Summary
תיאר כאן היא מבוימת, התנהגות ההקרנה התנהגותית שניתן להשתמש בהם כדי המסך עבור תרכובות כי התערוכה יעילות vivo על התנהגויות מוטוריות קוגניטיבית ופונקציונלית מודלים עכבר מהונדס של עמילואידוזיס β ו tauopathy. שיטות אלה מותאמות לתצוגת תרכובות עבור פעילות במשימות זיכרון לטווח קצר ולזיכרון עבודה.
Abstract
כאן אנו מתארים גישה מבוימת, בדיקות התנהגותיות שניתן להשתמש בהם כדי המסך עבור תרכובות כי התערוכה יעילות vivo על התנהגויות מוטוריות קוגניטיבית ופונקציונלית מודלים עכבר מהונדס של עמילואידוזיס β ו tauopathy. הפרדיגמה כוללת מבחנים לחילופין ספונטני במבוך Y, זיהוי אובייקט חדש, ואחיזת גפיים. בדיקות אלה נבחרו כי הם: 1) לחקור פונקציה של תחומים קוגניטיביים או מוטוריים וקורלציה מעגלים עצביים הרלוונטיים למצב המחלה האנושית, 2) יש endpoints מוגדרים בבירור, 3) יש ליישום בקלות בדיקות בקרת איכות, 4) ניתן להפעיל ב פורמט מתון, 5) דורשים התערבות קטנה על ידי החוקר. שיטות אלה מיועדות לחוקרים המעוניינים להרכיב תרכובות לפעילות במשימות זיכרון לטווח קצר ולזיכרון עבודה, או התנהגויות מוטוריות תפקודיות הקשורות למודלים של עכברים לאלצהיימר. השיטות המתוארות כאן משתמשות בבדיקות התנהגותיותגיל מספר אזורי מוח שונים, כולל היפוקמפוס ואזורים קליפתיים שונים. חוקרים המעוניינים במבחנים קוגניטיביים, אשר מעריכים באופן ספציפי את הקוגניציה בתיווך אזור מוח בודד, יכולים להשתמש בטכניקות אלה כדי להשלים בדיקות התנהגותיות אחרות.
Introduction
מחלת האלצהיימר (AD) היא הפרעה נוירודגנרטיבית פרוגרסיבית הגורמת לירידה קוגניטיבית מתמשכת המשפיעה על כ -44 מיליון אנשים ברחבי העולם. כרגע אין טיפולים זמינים עבור AD כי הם שינוי המחלה, תוך שימת דגש על הצורך הדחוף גילוי פרה קליני של אסטרטגיות טיפוליות חדשניות עבור מחלה זו. נבנו מספר מודלים שונים של עכבר מהונדס, אשר מסכמים היבטים שונים של AD 1 , 2 , כולל ליקויים בתחומים קוגניטיביים המופרעים בחולים 3 . מודלים אלה עכבר מייצגים כלי שימושי להנעת סינון יעיל in vivo .
כאשר מעריכים תרכובת פוטנציאלית ביעילות vivo , יש לנקוט בגישה מבוישת המסכים ליעילות בתחומים קוגניטיביים מתאימים, וכן לעקוב אחר התנהגויות שעלולות להשפיע על נקודות הקצה הספציפיות המשמשותSsess קוגניציה. מודלים רבים של עכבר מהונדס של AD היפראקטיביות התערוכה והתנהגויות אחרות שעלולות להפריע למבחן קוגניטיבי מסוים, ולאסור על השימוש בו בהקרנת סמים 4 . יתר על כן, עבור גישה להיות מיושם בסביבת ההקרנה סמים, בדיקות ספציפיות בשימוש צריך לקיים לפחות תפוקה מתונה, יש להגדיר נקודות קצה ברורה, הליך הדורש התערבות מינימלית על ידי החוקרים. באמצעות קריטריונים אלה, מסכי התנהגותי יכול להיות מיושם כי התערוכה reproducibility, נמוך intra- בין assay השונות וגודל האפקטים הדרושים להקרנה מתחם. מפורט כאן הן השיטות יש לנו מועסקים המסך עבור תרכובות יעיל בהפחתת פנוטיפים קוגניטיביים מוטוריים הנוכחי מודלים עכבר מהונדס של עמילואידוזיס β ו tauopathy 5 , 6 . השיטות המתוארות מותאמות מפרדיגמות התנהגותיות שכיחות שדווחו ב- lIterature 7 , עם אופטימיזציות ספציפיות ובדיקות בקרת איכות, כך שהם עשויים לשמש מודלים עכבר מהונדס רלוונטי לספירה. פרוטוקול זה ניתן להשתמש עם מגוון רחב של נתונים רכישת מערכות ניתוח והנחה כי החוקר יש ידע של התוכנה הקשורים.
Protocol
השיטות המפורטות בפרסום זה נסקרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) בחיות מעבדה בהילטופ על מנת להבטיח טיפול נאות, שימוש וטיפול אנושי בבעלי חיים בהתאם לחוקים ולתקנות הפדראליים, הממלכתיים והמקומיים, כגון כפי תקנות הפדרלי לרווחת בעלי חיים, או AWRs (CFR 1985), וכן מדיניות שירות בריאות הציבור על טיפול הומאני ושימוש בחיות מעבדה, או PHS מדיניות (PHS 1996).
1. הנחיות כלליות לכל הערכה התנהגותית
- לפני כל טיפול בבעלי חיים, לכסות כרטיסי כלוב קיים עם כרטיס כלוב חדש המציין רק את מזהה בעלי חיים ייחודי, עיוור.
הערה: חוקרים אשר מטפלים בעכברים במהלך מינון השכיבה / פלסבו אינם מורשים לטפל בעכברים לצורך הערכה התנהגותית. - לעמעם או לכבות את אורות התקרה ולהתאים את התאורה כך תאורה על הרצפה של הזירה או מבוך הוא 30-35 לוקס.
- Fאו מחקרים הנמשכים מספר שבועות, לרשום משקולות הגוף מדי שבוע כמדד עקיף של הבריאות הכללית.
הערה: בדיקות נוספות של כלוב צד עבור איכות המעיל, היציבה, ההליכה והתנועה הספונטנית יכולות להיכלל אם יש צורך בבדיקות בריאותיות חזקות יותר.
