Summary
ここでは、βアミロイドーシスおよびタウオパチーのトランスジェニックマウスモデルにおける認知および機能的運動行動に対するインビボでの有効性を示す化合物をスクリーニングするために用いることができる、段階的な行動スクリーニングアプローチを記載する。これらの方法は、短期および作業記憶課題における活性について化合物をスクリーニングするために最適化される。
Abstract
ここでは、βアミロイドーシスおよびタウオパチーのトランスジェニックマウスモデルにおける認知機能運動行動に対するインビボの有効性を示す化合物をスクリーニングするために用いることができる段階的な行動試験アプローチについて説明する。このパラダイムには、Y字型迷路における自発的な交替、新規な物体認識、四肢の挟み込みのテストが含まれる。これらの試験は、1）認知領域または運動領域の機能、およびヒト疾患状態に関連する相関神経回路の機能、2）エンドポイントの明確な定義、3）容易に実行可能な品質管理チェックの実行、4）適度なスループットフォーマット、および5）研究者の介入はほとんど必要ない。これらの方法は、アルツハイマー病マウスモデルに関連する短期記憶および作業記憶課題、または機能的運動行動における化合物のスクリーニングを検討する研究者のために設計されている。ここで説明するメソッドは、eng海馬および種々の皮質領域を含む多数の異なる脳領域を年齢に合わせる。単一の脳領域によって媒介される認知を特異的に評価する認知試験を望む研究者は、これらの技術を用いて他の行動試験を補うことができる。
Introduction
アルツハイマー病（AD）は、進行性の神経変性疾患であり、世界中で約4400万人の人々に影響を与える衰弱性の認知低下をもたらす。現在、この疾患に対する新規治療戦略の前臨床発見の緊急の必要性を強調して、疾患修飾性であるADに対する利用可能な治療法はない。 AD1,2の様々な局面を要約する多数の異なるトランスジェニックマウスモデルが作成され、患者3において中断された認知領域の欠損を含む。これらのマウスモデルは、インビボでの効率的なスクリーニングを促進するための有用なツールである。
潜在的インビボ有効性について化合物を評価する場合、適切な認知領域における有効性をスクリーニングする段階的アプローチが行われなければならず、また、特定のエンドポイントに影響を及ぼす可能性のある行動ssess認知。 ADの多くのトランスジェニックマウスモデルは、多動性および特定の認知試験を妨害する可能性のある他の行動を示し、薬物スクリーニングでのその使用を禁止する4 。さらに、薬物スクリーニング環境で実施されるアプローチのために、使用される特定の試験は、少なくとも適度なスループットを維持し、明確に定義されたエンドポイントを有し、治験責任医師の介入を最小限に抑える手順をとるべきである。これらの基準を使用して、化合物スクリーニングに必要な再現性の低い、アッセイ間およびアッセイ間の差異および効果サイズを示す行動スクリーンを実施することができる。ここでは、βアミロイドーシスおよびタウオパチーのトランスジェニックマウスモデルに存在する認知および運動表現型を緩和するのに有効な化合物をスクリーニングするために使用した方法を詳述する5,6。記述された方法は、lで報告された一般的に使用される行動パラダイムADに関連するトランスジェニックマウスモデルにおいて使用され得るように、特定の最適化および品質管理チェックを伴う、反復7 。このプロトコルは、様々なデータ収集および分析システムと共に使用することができ、研究者が関連するソフトウェアの実際の知識を持っていることを前提としています。
Protocol
この出版物に詳述されている方法は、適用可能な連邦、州および地方の法律および規制に準拠した動物の適切なケア、使用、および人道的処置を確実にするため、Hilltop Laboratory Animalsの機関動物保護および使用委員会（IACUC）連邦動物福祉規則、またはAWRs（CFR 1985）、および実験動物の人道的ケアおよび使用に関する公衆衛生サービス政策、またはPHS方針（PHS 1996）を参照のこと。
1.すべての行動評価のための一般的なガイドライン
- 動物の取り扱いの前に、既存のケージカードには、一意かつ盲目的な動物識別子のみを示す新しいケージカードを使用してください。
注：通常の化合物/プラセボ投与中にマウスを取り扱う研究者は、行動評価のためにマウスを取り扱うことは認められていない。 - オーバーヘッドライトを消灯またはオフにして、アリーナまたは迷路の床の照明が30〜35ルクスになるように照明を調整します。
- Fまたは数週間に及ぶ研究では、体重を毎週健康状態の間接的な指標として記録します。
