Introduction
השיג התחדשות האקסון לאחר פגיעה במערכת העצבים הוא משימה מאתגרת 1. כדי ללמוד את הכישלון של התחדשות האקסון במערכת העצבים המרכזית (CNS), חוקרים השתמשו שפע של דגמים פגיעים עצבי. כמו אזורים של CNS השונים, חשוב להשתמש במודל מתאים אנטומית ללמוד התחדשות האקסון. באמצעות המודל המתאים, חוקרים יכולים לגבש טיפול ספציפי מבוסס על חומרת פציעה, סוג התאים העצבי של עניין, ואת דרך השדרה הרצויה להערכת התחדשות, בניגוד לאסטרטגיה טיפולית "אחד-על-כל".
בשנת פגיעה בחוט שדרה, למשל, על הסימפטומים המתישים ביותר נובעים אובדן תחושת התנועה. אובדן התחושה נגרם על ידי פגיעת המסלולים החושיים עולים, בעוד הפסד של תנועה נגרם על ידי פגיעת נתיבי התנועה יורדים. בשל הבדלים הסלולר אנטומיים בין TW אלהמסלולי o, מחקרי התחדשות האקסון רבים הממוקדות להתמקד רק אחד או במסלול האחר, עם הרציונל כי התאוששות מוצלחת של אחד תהיה יתרון עצום לחולים. במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול המשתמשת גרעיני שורש הגבה ישירים הזרקה (DRG) עם וקטור ויראלי פציעת התאהבות במקביל שורש הגבי של חוט השדרה הצווארי התחתון של חולדת בוגרת כמודל ללמוד התחדשות האקסון חושית.
עצב סנסורי DRG הם שאחראים להעברת מידע חושי, כגון תחושת מישוש וכאב, מהפריפריה אל מערכת העצבים המרכזית. תחזיות axonal הארוכות של עצב סנסורי בחוט השדרה לשמש מודל טוב ללמוד התחדשות האקסון למרחקים ארוכים. בנוסף, כמו מכרסמים יכולים לשרוד נגע מסלול חושי כגון פציעת התאהבות שורש הגבה עם סיבוכי רווחה מינימאליים, חוקרים יכולים ללמוד התחדשות האקסון CNS ללא צורך נגע חוט השדרה לחלוטין. C5 מרובעת - C8 (L צוואר הרחםאיבל 5 - 8) הגבה התאהבות שורש פציעה הוכחה להיות מודל שימושי עבור בכפו deafferentation 2. בנוסף, פציעת התאהבות שורש הגבה מספקת מודל "מנקה" ללמוד התחדשות האקסון מאשר פגיע בחוט שדרה ישירה מכיוון שהוא אינו מסובך מגורמים אחרים כגון היווצרות צלקת גליה.
שימוש ריפוי גנטי נגיפי לתכנת מחדש תאי עצב למצב רגנרטיבית כבר ראה יותר ויותר כאסטרטגית טיפול מבטיחה למספר תנאי נוירולוגיות רבים 3. מחקרים הראו היישום של וירוס adeno קשור (AAV) וקטור נושא את הגן של חלבון מקדם גדילה יכולה להשיג התחדשות האקסון חזקה עם התאוששות התנהגותי 4, 5, 6. פתוגניות נמוכה לכאורה של AAV ב לעורר תגובה חיסונית ויכולת transduce תאים שאינם מתחלקים, כמו נוירונים, לעשותזה הווקטור האופטימלי עבור ריפוי גנטי. בנוסף, בצורת AAV רקומביננטי משמשת לטיפול. בצורה זו, שהיא אינה מסוגלת שילוב הגנום הנגיפי שלו לתוך המארח בגנום 7, הפחתת הסיכון mutagenesis insertional לעומת וקטורים ויראליים אחרים, כגון lentivirus. זה עושה AAV בחירה בטוחה ליישומי ריפוי גנטי.
כתוצאת DRG המכיל את גופי התא של הנוירונים חושיים, שזוהי המטרה אנטומי המתאימה ביותר עבור הממשל של וירוס עבור ריפוי גנטי ללמוד ו / או לקדם התחדשות האקסון חושית. במחקר שהשווה קפסיד AAV שונים lentivirus, AAV סרוטיפ 5 (AAV5) הוצגה להיות יעיל ביותר transducing נוירונים DRG מעל קורס זמן של 12 שבועות לפחות כאשר מוזרק ישירות לתוך DRG 8. בנוסף, AAV יכול להשיג יותר מ 40% יעילות התמרה, transducing כל תת העצבית DRG, כגון neurofilament בקוטר גדול 200 kDa(NF200) נוירונים -positive ואת קלציטונין קטן-קוטר גנים הקשורים פפטיד (CGRP) - או B4 isolectin (IB4) -positive נוירונים 4, 8.
