Introduction
تحقيق تجديد محور عصبي بعد إصابة الجهاز العصبي هو مهمة صعبة 1. لدراسة فشل تجديد محور عصبي في الجهاز العصبي المركزي (CNS)، وقد استخدم الباحثون مجموعة كبيرة من نماذج إصابة العصب. كما تختلف مناطق الجهاز العصبي المركزي، فمن المهم استخدام نموذج مناسب تشريحيا لدراسة تجديد محور عصبي. باستخدام نموذج مناسب، يمكن للباحثين صياغة معاملة محددة بناء على شدة الإصابة، ونوع من الخلايا العصبية في المصالح، والجهاز الشوكي المطلوبة لتقييم تجديد، في مقابل استراتيجية العلاج "واحد للجميع".
في إصابة الحبل الشوكي، على سبيل المثال، أكثر الأعراض المنهكة تنبع من فقدان الإحساس والحركة. ويتسبب فقدان الإحساس الأضرار التي لحقت المسارات الحسية الصاعدة، في حين تسبب في فقدان الحركة الأضرار التي لحقت مسارات السيارات تنازلي. بسبب الاختلافات التشريحية الخلوية وبين هذه TWمسارات س، العديد من الدراسات تجديد محور عصبي المستهدفة تركز فقط على واحد أو الآخر طريقا، مع المنطق القائل الانتعاش الناجح إما أن تكون ذات فائدة كبيرة للمرضى. في هذه المقالة، فإننا نقدم البروتوكول الذي يستخدم الحقن المباشر العقد الجذرية الظهرية (DRG) مع ناقل فيروسي وإصابة سحق الجذرية الظهرية المتزامنة في الحبل الشوكي عنق الرحم أقل من الفئران الكبار كنموذج لدراسة تجديد محور عصبي حسي.
DRG الخلايا العصبية الحسية هي المسؤولة عن نقل المعلومات الحسية، مثل إحساس اللمس والألم، من المحيط إلى الجهاز العصبي المركزي. التوقعات محور عصبي طويلة من الخلايا العصبية الحسية في الحبل الشوكي تكون بمثابة نموذج جيد لدراسة مسافات طويلة محور عصبي تجديد. وبالإضافة إلى ذلك، كما القوارض يمكن البقاء على قيد الحياة آفة مسار الحسية مثل الإصابة سحق الجذرية الظهرية مع مضاعفات الرعاية الحد الأدنى، يمكن للباحثين دراسة CNS محوار تجديد دون الحاجة إلى الآفة تماما الحبل الشوكي. A C5 الرباعي - C8 (ل عنق الرحموقد تبين 8) الجذر الظهري إصابة سحق لتكون نموذجا مفيدا للforepaw إزالة التدفعات الواردة 2 - إيفل 5. بالإضافة إلى ذلك، يوفر ظهري إصابة سحق جذور نموذجا "أنظف" لدراسة تجديد محور عصبي من إصابة في النخاع الشوكي مباشرة لأن هو غير معقدة من قبل عوامل أخرى مثل تشكيل ندبة الدبقية.
وقد اعتبر استخدام العلاج الجيني الفيروسي لإعادة برمجة الخلايا العصبية في حالة التجدد بشكل متزايد باعتبارها استراتيجية العلاج واعدة للعديد من الحالات العصبية 3. وقد أظهرت الدراسات أن تطبيق متجه فيروس الغدة المرتبطة (AAV) تحمل التحوير من البروتين تعزيز النمو يمكن تحقيق تجديد محور عصبي قوي مع انتعاش السلوكي 4 و 5 و 6. والمرضية انخفاض واضح من AAV في انتزاع استجابة مناعية والقدرة على تنبيغ الخلايا غير قسمة، مثل الخلايا العصبية، وجعلأنه متجه الأمثل للعلاج بالجينات. بالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام النموذج AAV المؤتلف للعلاج. في هذا النموذج، فإنه غير قادر على دمج الجينوم الفيروسي في جينوم المضيف 7، والحد من مخاطر الطفرات إقحامي بالمقارنة مع النواقل الفيروسية الأخرى، مثل الفيروسة البطيئة. وهذا يجعل AAV خيار آمن لتطبيقات العلاج الجيني.