2. התחכמות עכברים לטיפול על ידי חוקרים
- יומיים לפני כל בדיקה התנהגותית, הרגל את העכברים לטיפול. הסר את הכלוב מן המתלה כלוב ומניחים על פני השטח.
- מוציאים את המכסה מהכלוב. ידרו את העכבר בדיוק כפי שהוא יטופל במהלך ביצוע הבדיקה ההתנהגותית הקרובה. מניחים את העכבר לתוך כף יד מעל הכלוב הביתה.
- למדוד את חביון לקפוץ מן היד של החוקר בחזרה לכלוב הביתה. החזק עכברים לכל היותר 5 s.
הערה: עכברים המציגים זמן אחזור של ≥2 נחשבים "מורגל". עכברים להציג התעכבויות <2 s במהלך המשפט הראשון לעבור 2 habituatio נוספיםבאותו יום. - יש את העכברים לעבור 2 ימים רצופים של טיפול הרגלה. שים לב לכל עכבר שאינו מורגל עד סוף היום השני .
3. הערכת זיכרון עבודה מרחבית על ידי מדידת חלופה ספונטנית במבוך Y
- לפני השימוש הראשוני, לנקות ביסודיות את Y- מבוך עם קוטל חידקים קוטל חידקים אקונומיקה, 70% EtOH, ואחריו dH 2 O 9 . ברור לציין את זרועות המבוך כמו 'A', 'B' & 'C' או אחרים מזהים ייחודיים.
- לפני תחילת המושב בדיקה, להגדיר את מערכת הרכישה נתונים או מצלמות וידאו ולהגדיר מעקב נאות של עכברים במבוך. כייל את המרחק במבוך באמצעות תמונות וידאו שנתפסו של סרגל או אובייקט אחר בעל אורך ידוע.
הערה: השיטות ההתנהגותיות בהליך זה יפעלו עם מגוון רחב של מערכות לרכישת נתונים והמחברים מניחים AnyoNe ביצוע הליך זה הוא בקיאים בשימוש שלהם נבחרים רכישת המערכת. ניתוחי הספק מצביעים על כך שגודל מדגם של 10-15 עכברים לכל קבוצה נדרש עבור β ≤0.2. - הסר את הכלוב מן המדף בעדינות להניח אותו על שולחן קרוב למבוך Y. הסר את העכבר מכלוב הבית שלה בעדינות למקם אותו בזרוע אחת של מבוך Y, מול המרכז. יש צעד חוקר רחוק מספיק מהמבוך, כך העכבר לא יכול לראות את החוקר.
- הפעל את הנתונים / רכישת וידאו מיד לאחר מיקום העכבר לתוך המבוך.
- לחץ על לשחק ולהקליט את ההתנהגות הספונטנית עבור כל עכבר במשך תקופה של 10 דקות. לאחר הפגישה הושלם, בעדינות במקום את העכבר בחזרה לכלוב הביתה שלה להחזיר את הכלוב על המדף.
- לנקות את המבוך ביסודיות בין כל מפגש עם קוטל חידקים קוטל חידקים אקונומיקה, 70% EtOH, ואחריו dH 2 O. חזור משלב 3.4 כדי להעריך את כל micה.
- לאחר שכל העכברים השלימו את חקר ה- Y- מבוך, לנתח את הנתונים ממערכת הרכישה או באופן ידני את קטעי הווידאו של המפגשים. כניסה הזרוע מתרחשת כאשר כל 4 כפות של העכבר לחצות את הסף של האזור המרכזי לתוך הזרוע ואת החרטום של החיה מכוונת אל קצה הזרוע.
הערה: נקודות הקצה שינותחו כוללות: מרחק כולל של מרחק במבוך, מרחק כולל בין כל זרוע (כולל אזור מרכזי), משך הזמן הכולל בכל זרוע (כולל אזור המרכז), מספר הזנות הכולל, מספר ערכים שהוכנסו לכל זרוע, ורשימה רצופה של נשק נכנסה כדי להעריך מספר של חילופים שנעשו. - חלופה ספונטנית מתרחשת כאשר עכבר מזין זרוע אחרת של המבוך בכל אחת משלוש תנועות זרועות רצופות. תחליף ספונטני% מחושב לאחר מכן עם הנוסחה הבאה.
הערה: לדוגמה, iF סדר הזרוע היה: ABCCBABCABC, החוקר היה ציון בסך הכל 6 ספונטניות חילופים (לפי סדר: ABC, CBA, ABC, BCA, CAB, ABC). עם סך של 11 כניסות זרוע, הספונטנית חילופי% יהיה 67%. - בצע את בדיקות בקרת האיכות הבאות כדי להבטיח שהנתונים מייצגים הערכה בלתי מוטה של החלפה ספונטנית.
- ביצוע המתאם של פירסון של חילופי ספונטנית% לשני מרחק הכולל נסע ומספר הזרוע ערכי עשה.
הערה: אם יש מתאם משמעותי של חילופי ספונטני% או פרמטר, אז הנתונים צריכים להיות בחן נוספת בשל ההשפעה הפוטנציאלית של תנועה היפרדינמית על נקודת הקוגניטיבי לכאורה 10 . - לנתח את מספר הערכים שנעשו לכל זרוע עם בדיקה ANOVA בכיוון אחד.
הערה: אם ניתוח זה הוא משמעותי אז זה יציין נוכחות של רמזים בסביבה כי משך עכברים כדי regi מסויםעל המבוך.
- ביצוע המתאם של פירסון של חילופי ספונטנית% לשני מרחק הכולל נסע ומספר הזרוע ערכי עשה.
4. הערכה של זיכרון הכרה לטווח בינוני על ידי מדידת זיהוי אובייקט רומן 11 , 12 , 13
- עבור כל שלב של בדיקה זו, לנקות ביסודיות את שדה פתוח שדה עם קוטל חידקים קוטל חידקים אקונומיקה, 70% EtOH ואחריו dH 2 O לפני השימוש הראשוני.
- יום לפני החשיפה לאובייקט, הרגל את העכברים לזירת השדה הפתוח.
- לפני תחילת הפגישה הרגילה, להקים את מערכת הרכישה נתונים או מצלמות וידאו ולאשר מעקב נאות של עכברים במבוך. כייל את המרחק בזירה באמצעות תמונות וידאו שנתפסו של סרגל או אובייקט אחר בעל אורך ידוע. סמן את פינות הזירה בתוכנה כדי לאפשר ניקוד של הטיות positional.