注記：より丈夫な健康診断が必要な場合は、コートの品質、姿勢、歩行および自発的な移動の追加のケージサイドチェックを含めることができます。
2.研究者によるマウスの馴化
- 行動試験の2日前に、マウスを取り扱いに慣れさせます。ケージをケージラックから取り外し、平らな場所に置きます。
- ケージから蓋を取り外します。次の行動テストの実行中にマウスを正確に処理します。マウスをホームケージの上のカップ状の手の中に置きます。
- 調査員の手からホームケージに戻るために待ち時間を測定する。マウスを最大5秒間保持する。
注：2秒以上の潜時を示すマウスは、「慣れ親しんだ」とみなされます。最初の試験中に2秒未満の潜伏期を示すマウスは、2つの追加の習慣その日n回のセッション。 - マウスに慣れを2日間連続して受けさせる。 2日目の終わりまでに慣れていないマウスに注意してください。
3. Y字型迷路における自発的交替を測定することによる空間的作業記憶の評価8
- 最初の使用に先立ち、無漂白漂白殺菌ワイプ、70％EtOH、続いてdH 2 O 9で Y字型迷路を完全にきれいにする。明らかに、迷路の腕を 'A'、 'B'＆ 'C'または他の匹敵する一意の識別子として指定する。
- 試験セッションの開始前に、データ収集システムまたはビデオカメラを設定し、迷路内のマウスの適切な追跡を設定する。ルーラーまたは既知の長さの他のオブジェクトのキャプチャされたビデオ画像を使用して、迷路内の距離を較正する。
注記：この手順の動作方法は、さまざまなデータ収集システムで動作し、著者はanyoこの手順を実行することは、選択したデータ収集システムの使用に堪能です。パワー分析は、1グループあたり10〜15匹のマウスのサンプルサイズがβ≦0.2のために必要であることを示している。 - ケージをラックから取り出し、静かにY字型迷路のすぐ近くのテーブルに置きます。そのホームケージからマウスを取り出し、静かにY字型の迷路の1つの腕の中に置いてください。マウスが研究者を見ることができないように、研究者が迷路から十分離れて歩いてもらう。
- 迷路にマウスを配置した直後に、データ/ビデオ取得システムをアクティブにします。
- 遊びを押して、各マウスの自発的行動を10分間記録する。セッションが完了したら、マウスを静かにホームケージに戻して、ケージをラックに戻します。
- 各セッションの間に、無色の漂白殺菌ワイプ、70％EtOH、続いてdH 2 Oで迷路を完全に洗浄する。ステップ3.4から繰り返して、すべてのマイクを評価するe。
- すべてのマウスがY迷路の探索を完了したら、獲得システムからのデータを分析するか、またはセッションのビデオを手動でスコアリングする。マウスの4つの足のすべてが中心ゾーンの閾値を越えて腕の中に入り、動物の鼻が腕の終わりに向いているとき、腕の動きが起こる。
注：分析されるエンドポイントには、迷路内を移動した総距離、各アーム（中央ゾーンを含む）内で移動した合計距離、各アーム（中央ゾーンを含む）に費やした合計時間、アームエントリーの総数、各腕に記入された記入事項、および交替回数を評価するために入力された一連の腕のリスト。 - 自発的な交替は、マウスが3つの連続した腕の各項目の迷路の異なる腕に入るときに起こる。自発的交代％は、次の式で計算されます。
注：たとえば、私はアームエントリーの順番：ABCCBABCABC、研究者は合計6回の自発的交代（ABC、CBA、ABC、BCA、CAB、ABC）をスコアする。合計11個のアーム入力で、自発的な交替率は67％になります。 - 次の品質管理チェックを行い、データが自発的な交替の偏りのない評価を表すことを確認します。
- 旅行された総距離と作成された腕のエントリの数の両方に対する自発的な交替％のピアソンの相関を実行します。
注：いずれかのパラメータとの自発的な交互作用の有意な相関がある場合、見かけの認知エンドポイント10に対する動力学的運動の潜在的な影響のために、データをさらに精査する必要がある。 - 1-way ANOVAテストで、各腕に記入されたエントリーの数を分析する。
注：この分析が重要である場合、これは、マウスを特定のレジに誘引した環境における手がかりの存在を示すであろう迷路の上に。
- 旅行された総距離と作成された腕のエントリの数の両方に対する自発的な交替％のピアソンの相関を実行します。
4.新規物体認識による中期認識メモリの評価11,12,13
- この試験の各段階について、初回使用前に無香漂白殺菌ワイプ、70％EtOH、続いてdH 2 Oでオープンフィールドアリーナを徹底的に洗浄する。
- 対象暴露の1日前に、オープンフィールド場にマウスを慣らす。