كما يحتوي على DRG الهيئات خلية من الخلايا العصبية الحسية، وهذا هو الهدف التشريحية الأنسب لإدارة فيروس للعلاج بالجينات لدراسة و / أو تشجيع تجديد محور عصبي حسي. في دراسة مقارنة الأنماط المصلية AAV مختلفة والفيروسة البطيئة، وقد أظهرت AAV المصلي 5 (AAV5) لتكون أكثر كفاءة في transducing الخلايا العصبية DRG على مدار الساعة من 12 أسبوعا على الأقل عندما تم حقنها مباشرة في DRG 8. بالإضافة إلى ذلك، يمكن AAV تحقيق أكثر من 40٪ من الكفاءة تنبيغ، transducing جميع أنواع فرعية العصبية DRG، مثل ذات القطر الكبير خيط عصبي 200 كيلو دالتون(NF200) الخلايا العصبية -positive والببتيد المتعلقة الجينات ذات القطر الصغير الكالسيتونين (CGRP) - أو B4 isolectin (IB4) الخلايا العصبية -positive 4 و 8.
كما الإجراء الجراحي لحقن DRG وإصابة سحق الجذرية الظهرية غير الغازية للغاية وحساسة، ونحن نعتقد أن هذه المادة سوف تساعد المستخدمين الجدد لمعرفة الإجراء بطريقة فعالة جدا. في هذه المقالة، وتبين لنا نتائج ممثل من الفئران الكبار بعد أربعة أسابيع من حقن فيروس السيطرة AAV5-GFP (الأخضر بروتين فلوري) في C6 - DRGs C7 مع C5 المتزامنة - C8 الجذرية الظهرية إصابة سحق. هذا النموذج هو مناسبة خاصة للباحثين الذين يحققون في استخدام العلاج الجيني الفيروسي لتعزيز تجديد محور عصبي حسي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع الإجراءات الحيوانية بعد وفقا للالمملكة المتحدة الحيوانات (الإجراءات العلمية) لعام 1986. وإذا لم يعتادوا على هذه الإجراءات، يرجى مراجعة اللوائح المحلية / الوطنية وطلب المشورة البيطرية قبل البدء في البروتوكول.
1. اختيار سلالة مناسبة للحيوانات
ملاحظة: الجذر الظهري النتائج إصابة سحق في فقدان الإحساس ومخلب إزالة التدفعات الواردة. الآثار السلبية المشتركة لإزالة التدفعات الواردة forepaw يمكن أن تشمل الإفراط في الاستمالة، وتشويه الذات، وانشطار ذاتي مخلب.
- الحصول على الحيوانات لهذا الإجراء.
ملاحظة: للحصول على الفئران، وسلالات أكثر نشاطا، مثل ليستر-مقنع ويستار، لديها أعلى معدل للانشطار ذاتي مخلب بعد إزالة التدفعات الواردة بالمقارنة مع السلالات أكثر منصاع، مثل لويس وسبراغ داولي. إذا كان ذلك ممكنا، وسلالة أكثر منصاع، لويس، وينبغي دائما أن ينظر أولا. يجب أن تكون سلالة نشطة بشكل خاص الضروري للتجربة بسبب م الجينيodification أو متطلبات محددة تقييم السلوكية، وينبغي أن يكون العلاج البيطري المعمول بها لمعالجة الآثار السلبية المتوقعة.
2. إعداد الفيروسات للحقن
تنبيه: التعامل مع جميع الفيروسات وفقا للوائح السلامة البيولوجية والمختبرات.
- تخفيف أو تركيز الفيروس إلى عيار 2 × 10 12 الجينوم نسخة (GC) / مل التالية بروتوكولات التعبئة والتغليف فيروس الفردي 9.
ملاحظة: هنا، وقد تضعف الفيروس في Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (D-PBS) مع 5٪ سكروز. قد يكون عيار أن يكون الأمثل تبعا لنوع من الفيروسات، والمروج، بناء الحجم، واستهدف نوع من الخلايا. - اختياري: إضافة 1٪ الصبغة الملونة (على سبيل المثال، الوجبات الأخضر) إلى حل الفيروس لرؤية سهلة للحقن في وقت لاحق. مزيج الحل بلطف شديد.
- الحفاظ على حل على الجليد للاستخدام الفوري (خلال 4 ساعات) أو في -80 ° C الثلاجة لمدة الطويلةالتخزين الطويل.
3. أداء إعداد قبل الجراحة من الحيوان
ملاحظة: نظرا لغزو الشديد من عملية جراحية، وينبغي استخدام تقنيات العقيم في جميع الأوقات.
- إعداد وتعقيم جميع الأدوات الجراحية والإطار التجسيمي الشوكي قبل البدء في عملية جراحية. على سبيل المثال، وتعقيم الأدوات في الأوتوكلاف في 134 ° C. استخدام مجموعة جديدة من أدوات معقمة لكل حيوان.
- تخدير الحيوان. تأكيد التخدير المناسبة من قبل معسر مخلب لاختبار رد الفعل الانسحاب أو عن طريق لمس القرنية لمنعكس الجفن.