הערה: השיטות ההתנהגותיות בהליך זה יעבדו עם מגוון רחב של רכישת נתוניםגבעולים ואת המחברים להניח שמישהו ביצוע הליך זה הוא בקיאים בשימוש שלהם רכישת נתונים נבחרים המערכת. מנתח כוח עולה כי גודל המדגם של 15-20 עכברים לכל קבוצה נדרשים עבור β ≤0.2. - הסר את הכלוב מן המדף בעדינות במקום על שולחן בסמיכות לזירה.
- הסר את העכבר מן הכלוב הביתה בעדינות במקום העכבר במרכז הזירה. הפעל את תוכנת המעקב ו / או מערכת הקלטת וידאו מיד לאחר הנחת העכבר לתוך הזירה.
- אפשר עכברים לחקור באופן חופשי את הזירה במשך 30 דקות.
הערה: במהלך תקופה זו, החוקרים לא יפריעו לעכברים. - לאחר הפגישה הרגל, מקום עכברים בחזרה לכלוב הבית שלהם לנקות את הזירה ביסודיות עם קוטל חידקים קוטל חידקים אקונומיקה, 70% EtOH ואחריו dH 2 O.
- חזור משלב 4.2.2 עד שכל העכברים היו מורגל לזירה.
- אחרי כל העכברים היו הרגלUated כדי בזירה, לנתח את הווידאו.
הערה: נקודות קצה לנתח כוללות את המרחק הכולל נסע בזירה ואת משך הזמן ליד כל פינה. אם רלוונטי למודל העכבר, התנהגויות סטריאוטיפיות נכללות בניתוחים אלה ( כלומר , קפיצה פינית מיוקלונית, חגה וכו ' ). עכברים המציגים הטיות בזמן המושקע באזורים מסוימים בזירה אינם נכללים בניסויים נוספים, שכן הדבר ישפיע על חקר האובייקט.
הערה: השלב הראשון של זיהוי אובייקט חדש כולל הכרת עכברים לאובייקט. הנה חלק זה של ההליך רומן הכרה אובייקט ייקרא השלב המדגם. - לפני תחילת הפעלה מדגם שלב, במקום חפצים לתוך הזירה לתקן אותם על הרצפה עם מרק הרכבה, כך בעלי חיים לא יכולים להזיז את האובייקטים. יישר שני אובייקטים זהים לקיר מסוים עם מרחק מספיק בין הקירות לחפצים כך העכברים יכולים לחקור באופן חופשי את האובייקטים מכל angLes.
- הגדרת מערכת רכישת נתונים או מצלמות וידאו ולאשר מעקב נאות של עכברים ואובייקטים במבוך. כייל את המרחקים בזירה באמצעות תמונות וידאו שנתפסו של סרגל או אובייקט אחר בעל אורך ידוע.
- סמן את פינות הזירה בתוכנה כדי לאפשר ניקוד של הטיות positional. סמן אובייקטים בתוכנה ועקוב אחר ההתנהגות האקספלורציה שלהם בנפרד לכל אובייקט ( כלומר , "אובייקט A" ו - "אובייקט B").
- הסר את הכלוב מן המדף בעדינות להניח אותו על שולחן בסמיכות לזירה.
- הסר את העכבר מן הכלוב הביתה בעדינות למקם אותו במרכז הזירה, מול האובייקטים.
- אפשר העכבר כדי לחקור באופן חופשי את האובייקטים במשך 15 דקות. במהלך תקופה זו לא להפריע את העכברים.
- בסוף הפגישה, בעדינות במקום את העכבר בחזרה לכלוב הבית שלה. נקה את הזירה ואת האובייקטים עם EtOH 70% ו dH 2 O. מניחים את האובייקטים בחזרה לתוך הE eena.
- חזור על שלב 4.2.11 עד שכל העכברים מוכרים לאובייקט.
- לאחר כל עכברים כבר מוכר אובייקט, לנתח את קטעי הווידאו.
הערה: חיפושים אובייקט נספרים פעם אחת הקריטריונים הבאים כבר נפגשו: העכבר מכוונת לכיוון האובייקט, חוטם הוא בתוך 2 ס"מ של האובייקט, נקודת האמצע של הגוף של החיה הוא מעבר 2 ס"מ מן האובייקט, ואת הקריטריונים הקודמים התקיימו לפחות 1 s. בנוסף, אם בעל חיים יש מרוצה הקריטריונים חקירה אבל מציג חוסר תנועה עבור 10 שניות אז נחשף את exploratory הוא סיים. - חישוב ציון הטיה אובייקט עבור כל עכבר כדלקמן.
הערה: עכברים המציגים ציון נטייה לאובייקט מתחת ל -20% או מעל 80% אינם נכללים בניסויים נוספים.
- לפני תחילת הפגישה הרגילה, להקים את מערכת הרכישה נתונים או מצלמות וידאו ולאשר מעקב נאות של עכברים במבוך. כייל את המרחק בזירה באמצעות תמונות וידאו שנתפסו של סרגל או אובייקט אחר בעל אורך ידוע. סמן את פינות הזירה בתוכנה כדי לאפשר ניקוד של הטיות positional.
- השלב הסופי של הכרה אובייקט חדש כרוך בהערכת התנהגות exploratoryמכוונת הן לאובייקט רומן ומוכר בסביבה, המכונה כאן שלב מבחן. שלב זה מבוצע 2-3 שעות לאחר השלמת המדגם שלב.
- לפני תחילת הפגישה שלב הבדיקה, במקום חפצים לתוך הזירה לתקן אותם על הרצפה, כך החיות לא יכול להזיז את האובייקטים.
- מניחים את האובייקטים באותו מיקום בזירה יחסית לשלב 13 .
- לאזן את המיקום היחסי של אובייקטים חדשים ומוכרים על פני גנוטיפים וקבוצות טיפול.
- ודא שיש מספיק מרחק בין הקירות לחפצים כך העכברים יכולים לחקור באופן חופשי את האובייקטים מכל הזוויות.
- הגדרת מערכת רכישת נתונים ו / או מצלמות וידאו. לאשר מעקב נאות של עכברים וחפצים במבוך. כיול מרחקים בזירה באמצעות תמונות וידאו שנתפסו של סרגל או אובייקט אחר בעל אורך ידוע.