- 習慣化セッションの開始前に、データ取得システムまたはビデオカメラをセットアップし、迷路内のマウスの適切な追跡を確認する。ルーラーまたは既知の長さの他のオブジェクトのキャプチャされたビデオ画像を使用して、アリーナ内の距離を較正する。ソフトウェアでアリーナのコーナーをマークして、位置偏りの採点を許可する。
注：この手順の動作方法は、さまざまなデータ取得システムで動作します幹および著者は、この手順を実行する誰もが、選択したデータ収集システムの使用に堪能であると仮定しています。動力分析は、群当たり15-20匹のマウスのサンプルサイズがβ≦0.2のために必要であることを示している。 - ケージをラックから取り出し、アリーナのすぐ近くのテーブルに静かに置きます。
- ホームケージからマウスを取り出し、マウスをアリーナの中心に静かに置きます。マウスをアリーナに置いた直後に、追跡ソフトウェアおよび/またはビデオ記録システムをオンにする。
- マウスが自由に30分間アリーナを探索できるようにする。
注：この期間中、研究者はマウスを妨害しません。 - 習慣化セッションの後、マウスを彼らのホームケージに戻し、無香漂白殺菌ワイプ、70％EtOH、続いてdH 2 Oでアリーナを完全にきれいにする。
- すべてのマウスが競技場に慣れてくるまでステップ4.2.2から繰り返す。
- すべてのマウスが習慣になった後アリーナに向かって、ビデオを分析してください。
注：分析するエンドポイントには、アリーナで移動した合計距離と各コーナーの近くで費やされた時間が含まれます。マウスモデルに関連する場合、ステレオタイプの振る舞いがこれらの分析（ すなわち 、ミオクローヌスコーナージャンプ、旋回など ）に含まれる。アリーナの特定の領域で過ごした時間にバイアスを呈するマウスは、さらなる実験から除外され、これはオブジェクトの探索に影響を与える。
注：新規オブジェクト認識の第1段階では、マウスをオブジェクトに慣れさせる必要があります。ここで、新規の物体認識手順のこの部分は、サンプル段階と呼ばれる。 - サンプルフェーズセッションの開始前に、オブジェクトをアリーナに置き、動物がオブジェクトを動かすことができないように、取り付けパテで床に固定します。 2つの同一のオブジェクトを壁とオブジェクトの間に十分な距離を置いて特定の壁に整列させることで、マウスがすべてのアンレズ。
- データ収集システムまたはビデオカメラをセットアップし、迷路内のマウスおよび物体の適切な追跡を確認する。ルーラーまたは既知の長さの他のオブジェクトのキャプチャされたビデオ画像を使用して、アリーナ内の距離を較正する。
- ソフトウェアでアリーナのコーナーをマークして、位置偏りの採点を許可する。ソフトウェア内のオブジェクトをマークし、各オブジェクト（ すなわち 、「オブジェクトA」および「オブジェクトB」）ごとに探索行動を追跡する。
- ケージをラックから取り出し、アリーナのすぐ近くのテーブルに静かに置きます。
- ホームケージからマウスを取り出し、アリーナの中心に物を向けて静かに置きます。
- マウスが自由に15分間オブジェクトを探索できるようにします。この間にマウスを邪魔しないでください。
- セッションの終わりに、マウスを静かにホームケージに戻してください。 70％EtOHとdH 2 Oでアリーナと物体をきれいにする。これらの物体をtheアリーナ。
- すべてのマウスが対象物に慣れるまでステップ4.2.11を繰り返します。
- すべてのマウスを対象に慣れさせたら、ビデオを分析します。
注：オブジェクトの探索は、以下の基準が満たされるとカウントされます：マウスがオブジェクトの方に向いていて、鼻がオブジェクトの2cm以内にあり、動物の体の中間点がオブジェクトから2cmを超えていて、少なくとも1秒間満たされている。さらに、動物が探索基準を満たしているが、> 10秒間不動を示す場合、探索的試合は終了したとみなされる。 - 次のように、各マウスのオブジェクトバイアススコアを計算します。
注：20％未満または80％を超えるオブジェクトバイアススコアを示すマウスは、さらなる実験から除外される。
- 習慣化セッションの開始前に、データ取得システムまたはビデオカメラをセットアップし、迷路内のマウスの適切な追跡を確認する。ルーラーまたは既知の長さの他のオブジェクトのキャプチャされたビデオ画像を使用して、アリーナ内の距離を較正する。ソフトウェアでアリーナのコーナーをマークして、位置偏りの採点を許可する。
- 新規物体認識の最終段階は、探索行動を評価することを含むここではテストフェーズと呼ばれる、環境内の斬新で親しみやすいオブジェクトの両方に向けられています。この相は、試料相の完了後2〜3時間で実施する。