- بالنسبة للفئران البالغين باستخدام التخدير عن طريق الاستنشاق مثل الأيزوفلورين، استخدم 4٪ الأيزوفلورين في 2.0 لتر / دقيقة من الأوكسجين لتحريض. للصيانة في جميع أنحاء الجراحة، استخدم 2-3٪ الأيزوفلورين في 1.5 لتر / دقيقة من الأوكسجين، متفاوتة تركيز الأيزوفلورين وفقا للنمط التنفس الحيوان لتجنب الجرعات تحت الإفراط أو.
- علىم هو تخدير الحيوان في البداية، سجل الوزن قبل الجراحة للحيوان.
- لحقن DRG عنق الرحم، ويحلق الفراء على الرقبة من بين الأذنين إلى مجرد البعيدة إلى كتف. تطهير منطقة حلق مع منتج مطهر.
- حقن تحت الجلد 2 مل من محلول ملحي على الجناح الحيوان، جنبا إلى جنب مع الجرعة المناسبة من مسكن (على سبيل المثال، 5 ملغ / كغ كاربروفين) والمضادات الحيوية (مثل 5 ملغ / كغ إينروفلوكساسين).
- تطبيق مرهم العين لكلا العينين لمنع جفاف القرنية أثناء العملية.
- انتقل إلى عملية جراحية في إطار التجسيمي الشوكي مع وسادة التدفئة على 37 درجة مئوية وضعت تحت الحيوان.
4. حقن DRG والمسرحية وإصابة سحق الظهرية جذر
ملاحظة: هذا هو عملية جراحية حساسة للغاية. فإنه من المستحسن أن تمارس على عدد قليل من الحيوانات النافقة أول من تعرف مع علم التشريح قبل التقدم للعيش جراحة الحيوان.
- Locate العمليات الشائكة C2 و T2 بارزة فوق سطح الجلد. جعل شق الجلد بين العمليات C2 و T2 الشائكة مع شفرة NO.10 مشرط (مرة واحدة يتم فتح الجلد، ويجب أن يكون خط الوسط البيضاء، ليفية الأنسجة مرئية على الطبقة الأولى من العضلات، والطبقة الأولى من العضلات لديها " هلام مثل "نسيج).
- جعل شق مماثل الحجم على الطبقة الأولى من العضلات على طول خط الوسط الأبيض باستخدام شفرة المشرط. لا تذهب أبعد من عملية الشائكة T2 بارزة، كما أن هناك فرع الشرايين كبير من الشريان الأورطي النازل تقع بالقرب من هناك.
ملاحظة: يمكن أن يحدث نزيف حاد في أي مكان من هذه الخطوة فصاعدا. وقف دائما النزيف وإزالة الدم باستخدام براعم القطن المعقم أو الإسفنج امتصاص الجراحية للسماح التصور واضحا في جميع الأوقات. الشروع في إجراء "عمياء" قد يؤدي إلى أضرار غير المرغوب فيها إلى الحبل الشوكي، DRG، أو الجذر الظهري، مما يؤدي إلى آثار سلبية غير متوقعة في الحيوان في وقت لاحق. - التراجع عنالطبقة الأولى من العضلات باستخدام اثنين الكامشات، واحدة وضعت rostrally وcaudally واحد؛ الطبقة الثانية من العضلات، مع ظهور مقلم، يجب أن يكون مرئيا.
- تحديد خط الوسط من الطبقة الثانية من العضلات (حيث يمكن ملاحظة اثنين من العضلات الطولية متصلة بواسطة الأنسجة رقيقة، غشائي). تشريح الأنسجة الغشائية باستخدام زوج من microscissors لفصل اثنين من العضلات الطولية. تجنب استخدام شفرة مشرط إن أمكن، لأن هذا قد يؤدي إلى تلف العضلات لا لزوم لها والنزيف.
- ضبط مبعدات وفقا لفضح الطبقة الثالثة من عضلة رقيقة تغطي العمود الفقري. يمكن أن يرى العمليات الشائكة من خلال لمس برفق مع زوج من ملقط على الطبقة الثالثة من العضلات.
- إجراء شق صغير في الطبقة الثالثة من العضلات باستخدام microscissors وكشط بلطف العضلات من العظام باستخدام مجرفة أو مشرط بطريقة الجانبي لفضح بوضوح الفقرات. إذا لزم الأمر، وقطع بعض العضلات أو الأوتار بعيدا لجعل اللاميnectomy أسهل.
- لفضح C5 اليسار - DRGs C8، إجراء الأيسر نصفي الثقب على C4 - فقرات T1 عن طريق إزالة بعناية جزء من الصفيحة وعنيق باستخدام زوج من رينجرز غرامة. يقع بالقرب من DRG الثقبة عرضية من فقرات.
