Introduction
Sinir sistemi yaralanması sonrası akson rejenerasyonunu sağlanması zor bir iştir 1'dir. Merkezi sinir sisteminde (MSS) akson rejenerasyon başarısızlığını incelemek için araştırmacılar sinir yaralanması modelleri bir bolluk kullandık. MSS bölgeler farklı olarak, akson rejenerasyon çalışması için anatomik uygun modeli kullanmak önemlidir. Uygun bir model kullanarak, araştırmacılar, "tek için tüm" tedavi stratejisi karşıt olarak, yaralanma şiddetine, ilgili nöronal hücre tipine göre belirli bir tedavi ve rejenerasyon değerlendirmek için arzu edilen spinal kanal formüle edebilir.
omurilik yaralanması, örneğin, en zayıflatıcı semptomlar duyu ve hareket kaybı kaynaklanıyor. lokomosyon kaybı inen motor yolların hasar sonucu ise duyu kaybı, artan duyusal yolların hasar kaynaklanır. Nedeniyle bu tw arasındaki hücresel ve anatomik farklılıklarao yolları, birçok hedef akson rejenerasyonu çalışmaları sadece birinin başarılı kurtarma hastalara muazzam fayda olacağını gerekçe ile, bir ya da diğer yoluna odaklanmak. Bu makalede, bir viral vektör ve duyu aksonu rejenerasyonu araştırmak için bir model olarak bir yetişkin farenin alt servikal spinal kord eşzamanlı bir dorsal kök ezilme yaralanması ile direkt arka kök gangliyon (DRG) enjeksiyon kullanan bir protokol mevcut.
DRG duyu nöronları CNS'ye çevresinden, Dokunma duyusu ve ağrı gibi duyusal bilgilerin geçişi için sorumludur. omurilikte duyusal nöronların uzun akson çıkıntıların uzun mesafe akson rejenerasyonunu çalışmak için iyi bir model olarak hizmet vermektedir. Buna ek olarak, kemirgenler bu tür minimal refah komplikasyonlu bir dorsal kök ezilme yaralanması gibi bir duyusal yol lezyonu yaşayabilir olarak, araştırmacılar tamamen omuriliği lezyon oluşturmak gerek kalmadan MSS akson rejenerasyon çalışması olabilir. Dörtlü C5 - C8 (servikal level 5-8) dorsal kök ezilme yaralanması ön pençe deaferentasyon 2 için yararlı bir model olduğu gösterilmiştir. Ayrıca, bir dorsal kök ezilme yaralanması böyle glial skar oluşumu gibi diğer faktörler tarafından -komplikasyonsuz çünkü doğrudan omurilik yaralanması daha akson rejenerasyonu incelemek için "daha temiz" modelini sağlamaktadır.
Bir rejeneratif duruma nöronların yeniden programlamak için, viral gen terapisinin kullanımı giderek daha çok nörolojik durumlar 3 için umut verici bir tedavi stratejisi olarak kabul edilmiştir. Çalışmalar davranışsal iyileşme 4, 5, 6, sağlam akson rejenerasyonunu elde edebilirsiniz büyümeyi teşvik edici bir protein transgeni taşıyan bir adeno-bağlantılı virüs (AW) vektörü uygulanmasını göstermiştir. bir bağışıklık yanıtı ve nöronlar gibi bölünmeyen hücreleri transdüse yeteneğini ortaya çıkarmak AAV'nin belirgin düşük patojenik yapmakBu gen terapisi için uygun vektör. Buna ek olarak, rekombinant AAV bir şekilde tedavisi için kullanılır. Bu formda, bu, konakçı genomu 7 içine viral genomu entegre gibi lentivirüs gibi diğer viral vektörler ile karşılaştırıldığında girmeyle mutagenez riski azaltmanın kabiliyetine sahip değildir. Bu AAV gen tedavisi uygulamaları için güvenli bir seçim yapar.
bir DRG duyu nöronlarının hücre kütleleri içeri olarak, çalışma ve / veya duyu aksonu rejenerasyonunu teşvik etmek gen terapisi için virüsün tatbik için en uygun anatomik bir hedeftir. Kodlayan farklı AAV serotip ve lentivirüs karşılaştıran bir çalışmada, AAV serotip 5 (AAV5) DRG 8 enjekte edilmesi halinde, en az 12 haftalık bir süre boyunca DRG nöronlarını transdüse edilmesinde en etkili olduğu gösterilmiştir. Buna ek olarak, AAV gibi büyük çaplı nörofilaman 200 kDa olarak tüm DRG nöronal alt tipleri, iletici fazla% 40 dönüşüm verimliliğini elde edebilirsiniz(NF200) pozitif nöronların küçük çaplı kalsitonin geni ile ilişkili peptid (CGRP) - ya da isolectin b4 (IB4) pozitif nöronların 4, 8.