- テストフェーズセッションの開始前に、オブジェクトをアリーナに置き、動物がオブジェクトを動かすことができないように床に固定します。
- オブジェクトをサンプルフェーズ13に対してアリーナ内の同じ位置に置きます。
- 遺伝子型と治療群にわたる新規でおなじみのオブジェクトの相対的な位置を調整します。
- マウスがあらゆる角度からオブジェクトを自由に探索できるように、壁とオブジェクトの間に十分な距離があることを確認します。
- データ収集システムおよび/またはビデオカメラをセットアップします。迷路内のマウスや物体の適切な追跡を確認してください。ルーラーまたは既知の長さの他のオブジェクトのキャプチャされたビデオ画像を使用して、アリーナ内の距離を較正する。
- 柔道のアリーナのコーナーをマークする位置的な偏りのスコアリングを可能にすることである。ソフトウェア内でオブジェクトをマークし、個々のオブジェクトごとに探索行動を個別に追跡します（ つまり 、「小説」と「親しみ」）。
- ケージをラックから取り出し、アリーナのすぐ近くのテーブルに静かに置きます。
- オブジェクトを向いて、アリーナの中心に静かに動物を置きます。 10分間マウスを自由に探索して記録します。
- テストセッションの最後に、マウスをアリーナから取り出し、マウスを彼らのホームケージに戻す。各セッションの後に、無香料の漂白殺菌ワイプ、70％EtOHおよびdH 2 Oで徹底的にきれいなアリーナおよび対象物を洗浄する。
- すべての動物が評価されるまで、4.4.3から繰り返す。
- オブジェクトの探索がすべてのマウスについて測定されると、ビデオが分析されます。
注：オブジェクトの探索は、以下の基準が満たされた時点でカウントされます。マウスがオブジェクトの方に、鼻がオブジェクトの2cm以内に、動物の体は対象物から2cm以上離れており、以前の基準は少なくとも1秒間満たされています。さらに、動物が探索基準を満たしているが、> 10秒間不動を示す場合、探索的試合は終了したとみなされる。 - 小説を探索するのに費やされた時間を身近なものと比較することによって、新規の物体認識を評価する。文献には3つの方法が一般的に報告されている。
- 反復測定テストを使用して、斬新なオブジェクトとおなじみのオブジェクトの両方を探索するために費やされた生の時間を分析します。この方法は、遺伝子型および/または治療が全探索時間に影響しない場合に最もよく使用される。
- 次の等式を使用して、新規性の好みを計算する：
注：これは、オブジェクトを探索する合計時間に対する新規オブジェクトの探索に費やされた時間のパーセンテージを提供します。値は0％（新規対象物の探査なし）から100％（新規Obの探査のみ50％の値は、珍しく親しみのあるオブジェクトを探索するのに費やされた等しい時間を示しています。 - 方程式を使用して弁別指数11を計算する：
注：これは、オブジェクトを探索するのに費やされた合計時間に対する新旧のオブジェクトの探索に費やされる時間の差をもたらす。値は-1（馴染みのあるオブジェクトの探索のみ）から+1（新規オブジェクトの探索のみ、0の値は等しい時間を示し、斬新で親しみのあるオブジェクトを探索するのに費やされます）。
- テストセッションに参加していない動物は、動力学的運動またはその他の常同症のために、考慮11から取り除く。
注：除去に使用される基準は、客観的であり、マウスモデルに関して先験的に決定されなければならない（ すなわち 、総探索時間に対して5パーセンタイル未満であり、平均> 100試験セッション中の回転角またはミオクローヌスコーナージャンプを示す> 50パーセンタイル時間）。
- テストフェーズセッションの開始前に、オブジェクトをアリーナに置き、動物がオブジェクトを動かすことができないように床に固定します。
四肢のつかみを伴うマウスにおける皮質脊髄機能の評価14
- ビデオはセッション全体を記録します。ポータブルハンドヘルドデバイス（スマートフォンなど）を使用してビデオを録画します。
注：力分析は、グループあたり10〜15匹のマウスのサンプルサイズがβ≦0.2のために必要であることを示している。 - ホームケージをラックから取り出し、テーブルに置きます。次のステップの前に、動物IDをビデオに記録する。
- 静かにそのケージからマウスを取り出し、5〜10秒間尾部で懸垂する。ビデオは、中断されている間、動物の後肢と前腕を記録しなければならない。
- 少なくとも5秒のビデオをキャプチャした後、マウスをホームケージに戻して、ケージをラックに戻します。
- テーブルを清掃してください。すべてのマウスがrecordeするまでステップ5.2から繰り返す d。
