Descreve-se aqui uma abordagem de rastreio comportamental escalonada que pode ser utilizada para pesquisar compostos que exibem eficácia in vivo sobre comportamentos motores cognitivos e funcionais em modelos de ratinho transgénicos de β-amiloidose e tauopatia. Esses métodos são otimizados para pesquisar compostos para atividades em tarefas de memória de curto prazo e de trabalho.
Aqui descrevemos uma abordagem de teste comportamental escalonada que pode ser usada para pesquisar compostos que exibem eficácia in vivo em comportamentos motores cognitivos e funcionais em modelos de camundongos transgênicos de β-amiloidose e tauopatia. O paradigma inclui testes para alternância espontânea em um labirinto em Y, novo reconhecimento de objetos e aperto de membros. Estes testes foram selecionados porque: 1) interroga a função dos domínios cognitivos ou motores eo correlato dos circuitos neurais relevantes para o estado da doença humana, 2) tem endpoints claramente definidos, 3) tem controlos de qualidade facilmente implementáveis, 4) pode ser executado em Um formato de débito moderado e 5) requerem pouca intervenção do investigador. Estes métodos são projetados para os pesquisadores que procuram compostos de tela para a atividade em curto prazo e tarefas de memória de trabalho, ou comportamentos motores funcionais associados com modelos de ratos de doença de Alzheimer. Os métodos aqui descritos utilizam testes comportamentais que engIdade um número de diferentes regiões cerebrais, incluindo o hipocampo e várias áreas corticais. Os investigadores que desejam testes cognitivos que avaliam especificamente a cognição mediada por uma única região do cérebro podem usar essas técnicas para complementar outros testes comportamentais.
A doença de Alzheimer (DA) é uma doença neurodegenerativa progressiva que resulta em debilitante declínio cognitivo que afeta aproximadamente 44 milhões de pessoas em todo o mundo. Atualmente não existem tratamentos disponíveis para a DA que sejam modificadores da doença, enfatizando a necessidade urgente de descobertas pré-clínicas de novas estratégias terapêuticas para esta doença. Vários modelos de camundongos transgênicos diferentes foram criados que recapitulam vários aspectos de AD 1 , 2 , incluindo déficits em domínios cognitivos interrompidos em pacientes 3 . Estes modelos de ratinho representam uma ferramenta útil para facilitar a triagem eficiente in vivo .
Ao avaliar um composto para potencial eficácia in vivo , uma abordagem faseada deve ser tomada que telas de eficácia em domínios cognitivos adequados e também monitora os comportamentos que poderiam influenciar os parâmetros específicos utilizados para umSsess cognição. Muitos modelos de ratos transgênicos de AD exibem hiperatividade e outros comportamentos que podem interferir com um determinado teste cognitivo e proibir seu uso no rastreamento de drogas 4 . Além disso, para uma abordagem a ser implementada em um ambiente de triagem de drogas, os testes específicos utilizados devem sustentar pelo menos um débito moderado, ter pontos de extremidade claramente definidos e um procedimento que requer intervenção mínima dos investigadores. Usando esses critérios, podem ser implementadas telas comportamentais que exibem a reprodutibilidade, a baixa variabilidade intra e inter-ensaio e os tamanhos de efeito necessários para a triagem de compostos. Aqui estão detalhados os métodos que empregamos para pesquisar compostos eficazes na mitigação dos fenotipos cognitivos e motores presentes em modelos de camundongos transgênicos de β-amiloidose e tauopatia 5,6. Os métodos descritos são adaptados a partir de paradigmas comportamentais comumente usadosCom otimizações específicas e verificações de controle de qualidade para que possam ser usadas em modelos de camundongos transgênicos relevantes para AD. Este protocolo pode ser usado com uma variedade de aquisição de dados e sistemas de análise e assume que o investigador tem um conhecimento prático do software associado.
Significado da técnica com respeito aos métodos existentes
Este procedimento foi concebido para pesquisar a actividade in vivo de compostos em modelos de ratinho transgénicos de p-amiloidose e tauopatia. A abordagem escalonada empregada aqui garante a detecção de compostos eficazes em domínios cognitivos relevantes para AD 3 . Além disso, a abordagem detalhada aqui usa testes comportamentais que têm endpoints claramente definidos, controlos de controle de qualidade facilmente implementáveis, podem ser executados em um formato de throughput moderado e requerem pouca intervenção do investigador. Estas características resultam em ensaios que apresentam boa reprodutibilidade dentro de animais e entre coortes, o que resulta em baixa variação intra e inter-ensaio e tamanhos de efeito (2 ≤ f ≤ 6) que são suficientemente robustos para suportar o perfil comportamental num ambiente de descoberta de fármacos.