DRG enjeksiyonu ve dorsal kök ezilme yaralanması cerrahi prosedür olarak son derece invaziv ve narin, biz bu makalede, yeni kullanıcıların çok verimli bir şekilde prosedürünü öğrenmek için yardımcı olacağına inanıyoruz. C8 dorsal kök ezilme yaralanması - eşzamanlı C5 C7 DRG'ler - Bu yazıda, yetişkin dört hafta C6 bir kontrol virüsü AAV5-GFP (yeşil floresan protein) enjeksiyonundan sonra farelerde temsil edici sonuçlar göstermektedir. Bu model, duyu aksonu rejenerasyonunu teşvik etmek için, viral gen terapisinin kullanımı soruşturma araştırmacılar için uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm aşağıdaki hayvan prosedürleri Britanya Hayvanlar uyarınca (Bilimsel Prosedürler) Yasası 1986 bu işlemler aşina değilse yürütülmüştür, ulusal / yerel yönetmeliklere kontrol etmek ve protokol başlamadan önce veteriner başvurunuz.
1. Hayvanların bir Uygun Gerinim Seçimi
NOT: duyum ve pençe deafferentasyonu kaybına Bir dorsal kök ezilme yaralanması sonucu. Forepaw deafferentasyonu yaygın yan etkileri aşırı tımar, kendine zarar ve pençe autotomy içerebilir.
- prosedür için hayvanları alın.
Not: Sıçanlarda, bu gibi Lister Hooded-ve Wistar daha fazla aktif suşları, örneğin Lewis ve Sprague-Dawley olarak daha uysal suşlar ile karşılaştırıldığında deaferentasyon sonra pençe Kendi kendini daha yüksek bir oranda olması. Mümkünse, en uysal gerginlik Lewis, her zaman ilk düşünülmelidir. özellikle etkin soyu genetik m deney için gerekli olması halindeodification veya belirli davranışsal değerlendirme gereksinimleri, veteriner tedavi beklenen olumsuz etkilere yönelik yerinde olmalıdır.
2. Enjeksiyon için virüs hazırlanması
DİKKAT: Biyolojik ve laboratuar güvenlik yönetmeliklerine uygun olarak tüm virüsleri ele alın.
- Seyreltik veya / ml tek virüs paketleme protokolleri 9 Aşağıdaki 2 x 10 ila 12 genom kopyası (GC) bir titresine virüsü konsantre edilir.
Not: Burada, virüs% 5 sükroz ile Dulbecco fosfat tamponlu tuz (D-PBS) içinde seyreltildi. titresi virüs promoteri tipine bağlı olarak optimize edilmiş olması boyutunu oluşturmak ve hücre tipi hedef olabilir. - İsteğe bağlı: Daha sonra enjeksiyon kolay görüntülenmesi için virüs çözeltisine 1% renkli boya (örneğin Hızlı Yeşil) ekleyin. çok nazikçe çözüm karıştırın.
- (4 saat içinde) hemen kullanım için buz üzerinde çözüm tutun veya uzun bir -80 ° C dondurucu içindevadeli depolama.
3. Hayvan ameliyat öncesi hazırlık yapılması
NOT: cerrahinin aşırı invaziv nedeniyle, aseptik teknikler her zaman kullanılmalıdır.
- Hazırlayın ve ameliyat başlamadan önce tüm cerrahi aletler ve spinal stereotaksik çerçeve sterilize. Örneğin, 134 ° C'de bir otoklav içinde araçları sterilize edin. Her hayvan için sterilize araçları bir dizi yeni kullanın.
- hayvan anestezisi. geri çekme refleksi için ya da göz kapağı refleksi için kornea dokunarak test etmek için pençe kısma doğru anesthetization teyit edin.