- 0-4の尺度で尾部に懸垂されたマウスのビデオから脚をつかむ（スコアリングの説明については表1を参照）。中断したマウスのビデオを検査し、次の基準に基づいてスコアを割り当てます。
- 四肢のつかみはありません。通常のエスケープ拡張。 1つの後肢は不完全な広がりと移動性の喪失を示す。つま先は通常の広がりを示す。
- 両方の後肢は不完全な広がりと移動性の喪失を示す。つま先は通常の広がりを示す。
- 両方の後肢はカールしたつま先と不動でつまむことを示す。
- 前肢および後肢は握りしめを示し、交差し、つま先と不動をカールさせる。
- すべてのマウスは2人の独立した研究者によって採点される。 2つのスコアが1ポイント以上異なるマウスは、もう一度再スコアリングされます。
- 異なるスコアが平均化されます。
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表1：肢括弧スコアの記述。
Representative Results
高齢のTg2576マウスは、Y迷路15,16 （ここで詳述された方法を用いて複製することができる表現型（ 図1A ））内で行われた自発的交替において頑強な欠損を示す。これらのマウス（ 図1B ）では、増加したアームエントリーの傾向が観察されたが、この系統のマウスで観察された多動性は自発的交代率に影響しなかった（ 図1C ）。対照的に、老齢のrTg4510マウスは、Y迷路に配置した場合、自発的な交替を増加させるようである（ 図1D ）。これは、自発的な交替の測定を著しく妨害する極端な活動亢進（ 図1E ）およびステレオタイプ10によるものである（ 図1F ）。このタスクでマウスを最初に評価するとき、腕の進入および/または移動距離が自発的交代率と有意に相関した。
新規物体認識の評価に先立って、マウスを試験場に慣らし、試験を行う。習慣化の間、多動性（ 図2A ）およびマウスモデルに関連する他の常同振る舞いを評価することができる。サンプルフェーズでは、各オブジェクトの探索を別々に測定することが重要であり、探索行動において有意な偏りを示すマウスをさらなる評価から除外することができます（ 図2B 、白丸）。新規オブジェクト認識は、使い慣れたオブジェクトと新規オブジェクトの比較によって評価され、一般に3つの異なる方法で分析されます。総探索時間が遺伝子型および/または治療群にわたって匹敵する場合、各対象を探索する生の時間および適切な反復測定試験を用いて、新規対象r（ 図2C ）。特定のマウス系統が総探索時間に差異を示す場合、新規対象の認識は新規性選好（ 図2D ）または識別指標（ 図2E ）のいずれかを用いて評価することができる。
肢掴みは、皮質脊髄機能の欠損を定量化する機能的運動検査である。いくつかのトランスジェニックタウマウスモデルでは、認知尺度ではない肢掴みが観察され、後期AD患者で観察された機能的運動障害のいくつかが再現されている（6,17,18,19）。尾によるマウスのサスペンションはエスケープ応答を誘発する（ 図3A 、0）。後肢を広げて足指を伸ばす能力の欠損は、0-4のスケールでその重症度に基づいてスコア化される（ 図3A）。本明細書に概説した手順を使用して、rTg4510マウス（ 図3B ）における有意な四肢の抱き合わせを観察することができる。
図1：Y字型迷路における自発的な交替 （ A ）Y字型の迷路に配置すると、マウスは、それぞれの腕が3つの腕の入力ごとに1回だけ探索される探査のパターンをもたらす敗北探索戦略を採用する。高齢のTg2576マウスは自発的交替で有意な欠損を示す。この方法で概説した手順を使用して、自社製化合物による処理後に自発的交替の有意な回復が観察された。 1-way ANOVAを用いてデータを分析し、Dunnett検定を用いてTg-PBSとのポストホック比較を行った。 ** p <0.01。エラーバーはSEMを示す。 （ B ）アームエントリーの数は、この実験で監視されたグループのうちの1つ。データは、1-way ANOVA試験を用いて分析した。エラーバーはSEMを示す。 （ C ）自発的交替とアーム進入の数との間に相関はなく、自発的な運動活性の差異が自発的交替の定量化に影響しないことを示している。相関試験はピアソンの相関分析を用いて行った。 （ D ）Y迷路に配置した場合、rTg4510マウス（6ヵ月）は、同腹仔WTマウスと比較して有意により自発的な交替を示すようである。データを1-way ANOVAにより分析し、Dunnett検定を用いてTg-PBSとのポストホック比較を行った。 ** p <0.01。エラーバーはSEMを示す。 （ E ）rTg4510マウスは、それらの極度の体動運動のために、より多くの腕の進入を行った。データを1-way ANOVAにより分析し、Dunnett検定を用いてTg-PBSとのポストホック比較を行った。 *** p <0.001。エラーバーはSE自発的交替行動は、腕のエントリーと有意に相関し、これは、動力学的運動性表現型が真の自発的交替を不明瞭にしていることを示している。相関試験はピアソン相関分析（r = 0.7、p <0.0001）を用いて行った。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2：新規オブジェクトの認識。 （ A ）競技場の習慣化は、特定のマウスモデルに関連する自発的な運動および他の常同振る舞いの測定を可能にする。ここで、老齢のTg2576マウス（22か月）は、同腹仔WTマウスと比較して有意に自発的な運動を示す。データを1-way ANOVAにより分析し、Tg-Vehに対する事後比較を、Dunnett 'テスト。 ** p <0.01。エラーバーはSEMを示す。 （ B ）サンプルフェーズでは、2つの同一オブジェクトの探索を別々に追跡した。 2つのオブジェクト（白丸）のうちの1つの探索に大きな偏りを示すマウスは、テスト段階から除外された。 （ C - E ）新規で馴染みのある物体の探査を測定することによって、新規物体認識を評価した。 （ C ）生の探査時間、（ D ）新規性選好または（ E ）差別指数を用いて新規物体認識を評価した。パネルCのデータを、反復測定を伴う2元ANOVAを用いて分析し、対比較をSidakの試験を用いて行った。パネルDEのデータを1-way ANOVAで分析し、Dunnett検定を用いてTg-Vehとの事後比較を行った。 * p <0.05、** p <0.01。エラーバーはSEMを示す。 クリックしてくださいここではこの図のより大きなバージョンを見ることができます。
図3：四肢のつかみ。 （ A ）rTg4510マウス（6ヶ月）は、これらの方法を用いて採点した同腹子WTマウスと比較して有意な四肢の抱き合わせを示す。 1-way ANOVAを用いてデータを分析し、Dunnett検定を用いてTg-PBSとのポストホック比較を行った。 *** p <0.001、**** p <0.0001。エラーバーはSEMを示す。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
Discussion
既存の方法に関する技術の意義
この手順は、β-アミロイドーシスおよびタウオパチーのトランスジェニックマウスモデルにおける化合物のインビボ活性をスクリーニングするために設計されている。ここで用いられる段階的アプローチは、AD 3に関連する認知領域における有効な化合物の検出を確実にする。さらに、ここで詳述するアプローチでは、エンドポイントが明確に定義されたビヘイビアテスト、実装が容易な品質管理チェック、中程度のスループット形式での実行が可能であり、調査者の介入もほとんど必要ありません。これらの特徴は、動物内およびコホート間で良好な再現性を示すアッセイをもたらし、薬物発見環境における行動プロファイリングをサポートするのに十分な堅牢性を有するアッセイ間およびアッセイ間の分散および効果サイズ（2≦ f ≦6）
Prの重要なステップオトコ
AD薬物探索に使用される多くのマウスモデルは、不安と攻撃性の高まりと一致する行動を示す。これにより、ここで説明されている行動テストの実行に必要な習慣化の手がかりが得られます。これらのテストは運動不能な行動に依存しているので、過度に不安定で不安で攻撃的なマウスによる研究者の扱いの乱れは、パフォーマンスに大きな影響を与える可能性があります。不安が高まると、タスクを実行できなくなり、テスト全体の能力が低下する可能性があります。さらに、アリーナの光レベルは、各試験に必要な自発的な運動を促進するために不可欠である。明るい光は不安を増し、げっ歯類の移動を抑制する傾向があるため、周囲の光レベルをアリーナで30〜35ルクスに調整するように注意する必要があります。
この手順のもう1つの重要な側面は、タスクを実行する動物の能力を妨げる強力な環境的合図の最小化である。その清掃マウスが環境中の新しい香りに引き寄せられるので、競技場と競技場の間の競技場は必須である。アリーナと物体を完全にきれいに掃除しないと、マウスの自発的な活動が歪められ、真の認知能力がマスキングされる可能性がある。調査官は、これらの手技を行う際には、個人用衛生用品およびコロン/香水の使用も最小限にすべきである。最後に、齧歯類は、学習や記憶を含む多くの明白な行動20において昼間と日常の強い変化を示す。したがって、基礎行動および認知能力の日内リズムによる変動を最小限に抑えるために、すべての試験は、コホートおよび研究を通して同一の時刻に行うべきである。