כפי ההליך הכירורגי של הזרקת DRG ופציעת התאהבות שורש הגבה הוא מאוד פולשני ועדין, אנו מאמינים כי מאמר זה יעזור למשתמשים חדשים ללמוד את ההליך באופן יעיל מאוד. במאמר זה, אנו מציגים תוצאות נציגי חולדות בוגרות ארבעה שבועות לאחר ההזרקה של וירוס מלא AAV5-GFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק) לתוך C6 - DRGs C7 עם C5 במקביל - פגיע למעוך שורש הגבה C8. דגם זה מתאים במיוחד עבור חוקרים שחקרו את השימוש בטיפול גנטי נגיפי לקדם התחדשות האקסון חושית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הנהלים החיים הבאים נערכו בהתאם חי בריטניה (הליכים מדעיים) Act 1986. אם לא מוכר עם נהלים אלה, יש לבדוק עם תקנות מקומיות / לאומיות ולבקש ייעוץ וטרינרים לפני תחילת הפרוטוקול.
1. בחירת זנים מתאימים של בעלי החיים
הערה: תוצאות פציעת התאהבות שורש הגבה לאובדן deafferentation תחושה וללטף. תופעות לוואי שכיחות של deafferentation בכפו יכולה לכלול מעל במספרת, פגיעה עצמית, וללטף autotomy.
- השג חיות עבור ההליך.
הערה: חולדות, הזנים הפעילים יותר, כגון ליסטר-סלעי ו וויסטר, יש שכיחות גבוהה יותר של כף הרגל autotomy לאחר deafferentation לעומת הזנים הצייתנים יותר, כגון לואיס ספראג-Dawley. במידת האפשר, את המתח הנוח ביותר לאילוף, לואיס, תמיד צריך לקחת בחשבון הראשון. האם זן פעיל במיוחד להיות נחוץ לצורך הניסוי בשל מ גנטיodification או דרישות הערכה התנהגותית ספציפית, טיפול וטרינרי צריך להיות במקום כדי לטפל תופעות לוואי צפויות.
2. הכנת וירוס עבור הזרקה
זהירות: טפל כל הווירוסים בהתאם לתקנות בטיחות ביולוגיות מעבדה.
- לדלל או לרכז את הווירוס כייל של 2 x 10 12 הגנום עותק (GC) / המ"ל הבא פרוטוקולי אריזת וירוס פרט 9.
הערה: הנה, הווירוס היה מדולל מלוחים פוספט שנאגרו של Dulbecco (D-PBS) עם 5% סוכרוז. כייל עשוי להיות מותאמים בהתאם לסוג של וירוס, אמרגן, לבנות גודל, וממוקד סוג תא. - אופציונאלי: להוסיף 1% לצבוע בצבע (למשל, מהיר גרין) לפתרון הווירוס עבור להדמיה קלה של ההזרקה בהמשך. מערבבים את הפתרון מאוד בעדינות.
- שמור את הפתרון על הקרח לשימוש מיידי (תוך 4 שעות) או במקפיא -80 מעלות צלזיוס במשך ארוךאחסון לטווח.
3. ביצוע הכנה לפני הניתוח של בעלי החיים
הערה: עקב הפולשנות הקיצוניות של הניתוח, בטכניקות האספטי לשמש בכל העת.
- הכן לעקר את כל כלי הניתוח ואת מסגרת stereotaxic השדרה לפני תחילת הניתוח. לדוגמא, לעקר את הכלים ב חיטוי ב 134 מעלות צלזיוס. השתמש סט חדש של כלים מעוקרים עבור כל חיה.
- להרדים את החיה. אשר הרדמה תקינה על ידי צובט את הכפה לבדוק את רפלקס הנסיגה או על ידי נגיעה הקרנית עבור רפלקס העפעף.
- עבור חולדות בוגרות באמצעות הרדמה משאיפת כגון isoflurane, להשתמש isoflurane 4% ב 2.0 L / min חמצן עבור אינדוקציה. עבור תחזוקה לאורך כל הניתוח, להשתמש 2 - 3% isoflurane ב 1.5 L / min חמצן, משנים את ריכוז isoflurane פי דפוס הנשימה של החיה כדי להימנע המינון תחת יתר או.