Passos críticos dentro do PrOtocolo
Muitos modelos de camundongos em uso para descobertas de fármacos AD apresentam comportamentos consistentes com ansiedade e agressão aumentadas. Isso torna a manipulação habituação essencial para a realização de qualquer um dos testes comportamentais descritos aqui. Como esses testes dependem de comportamentos desmotivados, manipulação brusca pelo investigador devido a um rato hiperativo e ansioso ou agressivo pode influenciar significativamente o desempenho. Ansiedade aumentada pode resultar em falha na execução da tarefa, reduzindo o poder geral do teste. Além disso, os níveis de luz na arena são essenciais para facilitar a locomoção espontânea necessária para cada teste. Luz brilhante tende a aumentar a ansiedade e suprimir a locomoção em roedores, portanto, cuidado deve ser tomado para ajustar os níveis de luz ambiente para 30-35 lux na arena.
Outro aspecto crítico do procedimento é a minimização de fortes sinais ambientais que interferem com a capacidade de um animal para executar as tarefas. Limpeza doArena e objetos entre corridas é essencial como ratos são atraídos para novos aromas no ambiente. A falha em limpar completamente a arena e objetos pode resultar em distorção da atividade espontânea do mouse e mascarando o verdadeiro desempenho cognitivo. Os investigadores também devem minimizar o uso de produtos de higiene pessoal e de colônias / perfumes ao realizar esses procedimentos. Por fim, os roedores exibem mudanças diurnas e circadianas robustas em muitos comportamentos abertos 20, incluindo aprendizagem e memória 21 . Portanto, para minimizar a variância devido aos ritmos diurnos nos comportamentos basais e no desempenho cognitivo, todos os testes devem ser feitos na mesma hora do dia entre coortes e estudos.
Além disso, especificamente no que se refere ao reconhecimento de novos objectos, o intervalo de atraso entre a fase de amostra e de teste e a selecção e colocação de objectos no ambiente são parâmetros críticos. A memória existe em 3 formas distintas: mem(STM), memória de termo intermediário (ITM) e memória de longo prazo (LTM) 22 , 23 . Alterar o intervalo entre a amostra e as fases de teste de minutos (STM) para horas (ITM) ou dias (LTM) irá alterar o tipo de memória testada pelo procedimento 12 . Além disso, antes de executar o novo teste de reconhecimento de objectos, muitos objectos devem ser rastreados numa coorte de teste de ratinhos para potenciais vieses na exploração. Um objeto que é excessivamente atraente ou repulsivo para a coorte de teste não pode ser usado ao avaliar novo reconhecimento de objeto. Idealmente, todos os objetos que serão empregados no teste, quando colocados em uma arena, obterão tempos iguais de exploração de uma coorte ingênua de camundongos. Testes e otimização inadequados de objetos podem reduzir significativamente o poder do novo reconhecimento de objetos.
Modificações e Solução de Problemas
Existem vários fatores que podem aumentar aVariabilidade aparente nos testes cognitivos descritos aqui. Muitos modelos de ratos de AD exibem locomoção hiperdinâmica 3 que pode mascarar ou alterar comportamentos medidos como o ponto final cognitivo. Além disso, há evidências crescentes de que o sexo 24 , 25 , 26 e mesmo o genótipo materno 27 podem influenciar o desenvolvimento e a progressão da neuropatologia e fenótipos cognitivos em modelos de ratos AD. Variabilidade inesperada ou incapacidade de implementar uma tarefa comportamental pode ser devido a qualquer um desses fatores. Ao implementar primeiro um teste comportamental específico, os resultados devem ser sempre estratificados por sexo, idade e, se aplicável, genótipo materno. Além disso, as verificações de qualidade descritas neste procedimento devem ser sempre realizadas para garantir que a hiperatividade ou outros comportamentos estereotipados não estejam interferindo na quantificação de pontos de avaliação cognitivos.
EnvO endurecimento também pode influenciar o comportamento exploratório espontâneo dos roedores. Perfumes ou sons que são indetectáveis para os pesquisadores poderiam atrair ou repelir ratos, distorcendo os resultados de testes cognitivos que dependem do comportamento espontâneo. Ao estabelecer inicialmente um labirinto em Y ou um novo reconhecimento de objetos, é essencial o desempenho das medidas de controle para garantir que não haja viés posicional na exploração de objetos e / ou no ambiente. Se os viés de posição forem observados, então os pesquisadores devem examinar minuciosamente o ambiente e potencialmente ajustar a iluminação, a colocação da arena, a localização da sala de testes em relação a outras salas da instalação ( ou seja , não perto de uma área de alto tráfego ou equipamentos pesados)
A habituação ao ambiente de teste é a chave para alcançar um desempenho ótimo no novo teste de reconhecimento de objetos. Por exemplo, os baixos tempos totais de exploração podem ser devidos a habituação inadequada. Como alternativa ao proc(Secção 2) e arena (Secção 4.2) habituação, habituação ao manuseamento eo ambiente de ensaio pode ser realizada como sessões de 3, 5 min por dia durante 2 dias consecutivos.