さらに、新規物体認識に関しては、試料と試験フェーズとの間の遅延間隔、および環境中の物体の選択および配置が重要なパラメータである。記憶は3つの異なる形態で存在する：短期memオーリー（STM）、中間期記憶（ITM）および長期記憶（LTM） 22,23を含む 。サンプルフェーズとテストフェーズの間隔を分（STM）から時間（ITM）または日（LTM）に変更すると、手順12でテストされたメモリのタイプが変更されます。さらに、新規物体認識試験を実施する前に、探索の潜在的な偏りについて、多くの物体をマウスの試験コホートでスクリーニングすべきである。テストコホートに対して過度に魅力的または反発的な対象物は、新規対象認識を評価する際に使用することができない。理想的には、テストに使用されるすべてのオブジェクトがアリーナに配置されると、ナイーブなコホートのマウスから等しい探索時間が引き出されます。オブジェクトの不十分なテストおよび最適化は、新規オブジェクト認識の能力を著しく低下させる可能性がある。
変更とトラブルシューティング
このような要素を増やすにはいくつかの要因があります。ここに記載されている認知テストの見かけの変動性。 ADの多くのマウスモデルは、認知エンドポイントとして測定された行動をマスクしたり、変更したりすることができる、高力学的な運動3を示す。さらに、セックス24,25,26 、さらには母系遺伝子型27でも、ADマウスモデルにおける神経病理学および認知表現型の発達および進行に影響を与えうるという証拠が増えている。予期せぬ変動または行動課題の実施の失敗は、これらの要因のいずれかに起因する可能性があります。最初に特定の行動テストを実施する場合、結果は常に性別、年齢、および該当する場合、母親の遺伝子型によって層別化されるべきである。さらに、この手順で概説されている品質チェックは、機能亢進または他の常同行動が認知エンドポイントの定量化を妨げていないことを確実にするために常に実行されるべきである。
環境アイロンメントは、げっ歯類の自発的な探索行動にも影響を及ぼし得る。研究者に検出されないにおいや音は、自発的な行動に依存する認知テストの結果を歪曲させ、マウスを引きつけるか、または反発する可能性があります。最初にY字型迷路または新規物体認識を確立するとき、対象物および/または環境の探索に位置偏りがないことを確実にするための制御手段の実行が不可欠である。位置の偏りが観察された場合、研究者は環境を徹底的に精査し、照明、アリーナの配置、施設内の他の部屋（ すなわち 、交通量の多い場所や重機の近くではない）
テスト環境への慣れは、新規オブジェクト認識テストで最適なパフォーマンスを達成するために重要です。例えば、不十分な慣れによる総探査時間の短縮が考えられる。 procの代わりに（セクション2）およびアリーナ（セクション4.2）の慣習、取扱いおよび習慣への慣れを2日連続して3,5分間のセッションとして実施することができる。
技術の限界
どのような手順でも、これらの行動テストには限界があります。これらの手順は、様々な皮質領域および海馬の機能を試験するために採用されている。マウスモデルがこれらの試験によって調べられた脳領域の機能的欠損を示さない場合、これらの技術は有用ではない。さらに、我々は、短期記憶を調べる認知試験を選択した。前臨床評価下での化合物の作用機序が短期記憶に影響しないことが予期されない場合には、これらの手順を適宜変更する（ すなわち 、長期記憶を試験するために試料試験相間隔を長くする）。最後に、これらのテストでは動かされない振る舞いを使用します。したがって、マウスモデルがexcesである場合環境の探索を妨げる他の常同振る舞いを表示する場合、これらの手順は最適ではない可能性があります。代わりに、Tg2576または他のβ-アミロイドーシスマウスモデル、またはrTg4510またはタウオパシー3の他のマウスモデルのための空間的水迷路の恐怖調節を使用することができる。
今後のアプリケーション
これらの手順が実験室でうまく採用されれば、追加の認知機能的運動測定を評価するためにいくつかの修正または拡張を行うことができる。例えば、新規オブジェクト認識タスクを変更して、マウスがオブジェクト13の配置の変化を認識できるかどうかを判断する。あるいは、オブジェクトを使用する代わりに、他のマウスを使用して、社会認識のテストを実装することもできます。四肢の抱き合わせ及び運動機能に関して、ワイヤーハンギング及び/又はグリップ強度試験でその試験を補うことができる。テストこの方法で詳述された方法は、ADの翻訳マウスモデルにおいてインビボでの有効性を有する化合物をスクリーニングするための固体塩基を形成し、特定のマウスモデルを最もよく調べたり、独特の創薬プログラムのニーズを満たすために、 。