- עַלCE החיה היא מורדמת בתחילה, להקליט את המשקל לפני הניתוח של בעלי החיים.
- עבור הזרקת DRG צוואר הרחם, לגלח את הפרווה על הצוואר מפני שבין האוזניים כדי דיסטלי רק כדי השכמות. לחטא את האזור המגולח עם מוצר חיטוי.
- להזריק 2 מ"ל של תת-עורית מלוחים על צלעו של החיה, יחד עם מינון מתאים של משכך כאבים (למשל, 5 מ"ג / ק"ג carprofen) ו אנטיביוטי (למשל, 5 מ"ג / ק"ג Enrofloxacin).
- החל משחת עין היא העיניים כדי למנוע התייבשות קרנית במהלך ההליך.
- המשך הניתוח על מסגרת stereotaxic שדרה עם כרית חימום על 37 מעלות צלזיוס הממוקמות מתחת החיה.
4. הזרקת DRG וביצוע פגיעת Crush שורש הגבה
הערה: זהו ניתוח עדין מאוד. רצוי לתרגל על כמה חיות מתות ראשון להכיר את האנטומיה לפני הקידום לחיות ניתוח חיה.
- Locate התהליכים spinous C2 ו- T2 בולטים מעל העור. ביצוע חתך בעור בין תהליכי spinous C2 ו- T2 עם להב סכין המנתחים No.10 (פעם העור נפתח, קו אמצע לבן, סיבי רקמות צריך להיות גלוי על השכבה הראשונה של שריר; שכבת השריר הראשונה יש " דמוי ג'לי" מרקם).
- ביצוע חתך בגודל דומה על השכבה הראשונה של שריר לאורך קו האמצע הלבן באמצעות להב סכין מנתחים. אל תלכו מעבר לתהליך spinous T2 הבולט, כמו מישן ענף עורקים מרכזי מאבי העורקים יורדים הממוקמים ליד ושם.
הערה: דימום כבד יכול להתרחש בכל מקום משלב זה ואילך. תמיד לעצור את הדימום ולהסיר את הדם באמצעות בלוטות כותנה מעוקרות או ספוגים כירורגית נספגים לאפשר להדמיה ברורה בכל העת. שימשיך את ההליך "עיוור" עלול לגרום ניזק בלתי רצוי אל חוט השדרה, DRG, או שורש הגבה, שמוביל תופעות לוואי בלתי צפויות החיה בהמשך. - לחזור בושכבת השריר הראשון באמצעות שתי כתיבה, האחת מונחת rostrally ו caudally אחד; שכבת השריר השנייה, עם מראה מפוספס, צריכה להיות גלויה.
- אתר את קו האמצע של השכבה השנייה של שריר (שבו שני שרירי אורך ניתן לצפות מחובר באמצעות רקמה רזה, קרומית). לנתח את הרקמה הקרומית באמצעות זוג microscissors כדי להפריד בין שני השרירים האורכים. הימנע משימוש להב סכין המנתחים ואם אפשר, מכיוון שהדבר עלול לגרום נזק לשרירים מיותר דימום.
- התאם את retractors בהתאם כדי לחשוף את השכבה השלישית של שריר רזה המכסה את עמוד השדרה. התהליכים spinous ניתן לחוש באמצעות נגיעה קלה עם זוג מלקחיים מעל השכבה השלישית של השריר.
- ביצוע חתך קטן על השכבה השלישית של השריר באמצעות microscissors ובעדינות לגרד את השריר מן העצם באמצעות מגרד או אזמל באופן מהצד, כדי לחשוף את החוליות בבירור. אם נדרש, לחתוך חלק השריר או הגיד משם כדי להפוך את laminectomy קל.
- כדי לחשוף את C5 עזב - DRGs C8, לבצע חם laminectomy שמאל על C4 - חוליות T1 ידי הסרת חלק בקפידה של lamina ו pedicle באמצעות זוג rongeurs בסדר. DRG ממוקם בסמוך foramen הרוחבי של החוליות.