- מארק פינות של הזירה ב softwהם לאפשר ניקוד של הטיות positional. סמן אובייקטים בתוכנה ועקוב אחר התנהגות אקספלורציה עבור כל פריט בנפרד ( כלומר , "רומן" ו"מוכר ").
- הסר את הכלוב מן המדף בעדינות להניח אותו על שולחן בסמיכות לזירה.
- בעדינות להציב חיות לתוך מרכז הזירה, מול האובייקטים. שיא עכברים בחופשיות לחקור חפצים במשך 10 דקות.
- בסוף המושב הבדיקה, להסיר עכברים מן הזירה מקום עכברים בחזרה לכלוב הביתה שלהם. בזירה נקייה לחלוטין אובייקטים עם קוטל חידקים קוטל חידקים אקונומיקה, 70% EtOH ו dH 2 O לאחר כל מפגש.
- חזור משלב 4.4.3 עד שכל בעלי החיים הוערכו.
- לאחר בדיקה אובייקט נמדדת עבור כל העכברים, קטעי וידאו מנותחים.
הערה: חקירת אובייקטים נספרים פעם אחת הקריטריונים הבאים כבר נפגשו: העכבר מכוונת לכיוון האובייקט, חוטם הוא בתוך 2 ס"מ של האובייקט, נקודת האמצע שלהגוף של החיה הוא מעבר 2 ס"מ מן האובייקט, ואת הקריטריונים הקודמים כבר מילא לפחות 1 s. בנוסף, אם בעל חיים יש מרוצה הקריטריונים חקירה אבל מציג חוסר תנועה עבור 10 שניות אז נחשף את exploratory הוא סיים. - להעריך הערכה אובייקט חדש על ידי השוואת זמן בילה לחקור את הרומן לאובייקט מוכר. שלוש שיטות דווחו בספרות.
- ניתוח זמן גולמי בילה לחקור הן אובייקטים רומן מוכר באמצעות בדיקה חוזרת ונשנית. שיטה זו משמשת בצורה הטובה ביותר כאשר גנוטיפ ו / או טיפול אינם משפיעים על זמן החיפוש הכולל.
- חישוב העדפה חידוש, באמצעות המשוואה:
הערה: זה מספק את אחוז הזמן שבילה לבחון את האובייקט הרומן ביחס לזמן הכולל בחקר חפצים. הערכים נעים בין 0% (ללא חקירה של אובייקט חדש) ל -100% (חקר רק של הרומן obJect), עם ערך של 50% המציין זמן שווה בילה לחקור אובייקטים רומן מוכר. - חישוב מדד ההפליה 11 , תוך שימוש במשוואה:
הערה: זה מניב את ההבדל בזמן בילה לחקור את הרומן ואת האובייקטים מוכרים יחסית לזמן הכולל בילה לחקור אובייקטים. הערכים נעים בין -1 (חקר רק של האובייקט המוכר) ל +1 (חיפוש רק של האובייקט החדש, עם ערך 0 המציין זמן שווה בילה לחקור אובייקטים רומן ומוכר.
- הסר בעלי חיים שאינם משתתפים במפגש הבדיקה עקב תנועה היפרדינמית או סטריאוטיפים אחרים, מתוך שיקול 11 .
הערה: הקריטריונים המשמשים להסרה חייבים להיות אובייקטיביים ונקבעים מראש למודל העכבר ( כלומר , <5% באחוזים למשך זמן החיפוש הכולל ו -> 100 ממוצעזווית הפגישה במהלך המושב הבדיקה או> 50 אחוז באחוז הזמן מציג פינה מיוקלונית קופץ).
- לפני תחילת הפגישה שלב הבדיקה, במקום חפצים לתוך הזירה לתקן אותם על הרצפה, כך החיות לא יכול להזיז את האובייקטים.
5. הערכת תפקוד Corticospinal בעכברים עם Clbing אימפ 14
- וידאו לתעד את כל הפגישה. הקלט את הווידאו באמצעות התקן כף יד נייד ( כלומר , טלפון חכם או שווה ערך).
הערה: מנתחי הספק מצביעים על כך שגודל מדגם של 10-15 עכברים לכל קבוצה נדרש עבור β ≤0.2. - הסר את הכלוב הביתה מן המדף ומניחים אותו על השולחן. תעד את מזהה החיה בסרטון לפני השלב הבא.
- בעדינות להסיר את העכבר מן הכלוב שלה להשעות בזנב של 5-10 s. על הסרטון להקליט את החיה ואת הכפות הקדמיות של החיה בעודם מושעים.
- לאחר לכידת לפחות 5 של וידאו, מניחים את העכבר בחזרה לכלוב הבית שלה, ולהחזיר את הכלוב אל המדף.
- נקה את השולחן. חזור משלב 5.2 עד כל העכברים היו recorde ד.
- ציון הגפיים clasping מ קטעי וידאו של עכברים מושעה על ידי הזנב שלהם בסולם של 0-4 (ראה טבלה 1 לתיאור של ניקוד). בדוק קטעי וידאו של עכברים מושעה ולאחר מכן להקצות ציון על פי הקריטריונים הבאים.
- שום איבר לא אוחז. תוסף בריחה רגיל. אחת הגפיים האחוריות מציגה spay חלקי ולאובדן ניידות. בהונות התערוכות רגילות.
- שתי הגפיים האחוריות מפגינות חלק בלתי שלם ואובדן ניידות. בהונות התערוכות רגילות.
- שתי הגפיים האחוריות מתעוותות באצבעות מסולסלות וחוסר תנועה.
- פורלימבים וגפיים אחוריות מתעגלות ומשולבות, בהונות מסולסלות ובאי-תנועה.
- כל עכברים הם הבקיע על ידי 2 חוקרים עצמאיים. כל עכבר שבו 2 ציונים שונים על ידי יותר מ 1 נקודה הוא rescored שוב.
- ציונים שונים הם ממוצעים.
P_upload / 55523 / 55523table1.jpg "/>
טבלה 1: תיאור ציוני קליעה.