ملاحظة: C3 - C7 فقرات لم يكن لديك عملية الشائكة بارزة. يقع C5 DRG بين C4 و C5 فقرات، وC6 DRG هو بين C5 و C6 فقرات، وهلم جرا، في حين أن C8 DRG هو بين C7 و T1 فقرات. ليس هناك فقرة C8، على الرغم من وجود DRG C8 وجزء الحبل الشوكي C8. - مرة واحدة ما يكفي من DRG تعرضت للحقن، وإعداد حقنة عن طريق وضع ميكروليتر حقنة مليئة فيروس مزودة، إبرة مصنوعة خصيصا 33 عيار حادة على حامل حقنة التجسيمي. قبل الحقن، واستخدام عيار 30 مشطوف إبرة لجعل فتحة صغيرة سطحية على كل من DRG المستهدفة للمساعدة في إدخال إبرة الحقن.
- إدراج-ز 33AUGE الإبرة في وسط DRG من خلال تحويل المقابض بلطف لضبط الإحداثيات التجسيمي. لا تبالغ في ادخال الإبرة، لأن هذا قد يسبب السائل إلى يتسرب من الجانب البطني من DRG. يجب تسرب يحدث، وضبط الموقف من الإبرة على الفور.
ملاحظة: لا يتم استخدام إحداثيات التجسيمي رقمية؛ ومع ذلك، فإنه من المفيد الاستفادة من الإطار إلى عقد إبرة للحقن. - حقن 1 ميكرولتر من الفيروس في كل DRG عند 0.2 ميكرولتر / دقيقة باستخدام مضخة التسريب حقنة. الانتظار للحصول على مزيد من ثلاث دقائق قبل سحب الإبرة. خلال الحقن، فإن DRG تتغير ببطء اللون إذا كان هذا الحل الفيروس يحتوي على صبغة ملونة.
- لإجراء C5 المتزامنة - C8 إصابة سحق الجذرية الظهرية، سحق كل جذر ثلاث مرات لمدة 10 ثانية لكل باستخدام زوج من ملقط يميل غرامة (بون مايكرو)، معارضة نهايات ملقط تماما. يجب أن يظهر خط أبيض في الأنسجة في موقع سحق. لا تذهب أعمق مما هو مطلوب مع forcالعائد على السهم، لأن هذا قد يسبب الضرر إلى جذر بطني.
- بعد الحقن و / أو سحق، تأكد من أنه لا يوجد نزيف أو قطع صغيرة من بقايا عظام تركت في موقع شق قبل أن يغلق حتى الحيوان. إذا كان يفضل، ضع قطعة صغيرة من الإسفنج امتصاص الجراحية على الجزء العلوي من الحبل الشوكي المكشوفة وDRG.
- السماح للطبقة الثالثة من العضلات ليتراجع إلى الوراء بشكل طبيعي على العمود الفقري دون خياطة. خياطة فضفاضة اثنين من العضلات الطولية على الطبقة الثانية (≈ 3 تنقطع خيوط) مع امتصاص المواد 6-0 خياطة. خياطة الطبقة الأولى من العضلات (≈ 5 تنقطع خيوط) مع امتصاص المواد 6-0 خياطة.
- خياطة الجلد مع امتصاص 5-0 مواد خياطة الجروح (10 ≈ توقف الغرز).
ملاحظة: تأكد من الغرز ليست ضيقة جدا. انتفاخ الجلد هو علامة على الإفراط في تشديد ويمكن أن يسبب عدم الراحة للحيوان. - إذا حدث نزيف حاد أثناء الجراحة، تحت الجلد حقن 1-2مل من المياه المالحة لتجديد فقدان السوائل من الحيوان النحو المسموح به بموجب اللوائح المحلية.
- توفير جل ترطيب الطعام والسماح للحيوان ليتعافى تماما من التخدير، وأداء الرصد المنتظم لا يقل عن 1 ساعة قبل أن تعود الحيوان إلى منطقة القابضة.
- حفاظ على الحيوانات لمدة 3 أسابيع على الأقل للتعبير عن التحوير الأمثل لتقييم تجديد محور عصبي حسي.
5. المسرحية العناية بعد العملية من الحيوان
- تقديم الهريس الطعام والفراش القطن الناعم للحيوان خلال الأسبوع الأول بعد الجراحة. إذا لزم الأمر، جرعات إضافية من مسكن ومضاد حيوي للمساعدة في الانتعاش وفقا للوائح المحلية / الوطنية والمشورة البيطرية.
- إزالة الغرز على الجلد بعد 7-10 أيام.