הערה: C3 - חוליות C7 אין תהליך spinous בולט. ה- C5 DRG ממוקם בין החוליות C4 ו- C5, את DRG C6 הוא בין C5 ו- C6 חוליות, וכן הלאה, ואילו DRG C8 הוא בין C7 ו- T1 החוליות. אין חוליה C8, למרות נוכחותם של DRG C8 ו- קטע חוט השדרה C8. - לאחר מספיק של DRG נחשף להזרקה, להכין את המזרק על ידי צבת המזרק מיקרוליטר מלאה הווירוס מצויד במחט מחוייטת, 33-מד בוטה על בעל מזרק stereotaxic. לפני ההזרקה, להשתמש מחט משופע 30-מד לבצע פתיחת שטח קטנה על כל האחד DRG הממוקד לסייע עם החדרת המחט להזרקה.
- הכנס את-g 33אוז'ה מחט לתוך במרכז DRG ידי סיבוב הכפתורים בעדינות כדי להתאים את הקואורדינטות stereotaxic. אל מעל להכניס את המחט, מאחר והדבר עלול לגרום נוזל לדלוף החוצה מצד הגחון של DRG. האם דליפה להתרחש, להתאים את המיקום של המחט מיד.
הערה: קואורדינטות stereotaxic המספריות אינן משמשות; עם זאת, כדאי לנצל את המסגרת כדי להחזיק את המחט להזרקה. - להזריק 1 μL של הנגיף לתוך כל DRG ב 0.2 μL / דקה באמצעות משאבת מזרק אינפוזיה. להמתין שלוש דקות נוספות לפני משיכת מחט. במהלך ההזרקה, DRG ישתנה צבע לאט אם פתרון הווירוס מכיל צבע בצבע.
- כדי לבצע C5 במקביל - שורש הגבה C8 התאהבות פציעה, לרסק כל שורש שלוש פעמים במשך 10 s לכל באמצעות זוג מלקחי קנס שקצו (בון Micro), מנוגדים קצות המלקחיים לחלוטין; קו לבן ברקמה אמור להופיע באתר דלוק. אל תלך עמוק מהדרוש עם forceps, מכיוון שהדבר עלול לגרום נזק לשורש הגחון.
- בעקבות ההזרקה ו / או למעוך, לוודא כי אין דימום או חתיכות קטנות של שברי עצם שנשארו במקום החתך לפני שסגרת את החיה. אם עדיף, למקם חתיכה קטנה של ספוג כירורגית נספג על גבי חוט השדרה החשוף DRG.
- אפשר השכבה השלישית של השריר לחזור אחורה באופן טבעי על עמוד השדרה ללא תפירה. רופף תפר את שני שרירים האורך על השכבה השנייה (≈ 3 קטע תפרים) עם חומר 6-0 תפר נספג. לתפור את שכבת השריר הראשונה (≈ 5 קטע תפרים) עם חומר 6-0 תפר נספג.
- לתפור את העור עם חומר 5-0 תפר נספג (≈ 10 קטעה תפרים).
הערה: ודא כי התפרים אינם צמודים מדי. בולטות של העור היא סימן של יתר ההידוק ועלולה לגרום אי נוחות לבעל החיים. - אם דימום כבד התרחש במהלך הניתוח, תת-עורית להזריק 1 - 2מ"ל של תמיסת מלח כדי לחדש את אובדן הנוזלים מן החי כפי שהותר על פי תקנות מקומיות.
- ספק ג'ל לחות אכיל ולאפשר החיה להתאושש באופן מלא מן ההרדמה, ביצוע ניטור קבוע עבור 1 שעות לפחות לפני חזרת החיה חזרה לאזור האחזקה.
- שמור את החיה לפחות 3 שבועות עבור ביטוי transgene אופטימלי להעריך התחדשות האקסון חושית.
5. טיפול פוסט-אופרטיבי Performing של בעלי החיים
- ספק מחית מזון ומצעי כותנה רכות עבור החיה במהלך הראשון שלאחר הניתוח בשבוע. אם נדרש, לנהל מינונים נוספים של משכך כאבים אנטיביוטיקה כדי לסייע עם התאוששות בהתאם לתקנות המקומיות / לאומי ייעוץ וטרינרי.
- הסר את התפרים על העור לאחר 7 - 10 ימים.
הערה: תופעות לוואי שכיחות של הניתוח כוללות היווצרות seroma או המטומה במקום החתך, לשרוט סימנים על העור בשל הגירוד הנגרם על ידיהתפרים נספגים הפנימיים, גירעונות חושיים או תנועה עדין, ואת סימני השחתה עצמית על כף deafferented לאחר פציעת התאהבות שורש הגבה. לגבי כל נושא רווחה כי הם משמעותיים יותר חמורים מצפויים, מבקשים ייעוץ וטרינרים מיידי.