Representative Results
Aged Tg2576 עכברים התערוכה גירעונות חזקים בחילופים ספונטניים שנעשו בתוך Y- מבוך 15 , 16 , פנוטיפ שניתן לשכפל באמצעות השיטות המפורטות כאן ( איור 1 א ). בעוד מגמה של ערכים זרוע מוגברת נצפתה בעכברים אלה ( איור 1 ב ), hyperactivity שנצפה בשורה זו של עכברים לא השפיעו על קצב חילופי ספונטני ( איור 1 ג ). לעומת זאת, עכברים rTg4510 בגילאי מופיעים התערוכה שינוי ספונטני מוגבר כאשר הניח לתוך מבוך Y ( איור 1D ). זאת בשל hyperactivity קיצוני ( איור 1E ) ו סטריאוטיפי 10 , אשר באופן משמעותי להפריע מדידה של חילופי ספונטני ( איור 1F ). כאשר בתחילה להעריך עכברים במשימה זו, חשוב כדי להבטיח כי ערכי הזרוע ו / או המרחק נסע לאהמתואמים באופן משמעותי עם קצב ההחלפה הספונטנית.
לפני הערכה של זיהוי אובייקט חדש, עכברים הם הרגיל לזירה שבה הבדיקה תבוצע. במהלך התרגול, hyperactivity ( איור 2 א ) ותהליכים סטריאוטיפיים אחרים הרלוונטיים למודל העכבר ניתן להעריך. במהלך שלב המדגם, זה קריטי למדוד חקר של כל אובייקט בנפרד, כך עכברים המפגינים הטיות משמעותיות בהתנהגות אקספלורציה ניתן להרחיק מן הערכה נוספת ( איור 2 ב , מעגלים פתוחים). זיהוי אובייקט רומן נבדק על ידי השוואת חקר של אובייקט מוכר חדשני, והוא נפוץ ניתח בשלוש דרכים שונות. אם הזמן הכולל exploratory הוא להשוות בין גנוטיפים ו / או קבוצות טיפול, אז זמן גולמי לבחון את כל האובייקט ואת המתאים בדיקות חוזרות ונשנות ניתן להשתמש כדי לקבוע אם היו הבדלים r אובייקט חדש( איור 2 ג ). אם עכבר מסוים מציג הבדלים בזמן exploratory הכולל, זיהוי אובייקט חדש ניתן להעריך באמצעות העדפה חידוש ( איור 2 ד ) או מדד ההפליה ( איור 2E ).
הידוק הגפיים הוא בדיקה מוטורית תפקודית שמכמת את הגירעונות בתפקוד הקורטיקוספינלי. הידוק הגפיים, שאינו מדד קוגניטיבי, נצפתה במספר דגמי עכבר מהונדס של טאו 6 , 17 , 18 , 19 , ומשחזר חלק מהליקויים התפקודיים של התפקוד הנבדק שנצפו בחולים בשלב מאוחר של AD. השעיה של עכברים על ידי הזנב מעורר תגובה לברוח ( איור 3 א , "0"). הגירעונות ביכולת לפצל את הגפיים האחוריות ולהאריך את בהונות הם הבקיע על פי חומרתם בסולם של 0-4 ( איור 3א). באמצעות הנוהל המתואר כאן, ניתן להבחין clabbing איבר משמעותי בעכברים rTg4510 ( איור 3 ב ).
איור 1: חלופה ספונטנית במבוך Y. ( א ) כאשר להציב לתוך מבוך Y, עכברים לאמץ אסטרטגיית החיפוש לאבד משמרת כי התוצאות דפוס של חקירה לפיה כל זרוע נחקרת רק פעם אחת עבור כל 3 ערכי הזרוע. עכברים Tg2576 גילאי התערוכה גרעון משמעותי בחילופין ספונטנית. באמצעות ההליכים המתוארים בשיטה זו, שיקום משמעותי של חילופי ספונטני נצפתה לאחר טיפול עם תרכובת קניינית. הנתונים נותחו באמצעות ANOVA חד-כיוונית והשוואות פוסט-הוק ל- Tg-PBS בוצעו באמצעות המבחן של דנט. ** p <0.01. ברים שגיאה מצביעים על SEM. ( ב ) מספר כניסות הזרוע לא היה שונה באופן משמעותי על פני כלשל קבוצות פיקוח ניסוי זה. הנתונים נותחו באמצעות מבחן ANOVA חד כיווני. ברים שגיאה מצביעים על SEM. ( ג ) לא היה מתאם בין החלפה ספונטנית לבין מספר הזרועות שהוזנו, מה שמראה כי כל ההבדלים בפעילות הספונטנית של תנועה לא השפיעו על כימות הספונטניות. מבחן המתאם בוצע באמצעות ניתוח המתאם של Pearson. ( D ) כאשר להציב לתוך מבוך Y, rTg4510 עכברים (6 חודשים) מופיעים התערוכה באופן משמעותי יותר ספונטנית חילופי יחסית עכברים WT littermate. הנתונים נותחו באמצעות ANOVA חד-כיוונית והשוואות פוסט-הוק ל Tg-PBS בוצעו באמצעות הבדיקה של דנט. ** p <0.01. ברים שגיאה מצביעים על SEM. ( E ) rTg4510 עכברים עשה משמעותית יותר ערכי הזרוע עקב תנועה קיצונית hyperdynamic שלהם. הנתונים נותחו באמצעות ANOVA חד-כיוונית והשוואות פוסט-הוק ל Tg-PBS בוצעו באמצעות הבדיקה של דנט. *** p <0.001. ברים שגיאה מצביעים על SEמ '( F ) התנהגות חילופי ספונטנית מתואמת באופן משמעותי עם ערכי הזרוע, המציין את הפנוטיפ של היפראקטיביות הדינמית הסתיר חילופי ספונטני אמיתי. בדיקת המתאם בוצעה באמצעות ניתוח המתאם של Pearson (r = 0.7, p <0.0001). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: זיהוי אובייקט רומן. ( א ) תרגול ארנה מאפשר מדידה של תנועה ספונטנית והתנהגויות סטריאוטיפיות אחרות הרלוונטיות למודל עכבר מסוים. הנה, בגילאי Tg2576 עכברים (22 חודש) התערוכה באופן משמעותי יותר תנועה ספונטנית יחסית עכברים WT littermate. הנתונים נותחו באמצעות ANOVA חד-כיונית והשוואות פוסט-הוק ל Tg-Veh בוצעו באמצעות דנט 'S מבחן. ** p <0.01. ברים שגיאה מצביעים על SEM. ( ב ) במהלך שלב המדגם, מעקב אחר שני אובייקטים זהים היה במעקב בנפרד. עכברים שהציגו הטיות גדולות לעבר חקירה של אחד משני האובייקטים (מעגלים פתוחים) לא נכללו בשלב הבדיקה. ( C - E ) זיהוי אובייקט רומן הוערך על ידי מדידת חקר של אובייקט חדש ומוכר. זיהוי אובייקט רומן הוערך באמצעות ( ג ) זמן חיפושי גלם, ( ד ) העדפה חידוש או ( ה ) מדד ההפליה. הנתונים בחלונית C נותחו באמצעות ANOVA דו-כיוונית עם צעדים חוזרים ונשנים והשוואות זוגיות נעשו תוך שימוש במבחן של Sidak. הנתונים בחלוניות DE נבדקו באמצעות ANOVA חד-כיווני והשוואות פוסט-הוק ל - Tg-Veh נעשו תוך שימוש במבחן של דנט. * P <0.05, ** p <0.01. ברים שגיאה מצביעים על SEM. בבקשה תלחץכאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: הידוק לימפ. ( א ) נציג תמונות של עכברים המציגים דרגות שונות של clasping איבר כמתואר בטבלה 1. ( ב ) rTg4510 עכברים (6 חודשים) התערוכה איבר משמעותי clasping יחסית littermate עכברים WT כמו הבקיע באמצעות שיטות אלה. הנתונים נותחו באמצעות ANOVA חד-כיווני והשוואות פוסט-הוק ל- Tg-PBS בוצעו באמצעות המבחן של דנט. *** p <0.001, **** p <0.0001. ברים שגיאה מצביעים על SEM. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
משמעות הטכניקה ביחס לשיטות הקיימות
הליך זה תוכנן על המסך עבור פעילות vivo של תרכובות מודלים העכבר מהונדס של עמילואידוזיס β ו tauopathy. הגישה המבוצעת המוערכת כאן מבטיחה זיהוי של תרכובות יעילות בתחום הקוגניטיבי הרלוונטי ל- AD 3 . יתר על כן, הגישה המפורטת כאן משתמשת בבדיקות התנהגותיות שיש להן נקודות קצה מוגדרות בבירור, בדיקות בקרת איכות הניתנות ליישום בקלות, ניתנות להפעלה בפורמט תפוקה מתון, ודורשות התערבות מועטה מצד החוקר. מאפיינים אלה מביאים מבחנים המפגינים שחזור טוב בתוך בעלי חיים ועל פני קבוצות, וכתוצאה מכך משתנים נמוך בין interra ו- inter assay וגדלים השפעה (2 ≤ F ≤6), כי הם חזקים מספיק כדי לתמוך פרופיל התנהגותי בסביבת גילוי סמים.
צעדים קריטיים בתוך יחסי ציבורOtocol
מודלים עכבר רבים בשימוש עבור גילוי AD התנהגויות התערוכה עולה בקנה אחד עם חרדה מוגברת תוקפנות. זה הופך את הטיפול הרגיל חיוני לביצוע כל הבחינות ההתנהגותיות המתוארות כאן. כמו בדיקות אלה להסתמך על התנהגויות unmotivated, טיפול מחוספס על ידי החוקר עקב היפראקטיבי וחרד או אגרסיבי העכבר יכול להשפיע באופן משמעותי על הביצועים. חרדה מוגברת עלולה לגרום לכישלון לבצע את המשימה, ובכך להפחית את העוצמה הכוללת של הבדיקה. יתר על כן, רמות האור בזירה חיוניים להקל על התנועה הספונטנית הנדרשת עבור כל בדיקה. אור בהיר נוטה להגביר את החרדה ולדכא את התנועה במכרסמים, ולכן יש להקפיד להתאים את רמות האור הסביבתי ל 30-35 לוקס בזירה.
היבט קריטי נוסף של הפרוצדורה הוא מזעור של רמזים סביבתיים חזקים שיפריעו ליכולת של בעל חיים לבצע את המשימות. ניקיוןזירה אובייקטים בין פועל הוא חיוני כמו עכברים נמשכים ניחוחות חדש בסביבה. אי נקיון יסודי של הזירה והחפצים עלול לגרום להפיכת הפעילות הספונטנית של העכבר ולהסוות ביצועים קוגניטיביים אמיתיים. החוקרים צריכים גם למזער את השימוש במוצרים היגייניים אישיים ובבעלי קולון / בשמים בעת ביצוע הליכים אלה. לבסוף, מכרסמים מציגים שינויים ימיים ויומיים חזקים בהתנהגויות גלוי רבות 20 כולל למידה וזיכרון 21 . לכן, כדי למזער את השונות עקב מקצבים יומיומיים בהתנהגויות בסיסיות וביצועים קוגניטיביים, כל הבדיקות צריכות להיעשות באותו יום על פני קבוצות לימוד ומחקרים.
יתר על כן, במיוחד לגבי זיהוי אובייקט חדש, מרווח עיכוב בין המדגם שלב הבדיקה, ואת הבחירה ואת המיקום של אובייקטים בסביבה הם פרמטרים קריטיים. זיכרון קיים בשלוש צורות שונות: זיכרון קצר טווחאוריי (STM), זיכרון לטווח בינוני (ITM) וזיכרון לטווח ארוך (LTM) 22 , 23 . שינוי המרווח בין הדגימה לשלבי הבדיקה בין דקות (STM) לשעות (ITM) או ימים (LTM) ישנה את סוג הזיכרון שנבדק על ידי הנוהל 12 . יתר על כן, לפני הפעלת מבחן הרומן אובייקט הרומן, אובייקטים רבים צריכים להיות מוקרנים בקוהורט הבדיקה של עכברים עבור הטיות פוטנציאלים בחקר. אובייקט שהוא מושך מדי או דוחה למבחן המבחן לא ניתן להשתמש בו בעת הערכת הכרה אובייקט חדש. באופן אידיאלי כל האובייקטים שיועסקו במבחן, כאשר יוכנסו לזירה, יזכו בזמני חיפוש שווים מקבוצת עכברים נאיבית. בדיקות לקוי ואופטימיזציה של אובייקטים יכול להפחית באופן משמעותי את כוחו של זיהוי אובייקט חדש.