ملاحظة: الآثار السلبية الشائعة لعملية جراحية تتضمن تشكيل تورم مصلي أو ورم دموي في موقع شق، الخدوش على الجلد بسبب الحكة التي تسببهاالغرز الداخلية للامتصاص، خفية العجز الحسي أو الحركة، وعلامات تشويه الذات على مخلب deafferented بعد الاصابة سحق الجذرية الظهرية. للحصول على أي قضايا الرفاه التي هي إلى حد كبير أكثر حدة مما كان متوقعا، طلب المشورة البيطرية فورا.
6. إجراء عملية حقن تقدمي CTB لمحور عصبي للبحث عن المفقودين
ملاحظة: من المستحسن لأداء الكوليرا السم B فرعية (CTB) محواري تتبع أسبوع قبل جمع الأنسجة.
- إعداد 1٪ CTB الحل حسب تعليمات الشركة المصنعة.
- اختياري: إضافة 1٪ الصبغة الملونة إلى حل لرؤية سهلة للحقن في وقت لاحق. مزيج الحل بلطف شديد.
- تخدير الحيوانات (راجع الخطوة 3.2.1) واستقرار forepaw الأيسر عن طريق تسجيل الطرف إلى طاولة المفاوضات.
- يدويا وحقن ببطء 1 ميكرولتر من 1٪ CTB تحت الجلد في وسط قاطع الطريق المشعر وأربعة أرقام باستخدام واي ميكروليتر حقنة تركيبهاث لذلك، 33 عيار إبرة قصيرة حسب الطلب.
ملاحظة: قبل الحقن، فإنه يساعد على أول استخدام عيار 30 مشطوف إبرة لجعل فتحة صغيرة سطحية على الجلد، والتي تساعد في إدخال إبرة الحقن. - السماح للحيوان ليتعافى تماما من التخدير قبل ان يعود الحيوان إلى منطقة القابضة.
7. جمع الأنسجة
- لجمع DRG حقن الفيروس والحبل الشوكي لالمناعية، وإدارة جرعة زائدة من مخدر وtranscardially يروي الحيوان مع المالحة الفوسفات مخزنة تليها البارد 4٪ امتصاص العرق. بعناية إجراء الثقب الكامل على العمود الفقري لجمع الأنسجة ثابت تحت المجهر. المضي قدما في إعداد الأنسجة، باجتزاء، وتجهيز ما يلزم منها للتحليل 4 و 5 و 6.
ملاحظة: يجب أن يكون موقع شق تعافى واضح، كما لاحظ وجود الصورةالأنسجة سيارة. - بدلا من ذلك، لجمع DRG حقن الفيروس لفي المختبر الثقافة وتضحية الحيوان بإنسانية مع أسلوب معتمد، مثل التركيز المتزايد من ثاني أكسيد الكربون. تشريح بعناية DRG تحت المجهر، وضمان ظروف معقمة كلما أمكن ذلك. المضي قدما في زراعة الأنسجة كما هو مطلوب 4 و 5 و 6 و 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وتمثيل، وقدم قسم الحبل الشوكي عرضية مع DRG المرفقة لإظهار فعالية هذا البروتوكول في transducing الخلايا العصبية DRG وتتبع محاور عصبية حسية في الحبل الشوكي بعد أربعة أسابيع حقن الفيروس السيطرة، AAV5-GFP، مباشرة في C7 DRG دون إصابة سحق الجذرية الظهرية (الشكل 1A). محاور في كل من العمود الظهري والقرن الظهري للحبل الشوكي تعبر عن GFP (الشكل 1B)، فضلا عن أجسام الخلايا والمحاور داخل DRG حقن (الشكل 1C). التحليل التشريحي إضافية من النواة الإسفينية، ومحطة محور عصبي الحسية في الدماغ، ويكشف تقدمي إيجابي CTB تتبع (1D الشكل).