6. ביצוע הזרקת CTB האנטרוגרד עבור איתור אקסונלית
הערה: מומלץ לבצע כולרה טוקסין B למקטע (CTB) אקסונלית התחקות שבוע לפני לאוסף רקמות.
- כן 1% פתרון CTB לפי הוראת היצרן.
- אופציונאלי: להוסיף 1% צבעוני צבע לפתרון עבור להדמיה קלה של ההזרקה בהמשך. מערבבים את הפתרון מאוד בעדינות.
- להרדים את החיה (ראה שלב 3.2.1) ולייצב בכפו השמאלית על ידי הקשה על איבר לשולחן.
- ידנית לאט להזריק 1 μL של 1% CTB תת-עורית למרכז שודד דרכים קירחים וארבע ספרות באמצעות Wi מיקרוליטר מזרק מצוידth מחט קצרה מחוייטת, 33-מד.
הערה: לפני הזריקה, קודם כדאי להשתמש מחט משופע 30-מד לבצע פתיחת שטח קטנה על העור, המסייע עם החדרת המחט להזרקה. - אפשר החיה להתאושש באופן מלא מן ההרדמה לפני חזרת החיה לאזור האחזקה.
7. רקמות איסוף
- כדי לאסוף את DRG-מוזרק וירוס ובחוט השדרה אימונוהיסטוכימיה, לנהל ממנת יתר של חומר הרדמה transcardially perfuse החיה עם פוספט שנאגרו מלוחים ואחריו paraformaldehyde 4% קר. בזהירות לבצע laminectomy מלא על עמוד השדרה כדי לאסוף את הרקמה הקבועה תחת מיקרוסקופ. ממשיך בהכנות רקמות, חתך, ועיבוד כנדרש לצורך ניתוח 4, 5, 6.
הערה: במקום החתך התאושש צריך להיות ברור, כפי שנצפה על ידי הנוכחות של היםרקמת מכונית. - לחלופין, כדי לאסוף את DRG מוזרק-וירוס לתרבות במבחנה, להקריב את החיה בצורה הומאנית עם שיטה שאושרה, כגון ריכוז העולה של פחמן דו חמצני. בזהירות לנתח את DRG תחת מיקרוסקופ, הבטחת תנאים מזוהמים בכל הזדמנות אפשרית. המשך עם תרביות רקמה לפי הצורך 4, 5, 6, 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כייצוג, קטע חוט רוחבי שדרה עם DRG המצורפת מוצג כדי להראות את האפקטיביות של פרוטוקול זה transducing נוירונים DRG ו התחקות אקסונים חושי בחוט השדרה ארבעה שבועות לאחר הזרקת וירוס מלא, AAV5-GFP, ישירות לתוך C7 DRG ללא פגיעה למעוך השורש הגבי (איור 1A). האקסונים בשני בעמודה הגבי ו בקרן הגבית של חוט השדרה להביע GFP (איור 1B), כמו גם את גופי התא אקסונים בתוך DRG מוזרק (איור 1C). ניתוח אנטומי נוסף של גרעין יְתֵדִי, בטרמינל האקסון החושי בגזע המוח, מגלה CTB האנטרוגרד החיובית התחקות (איור 1D).
כאשר הזרקת DRG מבוצעת במקביל פציעת התאהבות C5-C8 הגבה שורש שלמה, אין אקסונים GFP חיובי בחוט השדרה או מסוף CTB החיוביים בגרעין יְתֵדִי הם נצפו (איור 2 א). עם זאת, כדאי לציין כי אקסונים חושי axotomized יכול עדיין להתחדש עד אזור כניסת השורש הגבה בתוך שורש הגבה מרוסק לחלוטין, המהווה סביבת PNS, אך לא מעבר לתוך חוט השדרה 4, 5 (איור 2 א). במקרה הנגיף המוזרק מכיל את הגן של חלבון מקדם גדילה פוטנציאלי, הנוכחות של אקסונים שכותרתו בחוט השדרה עשויה לייצג גם התחדשות או פציעת התאהבות שורש הגבה שלמה (איור 2B). כדי להבדיל בין שתי התוצאות הללו, מעקב אקסונלית CTB בגרעין יְתֵדִי יש לנתח. הנוכחות של מסופי CTB חיובי בגרעין יְתֵדִי מדגיש את הסבירות של פגיעה חלקית (איור 2C), ואילו בהעדר מסופי CTB חיובי מצביע על התחדשות חלקית לתוך חוט השדרה, כמו אקסונים מחדשאינם מסוגלים צפוי לגדול המרחק כולו להגיע לגרעין יְתֵדִי (2D איור). נכון להיום, התחדשות האקסון חושית מוצלחת לגרעין יְתֵדִי בעיקר דווחה במקרים עם פציעה בצוואר רחם גבוהה 11, 12 או עם היישום של neurotrophins 13, 14. כל חיות מראות סימנים של פציעה שלמה צריכות להיות מחוץ מחקרי התחדשות האקסון.