שינויים ופתרון בעיות
ישנם מספר גורמים שיכולים להגדיל אתשונות במבחנים הקוגניטיביים המתוארים כאן. מודלים עכבר רבים של AD התערוכה Hyperdynamic תנועה 3 אשר יכול להסוות או לשנות התנהגויות נמדדת כנקודת הקוגניטיבית. יתר על כן, יש ראיות גוברות כי מין 24 , 25 , 26 ואפילו גנוטיפ אימהי 27 יכול להשפיע על התפתחות והתקדמות של נוירופתולוגיה ופנוטיפים קוגניטיביים מודלים AD העכבר. השתנות או כישלון בלתי צפויים לביצוע משימה התנהגותית עשויים לנבוע מכל אחד מהגורמים הללו. כאשר מיישמים תחילה מבחן התנהגותי מסוים, התוצאות צריכות תמיד להיות מרובדות לפי מין, גיל, ואם רלוונטי, גנוטיפ מצד האם. בנוסף, בדיקות האיכות המתוארות בהליך זה צריכות תמיד להתבצע על מנת להבטיח כי היפראקטיביות או התנהגויות סטריאוטיפיות אחרות אינן מפריעות לכימות של נקודות קצה קוגניטיביות.
Anvגהץ יכול גם להשפיע על התנהגות ספונטנית exploratory של מכרסמים. ניחוחות או צלילים שאינם ניתנים לגילוי לחוקרים יכולים למשוך או להדוף עכברים, להטות תוצאות של בדיקות קוגניטיביות המסתמכות על התנהגות ספונטנית. כאשר בתחילה הקמת Y- מבוך או אובייקט הרומן הכרה, הביצועים של אמצעי בקרה על מנת להבטיח כי אין הטיות positional בחקר אובייקטים ו / או הסביבה הוא חיוני. אם יש לראות את ההטיה העמדתית, החוקרים חייבים לבחון היטב את הסביבה ולכוונן את התאורה, את מיקום הזירה, את המיקום של חדר הבדיקות ביחס לחדרים אחרים במתקן ( כלומר , לא ליד אזור סחר גבוה או ציוד כבד) ונהלי ניקוי בזירה.
ההרגלה לסביבת הבדיקה היא המפתח להשגת ביצועים מיטביים במבחן זיהוי אובייקט חדשני. לדוגמה, זמני חיפוש שלמים נמוכים עשויים להיגרם עקב הרגלה לא מספקת. כחלופה לפרו(פרק 2) וזירה (סעיף 4.2) הרגל, הרגל לטיפול וסביבת הבדיקה ניתן לבצע כמו 3, 5 דקות הפעלות ביום במשך 2 ימים רצופים.
מגבלות הטכניקה
כמו בכל הליך, בדיקות התנהגותיות אלה יש מגבלות. נהלים אלה הועסקו כי הם בודקים פונקציה של אזורים קליפת המוח השונים בהיפוקמפוס. אם מודל העכבר אינו מציג גירעונות תפקודיים באזורי המוח נבדקים על ידי בדיקות אלה, אז טכניקות אלה לא יהיה שימושי. יתר על כן, בחרנו במבחנים קוגניטיביים שמחקרים זיכרון לטווח קצר. אם מנגנון הפעולה של המתחם תחת הערכה פרה קלינית לא צפוי להשפיע על הזיכרון לטווח קצר אז אלה נהלים צריך להיות שונה בהתאם ( כלומר , הגדלת מרווח שלב הבדיקה מדגם לבדיקת זיכרון לטווח ארוך). לבסוף, בדיקות אלה משתמשות בהתנהגויות בלתי מוטיבציה. לכן, אם מודל העכבר הוא excesסגיב hyperactive או מציג התנהגויות סטריאוטיפיות אחרות המונעות חקירה של הסביבה אז הליכים אלה עשויים להיות לא אופטימליים. לחלופין, אפשר להשתמש בהתניה פחד עבור Tg2576 או מודלים אחרים עכבר β- עמילואידוזיס, או מבוך המים המרחבי עבור rTg4510 או מודלים העכבר אחרים של tauopathy 3 .
יישומים עתידיים
לאחר שהליכים אלה אומצו בהצלחה במעבדה, ניתן לבצע מספר שינויים או הרחבות על מנת להעריך אמצעים מוטוריים קוגניטיביים ותפקודיים נוספים. לדוגמה, שינוי המשימה של זיהוי אובייקט חדש כדי לקבוע אם עכבר יכול לזהות שינוי במיקום של אובייקט 13 . לחלופין, במקום להשתמש אובייקטים, אפשר להשתמש בעכברים אחרים וליישם מבחן הכרה חברתית. בהתייחס לאיברי הגפיים ולפונקציה המוטורית, אפשר להשלים את הבדיקה עם תלות החוט ו / או כוח האחיזה. המבחניםמפורט בשיטה זו טופס בסיס מוצק למסך עבור תרכובות שיש להם יעילות vivo מודלים העכבר translational עבור AD, והוא יכול להיות מותאם או שונה בדרכים רבות כדי לחקור בצורה הטובה ביותר מודל העכבר מסוים או לענות על הצרכים של תוכנית ייחודית גילוי סמים .
Disclosures
JM Levenson מועסק על ידי Proclara Biosciences, Inc C. Miedel, ג 'יי פטון, א Miedel, ו E. Miedel מועסקים על ידי בעלי חיים מעבדה Hilltop.