عندما يتم تنفيذ حقن DRG المتزامنة مع C5-C8 إصابة كاملة سحق الجذرية الظهرية، لا محاور GFP إيجابية في الحبل الشوكي أو محطة CTB إيجابيةويلاحظ الصورة في النواة الإسفينية (الشكل 2A). ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن محاور عصبية حسية axotomized لا يزال تجديد تصل إلى منطقة دخول الجذرية الظهرية في جذر ظهري سحقت تماما، وهي بيئة الجهاز العصبي المحيطي، ولكن لا يتجاوزها الى الحبل الشوكي 4 و 5 (الشكل 2A). في حال أن يحتوي على فيروس حقن التحوير من البروتين تعزيز النمو المحتمل، وجود محاور وصفت في الحبل الشوكي قد تمثل إما تجديد أو إصابة سحق الجذرية الظهرية مكتملة (الشكل 2B). للتمييز بين هاتين النتيجتين، ينبغي تحليل CTB تتبع المحاور في النواة الإسفينية. وجود محطات CTB إيجابية في النواة الإسفينية يسلط الضوء على احتمال إصابة غير كاملة (الشكل 2C)، في حين أن غياب محطات CTB إيجابية تشير إلى تجديد جزئي في الحبل الشوكي، والمحاور مجددمن المحتمل غير قادر على النمو المسافة كلها للوصول إلى نواة الإسفينية (الشكل 2D). وحتى الآن، معظمهم تم الإبلاغ عن نجاح تجديد محور عصبي حسي إلى النواة الإسفينية في الحالات مع إصابة عنق الرحم عالية 11، 12 أو مع تطبيق عامل تغذية عصبية 13 و 14. ينبغي استبعاد أي الحيوانات التي تظهر عليها علامات إصابة غير كاملة من الدراسات محور عصبي تجديد.
الشكل 1: DRG حقن بدون إصابة سحق الظهرية جذر. (AC) قسم الحبل الشوكي تظهر المحاور GFP إيجابية في الحبل الشوكي (A)، بما في ذلك العمود الظهري والقرن الظهري (B) والهيئات خلية في DRG (C) بعد أربعة أسابيع من حقن AAV5-GFP. <قوية> (D) CTB إيجابية محطات محوار الحسية في النواة الإسفينية أسبوع واحد بعد حقن CTB. شريط المقياس هو 650 ميكرون (AC) و 250 ميكرومتر (D). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تقييم ظهري الجذر سحق الإصابات وأكسون التجديد. (A) A كاملة الجذرية الظهرية النتائج إصابة سحق في أي محاور وصفت في الحبل الشوكي أو محطات محوار CTB إيجابية في النواة الإسفينية. يمكن محاور عصبية حسية Axotomized تجديد تصل إلى منطقة دخول الجذرية الظهرية، ولكن لا يتجاوزها الى الحبل الشوكي. (BD) وجود محاور وصفت في الحبل الشوكي يمثل أي إصابة غير كاملة أو regeneratiعلى (B). مع تحليل إضافي، فإن وجود محطات CTB إيجابية في النواة الإسفينية تشير إصابة غير كاملة (C)، في حين تشير غيابهم إصابة كاملة وتجديد يحتمل جزئي في الحبل الشوكي (D). شريط المقياس هو 250 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه المقالة، نقدم دليل خطوة بخطوة لإجراء حقن DRG وإصابة سحق الجذرية الظهرية في الحبل الشوكي عنق الرحم أقل من الفئران الكبار. ولما كان هذا هو جراحة للغاية وحساسة، ونحن نوصي بشدة لكافة المستخدمين المحتملين الحصول على التدريب والممارسة كافية قبل التقدم للعيش جراحة الحيوان. يجب أن يكون المستخدمين على دراية ليس فقط مع تشريح الحبل الشوكي، ولكن أيضا مع الأنسجة المحيطة بها العضلات، وبنية العظام في العمود الفقري، والأوعية الدموية. من الناحية المثالية، ينبغي أن يكون المستخدم قادرا المختصة لتنفيذ الإجراء بأقل ضرر للأنسجة المحيطة بها، وإجراء الثقب نظيفة عن طريق إزالة جزء من فقرات دون إحداث أي ضرر إلى الحبل الشوكي. كما يتضح من إصابة الحبل الشوكي، وهي آفة صغيرة في الحبل الشوكي يمكن أن يكون لها تأثير ضار على نطاق واسع في الجهاز العصبي بأكمله. وبالإضافة إلى ذلك، والحيوانات التي خضعت لعملية جراحية "نظيفة" هي أقل عرضة للمعاناة من مرحلة ما بعد غير متوقعلذا مضاعفات المنطوق وقضايا الرعاية الاجتماعية وهم أقل عرضة لللا بد من التضحية قبل نقطة زمنية تجريبية المطلوب.