איור 1: הזרקת DRG ללא פגיעת Crush שורש הגבה. (AC) בסעיף חוט השדרה מראה אקסונים GFP חיובי בחוט השדרה (א), לרבות קרן טור הגבי הגבי (B) וגופים תא DRG (C) ארבעה שבועות לאחר ההזרקה של AAV5-GFP. <strong> (ד) מסופי האקסון חושיים CTB חיובי בגרעין יְתֵדִי שבוע לאחר הזרקת CTB. בר סולם הוא 650 מיקרומטר (AC) ו 250 מיקרומטר (D). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: הערכת שורש הגבה Crush פגיעת האקסון התחדשות. (א) תוצאות פציעת התאהבות שורש הגבה להשלים בשום אקסונים שכותרתו בחוט השדרה או מסופי האקסון CTB חיוביים בגרעין יְתֵדִי. אקסונים חושי axotomized יכול להתחדש עד אזור כניסת השורש הגבה, אך לא מעבר לתוך חוט השדרה. (BD) הנוכחות של אקסונים שכותרתו בחוט השדרה מייצג או פגיעה חלקית או regeneratiעל (B). עם ניתוח נוסף, בנוכחות המסופים CTB החיוביים בגרעין יְתֵדִי מרמזת פציעה שלמה (C), בעוד בהיעדרם מרמז פגיעה מוחלטת והתחדשות חלקית בפוטנציה לתוך חוט השדרה (D). בר סולם הוא 250 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במאמר זה, אנו מציגים צעד-אחר-צעד מדריך כדי לבצע הזרקת DRG ופציעת התאהבות שורש הגבי של חוט השדרה הצווארי התחתון של חולדה בוגרת. כיוון שזה ניתוח פולשני ועדין מאוד, אנחנו ממליצים בחום לכל המשתמשים הפוטנציאליים לקבל הדרכה ותרגול מספיק לפני קידום לחיות ניתוח החיה. המשתמשים צריכים להיות בקיא לא רק באנטומיה בחוט השדרה, אך גם עם רקמות השריר שמסביב, מבנה העצם בחוליות, ועל כלי הדם. באופן אידיאלי, משתמש המוסמכת צריך להיות מסוגל לבצע את ההליך עם נזק מינימלי לרקמות שמסביב, ביצוע laminectomy נקי על ידי הסרת חלק החוליות ללא גרימת נזק לחוט השדרה. כפי שעולה פגיעה בחוט השדרה, פגיעה קטנה בחוט השדרה יכולה להיות השפעה מזיקה נרחבת במערכת העצבים כולה. בנוסף, בעלי חיים שעברו ניתוח "נקי" נוטים פחות לסבול שלאחר בלתי צפויסיבוכים אופרטיביים ונושאי רווחה ולכן הם פחות סבירים שיהיה צורך להקריב לפני נקודת זמן ניסוי הרצויה.
כדי לנהל וירוס למערכת העצבים, יש כמה מסלולים אפשריים של הממשל: 15 תוך ורידי, intraperitoneal 16, intrathecal 17, או הזרקה ישירה לתוך היעד 4, 8. למרות זריקות תוך ורידים ו intraperitoneal הן יחסית לא פולשנית, חציית מחסום דם-המוח עשויה להיות בעיה 18, ומסלולים אלה לגרום תמרה שאינה ספציפית, אשר לא תהיה שימושי במחקר התחדשות האקסון מיוחד. באופן דומה, עבור הזרקת intrathecal לחלל תת-עכבישים, מסלול מנהלים פולשניים יותר, רבים עצביים סוגי תאים שאינם עצביים בתוך המערכה העצבים המרכזיים עלולים להיות transduced, פוטנציאל יצירה שאינה ספציפי או מחוץ targeתופעות t. לפיכך, ההזרקה הישירה של נגיף לתוך DRG היא אפשרות נוחה ואת הסיכוי להביא יעילות התמרה גבוהה בהרבה מאשר שיטות אחרות. החסרון העיקרי של אפשרות זו, עם זאת, הוא הפולשנות של ההליך הכירורגי, אשר דורש הכשרה מיוחדת.