Limitações da Técnica
Como com qualquer procedimento, esses testes comportamentais têm limitações. Estes procedimentos têm sido empregados porque testam a função de várias regiões corticais e do hipocampo. Se o modelo de rato não apresentar défices funcionais nas regiões cerebrais sondadas por estes testes, então estas técnicas não serão úteis. Além disso, escolhemos testes cognitivos que detectem a memória de curto prazo. Se não se espera que o mecanismo de ação do composto sob avaliação pré-clínica afete a memória de curto prazo, esses procedimentos devem ser modificados de acordo ( isto é , aumentando o intervalo de fase do teste de amostra para testar a memória de longo prazo). Por fim, esses testes usam comportamentos desmotivados. Portanto, se um modelo de mouse é excesHiperativa ou exibe outros comportamentos estereotipados que impedem a exploração do ambiente, então esses procedimentos podem não ser otimizados. Como uma alternativa, pode-se usar o condicionamento do medo para Tg2576 ou outros modelos de camundongos β-amiloidose, ou o labirinto espacial de água para rTg4510 ou outros modelos de rato de tauopatia 3 .
Aplicações futuras
Uma vez que estes procedimentos tenham sido adoptados com êxito no laboratório, várias modificações ou extensões podem ser feitas para avaliar outras medidas motoras cognitivas e funcionais. Por exemplo, alterar a nova tarefa de reconhecimento de objeto para determinar se um mouse pode reconhecer uma alteração na colocação de um objeto 13 . Alternativamente, em vez de usar objetos, pode-se usar outros ratos e implementar um teste de reconhecimento social. No que diz respeito ao aperto dos membros e à função motora, pode-se complementar esse teste com os testes de travamento do fio e / ou força de preensão. Os testesDetalhadas neste método formam uma base sólida para pesquisar compostos que têm eficácia in vivo em modelos de ratinho de tradução para AD e podem ser adaptados ou modificados de muitas maneiras para interrogar melhor um modelo de rato particular ou satisfazer as necessidades de um programa de descoberta de fármaco único .
The authors have nothing to disclose.
Os autores não têm agradecimentos.
Topscan Lite-High Throughput | Cleversys | Automated behavioral analysis. Includes cameras and video acquisition system, laptop. | |
ObjectScan | Cleversys | Software module for accurate object exploration quantification | |
Open field for mouse | Cleversys | CSI-OF-M | Arena for novel object recognition |
Y-maze for mouse | Custom | Arms: 30cm long, 10 cm wide, 20cm high walls, placed 120deg apart. | |
Camera mount for open field | Custom | Custom | 76 cm tall, 115 cm wide, cameras mounted @ 30cm in from either side. Two mounts, each covers two boxes. |
Camera mount for Y-maze | Custom | Custom | 76 cm tall, 115 cm wide, cameras mounted @ 30cm in from either side. One mount covers two mazes. |
Marbles | Inperial Toy | 8565 | Standard (15.5mm Dia) glass marbles. |
Dice | Cardinal Industries | 770 | Standard (0.650 inch) white dice with black dots. |
LOCTITE Fun-Tak | Henkel | B018A3AG0W | Standard blue sticky tak |
EtOH | Nexeo Solutions | 82452 | 100% Ethanol Diluted to 70% using distilled Water |
dH2O | Tulpenhocken Spring Water Co. | – | PA D.E.P. #31, NJ D.O.H. #0049, NYSHD Cert. #320 |
Paper towels | Procter & Gamble | B019DM86LA | Bounty, White |
Handheld video camera | Apple, Inc. | MKV92LL/A | Acquisition of Limb clasping video, Iphone 6S Plus (or functional equivalent). |
Gloves | SafePOINT, L.L.C. | GL640-2 | Standard, Powder free Latex Gloves, Medium |
Light meter | Dr. Meter | LX1330B | Lighting @ the bottom of Open Field= 35 LUX, Lighting @ bottom of Y-Maze= 32 LUX |
Bleach germicidal wipes | Clorox | Sterilization of equipment during & after use |