لإدارة الفيروس إلى الجهاز العصبي، وهناك عدد قليل من الطرق الممكنة للإدارة: الوريد 15، 16 داخل الصفاق، داخل القراب 17، أو الحقن المباشر إلى الهدف 4 و 8. وعلى الرغم من الحقن في الوريد والغشاء البريتوني هي نسبيا غير الغازية، وعبور حاجز الدم في الدماغ قد تكون مشكلة 18، وهذه المسارات يؤدي إلى تنبيغ غير محددة، والتي لن تكون مفيدة في دراسة محور عصبي تجديد المتخصصة. وبالمثل، للحقن داخل القراب في الفضاء تحت العنكبوتية، طريقا الإداري أكثر الغازية، والعديد من أنواع الخلايا العصبية وغير العصبية في الجهاز العصبي المركزي ويمكن transduced، ويحتمل أن يولد غير محددة أو خارج المستهدفينآثار ر. وهكذا، فإن الحقن المباشر للفيروس في DRG هو خيار مناسب، ويحتمل أن يؤدي إلى كفاءة ترنسدوكأيشن أعلى بكثير من الطرق الأخرى. العيب الرئيسي لهذا الخيار، ومع ذلك، هو غزو من العملية الجراحية، الأمر الذي يتطلب التدريب المتخصص.
بمجرد أن يتقن مستخدمي المهارات الجراحية المطلوبة، هذا البروتوكول يوفر قدرا كبيرا من المرونة. في دراسة محور عصبي تجديد، يمكن أن يسمح الحيوانات درس في تركيبة مع تقنيات أخرى، كما هو الحال في الجسم الحي الكهربية والحسية والحركية الاختبارات السلوكية، في حين أن الأنسجة التي تم جمعها يمكن استخدامها لتحليل تشريحي أو زراعة الأنسجة (4). مزيج من هذه التقنيات، مع نقاط الوقت التجريبية متنوعة، على سبيل المثال، يمكن استخدامها لدراسة التقدم المحرز في انحطاط أو تجديد فرعية الألياف مختلفة، مثل NF200، CGRP، وIB4 بعد إصابة سحق 4. اعتمادا على requireme التجريبياليلة، واحدة أو أخرى من الإجراءات المعروضة يمكن القيام بها وحدها. على سبيل المثال، حقن DRG وحدها يمكن أن تستخدم في التجارب تتبع محور عصبي، في حين أن إصابة سحق الجذرية الظهرية وحدها يمكن استخدامها في أي من الدراسات التي تتطلب forepaw إزالة التدفعات الواردة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للمستخدمين أيضا تختلف نوع من الفيروسات والمنتج التحوير للحقن، وDRG المحدد ليتم حقنه، والجذر الظهري المحدد للإصابة. إذا كان ذلك ممكنا، زرع الخلايا أو الإدارة الدوائية في DRG يمكن أيضا أن يقوم باستخدام هذا البروتوكول. بناء على المهارات الجراحية المكتسبة، يمكن للمستخدم من ذوي الخبرة المضي قدما إلى تقنيات أخرى، مثل حقن DRG في منطقة أسفل الظهر (على سبيل المثال، إلى L3 - L5 لتقييم وظيفة hindlimb) 19 أو العمود الظهري إصابة سحق، لمواصلة دراسة وظيفة النخاع الشوكي 5.
وفي الختام، فإننا نعتقد أن حقن DRG وظهري إصابة سحق الجذرية لتكون نموذجا مفيدا لدراسة الحواس ريج محور عصبيeneration. وعلى الرغم من الحاجة إلى التدريب المتخصص لإجراء عملية جراحية الغازية، والبروتوكول هو مرن، ويمكن للمستخدمين المحتملين تعديل أجزاء كثيرة لاستيعاب متطلباتهم التجريبية. ويمكن لهذه الإجراءات بمثابة الأساس لهؤلاء الذين يبحثون عن نموذج حيواني مناسبة للدراسات محور عصبي تجديد الحسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من مركز البحوث الطبية الحيوية كامبريدج NHMRC كريستوفر ودانا ريف مؤسسة، ومجلس الأبحاث الطبية، ومجلس الأبحاث الأوروبي ECMneuro، و. ونود أن نعرب عن امتناننا العميق لهيلين ميرل فان 'ر Spijker وجوستينا بارات لتقديم المساعدة التقنية أثناء التصوير. ونود أن نشكر الدكتورة إليزابيث مولوني وأستاذ جوست فيرهاجين (المعهد الهولندي للعلم الأعصاب) للمساعدة في إنتاج AAV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fast Green FCF dye | Sigma-Aldrich | F7258 | For visualizing colorless solution. Recommended concentration: 1% |
| Cholera Toxin B subunit | List Biological Laboratories | 104 | For anterograde axonal tracing. Recommended concentration: 1% |
| IsoFlo | Zoetis | 115095 | Inhalation anesthetic (active ingredient: isoflurane) |
| Baytril 2.5% injectable | Bayer | 05032756093017 | Antibiotic (active ingredient: enrofloxacin). Manufacturer's recommended dosage: 10 mg/kg |
| Carprieve 5.0% w/v | Norbrook | 02000/4229 | Analgesic (active ingredient: carprofen). Manufacturer's recommended dosage: 4 mg/kg |
| Lacri-Lube | Allergan | PL 00426/0041 | Eye ointment |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | FST 12502-12 | |
| Friedman Pearson Rongeur Curved 0.7 mm Cup | Fine Science Tools | FST 16121-14 | |
| Bonn Micro Forceps | Fine Science Tools | FST 11083-07 | For performing dorsal root crush injury |
| Tissue Separating Scissors | Fine Science Tools | FST 14072-10 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | FST 14058-11 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | FST 11018-12 | |
| Goldstein Retractor | Fine Science Tools | FST 17003-03 | |
| Vannas Spring Scissors (straight) | Fine Science Tools | FST 15018-10 | |
| SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge | Ethicon | 1972 | For bleeding control |
| Microliter Syringe RN701 (10 μL) | Hamilton | 80330 | |
| Custom-made Removable Needle (for DRG injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 38 mm, point style 3 |
| Custom-made Removable Needle (for CTB injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 10 mm, point style 3 |
| UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 |
References
- Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog Brain Res. 201, 253-294 (2012).