Acknowledgments
למחברים אין תודות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Topscan Lite-High Throughput | Cleversys | Automated behavioral analysis. Includes cameras and video acquisition system, laptop. | |
| ObjectScan | Cleversys | Software module for accurate object exploration quantification | |
| Open field for mouse | Cleversys | CSI-OF-M | Arena for novel object recognition |
| Y-maze for mouse | Custom | Arms: 30 cm long, 10 cm wide, 20 cm high walls, placed 120 deg apart. | |
| Camera mount for open field | Custom | Custom | 76 cm tall, 115 cm wide, cameras mounted @ 30 cm in from either side. Two mounts, each covers two boxes. |
| Camera mount for Y-maze | Custom | Custom | 76 cm tall, 115 cm wide, cameras mounted @ 30cm in from either side. One mount covers two mazes. |
| Marbles | Inperial Toy | 8565 | Standard (15.5 mm Dia) glass marbles. |
| Dice | Cardinal Industries | 770 | Standard (0.650 inch) white dice with black dots. |
| LOCTITE Fun-Tak | Henkel | B018A3AG0W | Standard blue sticky tak |
| EtOH | Nexeo Solutions | 82452 | 100% Ethanol Diluted to 70% using distilled Water |
| dH2O | Tulpenhocken Spring Water Co. | - | PA D.E.P. #31, NJ D.O.H. #0049, NYSHD Cert. #320 |
| Paper towels | Procter & Gamble | B019DM86LA | Bounty, White |
| Handheld video camera | Apple, Inc. | MKV92LL/A | Acquisition of Limb clasping video, Iphone 6S Plus (or functional equivalent). |
| Gloves | SafePOINT, L.L.C. | GL640-2 | Standard, Powder free Latex Gloves, Medium |
| Light meter | Dr. Meter | LX1330B | Lighting @ the bottom of Open Field= 35 LUX, Lighting @ bottom of Y-Maze= 32 LUX |
| Bleach germicidal wipes | Clorox | Sterilization of equipment during & after use |
References
- Elder, G. A., Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R. Transgenic mouse models of Alzheimer's disease. Mt Sinai J Med. 77 (1), 69-81 (2010).
- Onos, K. D., Sukoff Rizzo, S. J., Howell, G. R., Sasner, M. Toward more predictive genetic mouse models of Alzheimer's disease. Brain Res Bull. 122, 1-11 (2016).
- Webster, S. J., Bachstetter, A. D., Nelson, P. T., Schmitt, F. A., Van Eldik, L. J. Using mice to model Alzheimer's dementia: an overview of the clinical disease and the preclinical behavioral changes in 10 mouse models. Front Genet. 5, 88 (2014).
- Rodgers, S. P., Born, H. A., Das, P., Jankowsky, J. L. Transgenic APP expression during postnatal development causes persistent locomotor hyperactivity in the adult. Mol Neurodegener. 7, 28 (2012).
- Hsiao, K., et al. Correlative memory deficits, Abeta elevation, and amyloid plaques in transgenic mice. Science. 274 (5284), 99-102 (1996).
- Santacruz, K., et al. Tau suppression in a neurodegenerative mouse model improves memory function. Science. 309 (5733), 476-481 (2005).
- Crawley, J. N. What's wrong with my mouse? : behavioral phenotyping of transgenic and knockout mice. 2nd edn. , Wiley-Interscience. (2007).
- Hughes, R. N. The value of spontaneous alternation behavior (SAB) as a test of retention in pharmacological investigations of memory. Neurosci Biobehav Rev. 28 (5), 497-505 (2004).
- Rutala, W. A., Weber, D. J. Guideline for disinfection and sterilization in healthcare facilities. Centers for Disease Control. , (2008).
- Wes, P. D., et al. Tau overexpression impacts a neuroinflammation gene expression network perturbed in Alzheimer's disease. PLoS One. 9 (8), 106050 (2014).
- Ennaceur, A., Delacour, J. A new one-trial test for neurobiological studies of memory in rats. 1: Behavioral data. Behav Brain Res. 31 (1), 47-59 (1988).
- Taglialatela, G., Hogan, D., Zhang, W. R., Dineley, K. T. Intermediate- and long-term recognition memory deficits in Tg2576 mice are reversed with acute calcineurin inhibition. Behav Brain Res. 200 (1), 95-99 (2009).
- DeVito, L. M., Eichenbaum, H. Distinct contributions of the hippocampus and medial prefrontal cortex to the "what-where-when" components of episodic-like memory in mice. Behav Brain Res. 215 (2), 318-325 (2010).
- Lalonde, R., Strazielle, C. Brain regions and genes affecting limb-clasping responses. Brain Res Rev. 67 (1-2), 252-259 (2011).
- King, D. L., Arendash, G. W. Behavioral characterization of the Tg2576 transgenic model of Alzheimer's disease through 19 months. Physiol Behav. 75 (5), 627-642 (2002).
- Lalonde, R., Lewis, T. L., Strazielle, C., Kim, H., Fukuchi, K. Transgenic mice expressing the betaAPP695SWE mutation: effects on exploratory activity, anxiety, and motor coordination. Brain Res. 977 (1), 38-45 (2003).
- Lewis, J., et al. Neurofibrillary tangles, amyotrophy and progressive motor disturbance in mice expressing mutant (P301L) tau protein. Nat Genet. 25 (4), 402-405 (2000).
- Spittaels, K., et al. Prominent axonopathy in the brain and spinal cord of transgenic mice overexpressing four-repeat human tau protein. Am J Pathol. 155 (6), 2153-2165 (1999).
- Terwel, D., et al. Changed conformation of mutant Tau-P301L underlies the moribund tauopathy, absent in progressive, nonlethal axonopathy of Tau-4R/2N transgenic mice. J Biol Chem. 280 (5), 3963-3973 (2005).
- Merrow, M., Spoelstra, K., Roenneberg, T. The circadian cycle: daily rhythms from behaviour to genes. EMBO Rep. 6 (10), 930-935 (2005).
- Smarr, B. L., Jennings, K. J., Driscoll, J. R., Kriegsfeld, L. J. A time to remember: the role of circadian clocks in learning and memory. Behav Neurosci. 128 (3), 283-303 (2014).
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
- Stough, S., Shobe, J. L., Carew, T. J. Intermediate-term processes in memory formation. Curr Opin Neurobiol. 16 (6), 672-678 (2006).
- Stevens, L. M., Brown, R. E. Reference and working memory deficits in the 3xTg-AD mouse between 2 and 15-months of age: a cross-sectional study. Behav Brain Res. 278, 496-505 (2015).
- Yue, X., et al. Brain estrogen deficiency accelerates Abeta plaque formation in an Alzheimer's disease animal model. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (52), 19198-19203 (2005).
- McAllister, C., et al. Genetic targeting aromatase in male amyloid precursor protein transgenic mice down-regulates beta-secretase (BACE1) and prevents Alzheimer-like pathology and cognitive impairment. J Neurosci. 30 (21), 7326-7334 (2010).
- Blaney, C. E., Gunn, R. K., Stover, K. R., Brown, R. E. Maternal genotype influences behavioral development of 3xTg-AD mouse pups. Behav Brain Res. , 40-48 (2013).
