intermediate-term processes in memory formation. Curr Opin Neurobiol. 16 (6), 672-678 (2006).
- Stevens, L. M., Brown, R. E. Reference and working memory deficits in the 3xTg-AD mouse between 2 and 15-months of age: a cross-sectional study. Behav Brain Res. 278, 496-505 (2015).
- Yue, X., et al. Brain estrogen deficiency accelerates Abeta plaque formation in an Alzheimer's disease animal model. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (52), 19198-19203 (2005).
- McAllister, C., et al. Genetic targeting aromatase in male amyloid precursor protein transgenic mice down-regulates beta-secretase (BACE1) and prevents Alzheimer-like pathology and cognitive impairment. J Neurosci. 30 (21), 7326-7334 (2010).
- Blaney, C. E., Gunn, R. K., Stover, K. R., Brown, R. E. Maternal genotype influences behavioral development of 3xTg-AD mouse pups. Behav Brain Res. , 40-48 (2013).