ברגע שמשתמש שולט במיומנויות כירורגיות הנדרשות, פרוטוקול זה מציע כמות רבה של גמישות. במחקר התחדשות האקסון, חיות ניתן ללמוד בשילוב עם טכניקות אחרות, כגון אלקטרופיזיולוגיה vivo ב ובדיקות התנהגותיות חושית-מוטורית, ואילו רקמות שנאסף יכול לשמש לניתוח אנטומי או רקמות תרבות 4. שילוב של טכניקות אלה, עם נקודות זמן הניסוי מגוונות, למשל, יכול לשמש כדי לחקור את ההתקדמות של ניוון או התחדשות של תת סיבים שונים, כגון NF200, CGRP, ו IB4 לאחר למחוץ פציעה 4. בהתאם requireme הניסיוןNTS, זה או אחר של ההליכים הציג יכול להתבצע לבד. לדוגמא, הזרקת DRG לבד יכולה לשמש בניסויים עקיבים אקסונלית, תוך פגיעה למעוך שורש הגבה לבד יכולה לשמש בכל מחקרים שבם deafferentation בכפו נדרש. בנוסף, משתמשים יכולים גם לשנות את הסוג של וירוס מוצר transgene להזרקה, את DRG המדויק להיות מוזרק, ואת השורש הגבה המדויק פציעה. אם ישים, השתלה תאית או ממשל תרופתי לתוך DRG יכולה גם להתבצע באמצעות פרוטוקול זה. בונה על מיומנויות כירורגיות רכש, משתמש מנוסה יכול להמשיך טכניקות אחרות, כגון הזרקת DRG באזור המותני (למשל, לתוך L3 - L5 להעריך תפקוד hindlimb) 19 או טור הגבה התאהבות פציעה, כדי ללמוד לתפקד חוט שדרת 5.
לסיכום, אנו מאמינים כי הזרקת DRG ופציעת התאהבות שורש הגבה להיות מודל שימושי ללמוד reg האקסון החושיeneration. למרות הדרישה להכשרה מקצועית לבצע את ההליך הכירורגי פולשני, הפרוטוקול הוא גמיש, ומשתמשים פוטנציאליים יכולים לשנות חלקים רבים כדי להתאים לדרישות הניסוי שלהם. נהלים אלה יכולים לשמש כבסיס עבור אלה בחיפוש אחר מודל חיה מתאים מחקרי התחדשות האקסון חושיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי תרומות של כריסטופר ודנה ריב קרן, המועצה למחקר רפואי, את ECMneuro המועצה האירופית למחקר, ומרכז למחקר ביו-רפואי בקיימברידג NHMRC. ברצוננו להביע את הכרת התודה העמוקה ביותר שלנו Heleen מרל ואן "ט Spijker ו יוסטינה באראט לקבלת הסיוע הטכני שלהם במהלך הצילומים. ברצוננו להודות לד"ר אליזבת Moloney ופרופ יוסט Verhaagen (מכון הולנד עבור Neuroscience) לסיוע בייצור AAV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fast Green FCF dye | Sigma-Aldrich | F7258 | For visualizing colorless solution. Recommended concentration: 1% |
| Cholera Toxin B subunit | List Biological Laboratories | 104 | For anterograde axonal tracing. Recommended concentration: 1% |
| IsoFlo | Zoetis | 115095 | Inhalation anesthetic (active ingredient: isoflurane) |
| Baytril 2.5% injectable | Bayer | 05032756093017 | Antibiotic (active ingredient: enrofloxacin). Manufacturer's recommended dosage: 10 mg/kg |
| Carprieve 5.0% w/v | Norbrook | 02000/4229 | Analgesic (active ingredient: carprofen). Manufacturer's recommended dosage: 4 mg/kg |
| Lacri-Lube | Allergan | PL 00426/0041 | Eye ointment |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | FST 12502-12 | |
| Friedman Pearson Rongeur Curved 0.7 mm Cup | Fine Science Tools | FST 16121-14 | |
| Bonn Micro Forceps | Fine Science Tools | FST 11083-07 | For performing dorsal root crush injury |
| Tissue Separating Scissors | Fine Science Tools | FST 14072-10 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | FST 14058-11 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | FST 11018-12 | |
| Goldstein Retractor | Fine Science Tools | FST 17003-03 | |
| Vannas Spring Scissors (straight) | Fine Science Tools | FST 15018-10 | |
| SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge | Ethicon | 1972 | For bleeding control |
| Microliter Syringe RN701 (10 μL) | Hamilton | 80330 | |
| Custom-made Removable Needle (for DRG injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 38 mm, point style 3 |
| Custom-made Removable Needle (for CTB injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 10 mm, point style 3 |
| UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 |
References
- Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog Brain Res. 201, 253-294 (2012).