- Wu, A., Lauschke, J. L., Morris, R., Waite, P. M. Characterization of rat forepaw function in two models of cervical dorsal root injury. J Neurotrauma. 26 (1), 17-29 (2009).
- Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases. Hum Gene Ther. 27 (7), 478-496 (2016).
- Cheah, M., et al. Expression of an Activated Integrin Promotes Long-Distance Sensory Axon Regeneration in the Spinal Cord. J Neurosci. 36 (27), 7283-7297 (2016).
- Andrews, M. R., et al. Alpha9 integrin promotes neurite outgrowth on tenascin-C and enhances sensory axon regeneration. J Neurosci. 29 (17), 5546-5557 (2009).
- Tan, C. L., et al. Kindlin-1 enhances axon growth on inhibitory chondroitin sulfate proteoglycans and promotes sensory axon regeneration. J Neurosci. 32 (21), 7325-7335 (2012).
- McCarty, D. M., Young, S. M., Samulski, R. J. Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors. Annu Rev Genet. 38, 819-845 (2004).
- Mason, M. R., et al. Comparison of AAV serotypes for gene delivery to dorsal root ganglion neurons. Mol Ther. 18 (4), 715-724 (2010).
- Hermens, W. T., et al. Purification of recombinant adeno-associated virus by iodixanol gradient ultracentrifugation allows rapid and reproducible preparation of vector stocks for gene transfer in the nervous system. Hum Gene Ther. 10 (11), 1885-1891 (1999).
- Kappagantula, S., et al. Neu3 sialidase-mediated ganglioside conversion is necessary for axon regeneration and is blocked in CNS axons. J Neurosci. 34 (7), 2477-2492 (2014).
- Alto, L. T., et al. Chemotropic guidance facilitates axonal regeneration and synapse formation after spinal cord injury. Nat Neurosci. 12 (9), 1106-1113 (2009).
- Bonner, J. F., et al. Grafted neural progenitors integrate and restore synaptic connectivity across the injured spinal cord. J Neurosci. 31 (12), 4675-4686 (2011).
- Wang, R., et al. Persistent restoration of sensory function by immediate or delayed systemic artemin after dorsal root injury. Nat Neurosci. 11 (4), 488-496 (2008).
- Wong, L. E., Gibson, M. E., Arnold, H. M., Pepinsky, B., Frank, E. Artemin promotes functional long-distance axonal regeneration to the brainstem after dorsal root crush. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6170-6175 (2015).
- Tanguy, Y., et al. Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice. Front Mol Neurosci. 8, 36 (2015).
- Foust, K. D., Poirier, A., Pacak, C. A., Mandel, R. J., Flotte, T. R. Neonatal intraperitoneal or intravenous injections of recombinant adeno-associated virus type 8 transduce dorsal root ganglia and lower motor neurons. Hum Gene Ther. 19 (1), 61-70 (2008).
- Vulchanova, L., et al. Differential adeno-associated virus mediated gene transfer to sensory neurons following intrathecal delivery by direct lumbar puncture. Mol Pain. 6, 31 (2010).
- Gray, S. J., et al. Directed evolution of a novel adeno-associated virus (AAV) vector that crosses the seizure-compromised blood-brain barrier (BBB). Mol Ther. 18 (3), 570-578 (2010).
- Fagoe, N. D., Attwell, C. L., Kouwenhoven, D., Verhaagen, J., Mason, M. R. Overexpression of ATF3 or the combination of ATF3, c-Jun, STAT3 and Smad1 promotes regeneration of the central axon branch of sensory neurons but without synergistic effects. Hum Mol Genet. 24 (23), 6788-6800 (2015).