Disclosures
JM Levensonは、Proclara Biosciences、Inc.に雇用されています。C. Miedel、J. Patton、A. Miedel、およびE. MiedelはHilltop Laboratory Animalsに雇用されています。
Acknowledgments
著者には謝辞はありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Topscan Lite-High Throughput | Cleversys | Automated behavioral analysis. Includes cameras and video acquisition system, laptop. | |
| ObjectScan | Cleversys | Software module for accurate object exploration quantification | |
| Open field for mouse | Cleversys | CSI-OF-M | Arena for novel object recognition |
| Y-maze for mouse | Custom | Arms: 30 cm long, 10 cm wide, 20 cm high walls, placed 120 deg apart. | |
| Camera mount for open field | Custom | Custom | 76 cm tall, 115 cm wide, cameras mounted @ 30 cm in from either side. Two mounts, each covers two boxes. |
| Camera mount for Y-maze | Custom | Custom | 76 cm tall, 115 cm wide, cameras mounted @ 30cm in from either side. One mount covers two mazes. |
| Marbles | Inperial Toy | 8565 | Standard (15.5 mm Dia) glass marbles. |
| Dice | Cardinal Industries | 770 | Standard (0.650 inch) white dice with black dots. |
| LOCTITE Fun-Tak | Henkel | B018A3AG0W | Standard blue sticky tak |
| EtOH | Nexeo Solutions | 82452 | 100% Ethanol Diluted to 70% using distilled Water |
| dH2O | Tulpenhocken Spring Water Co. | - | PA D.E.P. #31, NJ D.O.H. #0049, NYSHD Cert. #320 |
| Paper towels | Procter & Gamble | B019DM86LA | Bounty, White |
| Handheld video camera | Apple, Inc. | MKV92LL/A | Acquisition of Limb clasping video, Iphone 6S Plus (or functional equivalent). |
| Gloves | SafePOINT, L.L.C. | GL640-2 | Standard, Powder free Latex Gloves, Medium |
| Light meter | Dr. Meter | LX1330B | Lighting @ the bottom of Open Field= 35 LUX, Lighting @ bottom of Y-Maze= 32 LUX |
| Bleach germicidal wipes | Clorox | Sterilization of equipment during & after use |
References
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