- Wu, A., Lauschke, J. L., Morris, R., Waite, P. M. Characterization of rat forepaw function in two models of cervical dorsal root injury. J Neurotrauma. 26 (1), 17-29 (2009).
- Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases. Hum Gene Ther. 27 (7), 478-496 (2016).
- Cheah, M., et al. Expression of an Activated Integrin Promotes Long-Distance Sensory Axon Regeneration in the Spinal Cord. J Neurosci. 36 (27), 7283-7297 (2016).
- Andrews, M. R., et al. Alpha9 integrin promotes neurite outgrowth on tenascin-C and enhances sensory axon regeneration. J Neurosci. 29 (17), 5546-5557 (2009).
- Tan, C. L., et al. Kindlin-1 enhances axon growth on inhibitory chondroitin sulfate proteoglycans and promotes sensory axon regeneration. J Neurosci. 32 (21), 7325-7335 (2012).
- McCarty, D. M., Young, S. M., Samulski, R. J. Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors. Annu Rev Genet. 38, 819-845 (2004).
- Mason, M. R., et al. Comparison of AAV serotypes for gene delivery to dorsal root ganglion neurons. Mol Ther. 18 (4), 715-724 (2010).
- Hermens, W. T., et al. Purification of recombinant adeno-associated virus by iodixanol gradient ultracentrifugation allows rapid and reproducible preparation of vector stocks for gene transfer in the nervous system. Hum Gene Ther. 10 (11), 1885-1891 (1999).
- Kappagantula, S., et al. Neu3 sialidase-mediated ganglioside conversion is necessary for axon regeneration and is blocked in CNS axons. J Neurosci. 34 (7), 2477-2492 (2014).
- Alto, L. T., et al. Chemotropic guidance facilitates axonal regeneration and synapse formation after spinal cord injury. Nat Neurosci. 12 (9), 1106-1113 (2009).
- Bonner, J. F., et al. Grafted neural progenitors integrate and restore synaptic connectivity across the injured spinal cord. J Neurosci. 31 (12), 4675-4686 (2011).
- Wang, R., et al. Persistent restoration of sensory function by immediate or delayed systemic artemin after dorsal root injury. Nat Neurosci. 11 (4), 488-496 (2008).
- Wong, L. E., Gibson, M. E., Arnold, H. M., Pepinsky, B., Frank, E. Artemin promotes functional long-distance axonal regeneration to the brainstem after dorsal root crush. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6170-6175 (2015).
- Tanguy, Y., et al. Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice. Front Mol Neurosci. 8, 36 (2015).
- Foust, K. D., Poirier, A., Pacak, C. A., Mandel, R. J., Flotte, T. R. Neonatal intraperitoneal or intravenous injections of recombinant adeno-associated virus type 8 transduce dorsal root ganglia and lower motor neurons. Hum Gene Ther. 19 (1), 61-70 (2008).
- Vulchanova, L., et al. Differential adeno-associated virus mediated gene transfer to sensory neurons following intrathecal delivery by direct lumbar puncture. Mol Pain. 6, 31 (2010).
- Gray, S. J., et al. Directed evolution of a novel adeno-associated virus (AAV) vector that crosses the seizure-compromised blood-brain barrier (BBB). Mol Ther. 18 (3), 570-578 (2010).
- Fagoe, N. D., Attwell, C. L., Kouwenhoven, D., Verhaagen, J., Mason, M. R. Overexpression of ATF3 or the combination of ATF3, c-Jun, STAT3 and Smad1 promotes regeneration of the central axon branch of sensory neurons but without synergistic effects. Hum Mol Genet. 24 (23), 6788-6800 (2015).