- örneğin izofluran olarak inhalasyon anestezisi kullanılarak yetişkin sıçan için 2.0 L% 4 izofluran kullanımı / indüksiyonu için oksijen dak. aşırı veya yetersiz doz önlemek için hayvanın solunum desenine göre izofluran konsantrasyonunun değiştirilmesi, 1.5 L / oksijen dakika içinde% 3 izofluran - ameliyat boyunca muhafaza edilmesi için, 2 kullanımı.
- üzerindeHayvan başlangıçta anestezi ce hayvanın ameliyat öncesi ağırlığı kaydedin.
- Servikal DRG enjeksiyon için, skapula hemen distalinde için kulakları arasından boyun kürk traş. Bir antiseptik ürün ile traş bölgeyi dezenfekte edin.
- Uygun bir analjeziğin dozu (örneğin, 5 mg / kg karprofen) ve antibiyotik (örneğin, 5 mg / kg enrofloksasin) ile birlikte, hayvan kanadında tuzlu su deri altından 2 mL enjekte edilir.
- İşlem sırasında kornea kurumasını önlemek için her iki göze göz merhemi sürün.
- hayvan altına yerleştirilmiş, 37 ° C'de bir ısıtma yastığı ile bir omurga stereotaksik çerçeveye ameliyat geçin.
4. DRG enjekte ve Dorsal Kök Ezilme Yaralanması Sahne
NOT: Bu son derece hassas bir ameliyat. Hayvan ameliyatı yaşamak ilerlemeden önce anatomi tanımak için ilk önce birkaç ölü hayvan üzerinde pratik tavsiye edilir.
- Locate cilt üzerinde belirgin C2 ve T2 spinöz işlemler. Bir no.10 bisturi bıçağı (deri açıldıktan sonra, beyaz bir lifli doku orta hat kas birinci katman üzerinde görünür olmalıdır C2 ve T2 sinirsel uzantılar arasında bir cilt insizyonu olun, kas birinci tabaka bir " ) doku, "jel benzeri.
- Bir neşter bıçak kullanarak beyaz orta hat boyunca kas ilk katman üzerinde benzer boyutlu bir kesi olun. Orada yakınında bulunan inen aorttan büyük arter dalı olmadığı için, belirgin T2 sinirsel uzantı ötesine gitme.
NOT: Ağır kanama itibaren bu adımı her yerde oluşabilir. Her zaman kanamayı durdurmak ve her zaman açıkça görüntülenmesini sağlamak için sterilize pamuk tomurcukları veya cerrahi emilebilen süngerler kullanarak kan kaldırın. prosedürün devam etmek, "körlemesine" sonradan hayvanda beklenmeyen advers etkilere yol açarak omurilik, DRG veya dorsal kök istenmeyen hasarlara yol açabilir. - geri çekmekİki retraktör, bir rostral yerleştirilir ve bir kaudal kullanılarak kas birinci tabaka; kas ikinci tabakası, çizgili bir görünümü olan, görünür olmalıdır.
- (Iki uzunlamasına kas ince zar doku ile bağlantılı gözlemlenebilir) kas ikinci tabakanın orta hat bulun. iki uzunlamasına kas ayırmak için microscissors çifti kullanılarak zar doku inceleyin. Bu gereksiz kas hasarı ve kanama neden olabileceğinden, bir neşter bıçak mümkünse kullanmaktan kaçının.
- omurga kaplayan ince kas üçüncü tabakasını açığa çıkarmak için uygun şekilde Ekartörleri ayarlayın. sinirsel uzantıların hafifçe kas üçüncü tabakası üzerine bir çift forseps ile dokunularak hissedilebilir.
- microscissors kullanarak kas üçüncü katman üzerinde küçük bir kesi olun ve yavaşça açıkça omurga ortaya çıkarmak için bir Yandan şekilde küret veya neşter kullanılarak kemikten kas kazıyın. Gerekirse, Lami yapmak uzakta kas veya tendon bazı kestinectomy kolaylaştırır.
- C8 DRG'ler C4 üzerinde sol hemi-laminektomi gerçekleştirmek - - sol C5 göstermek için dikkatli bir şekilde bir tabakanın bir bölümünün ortadan kaldırılması ve pedikül ince rongeurs bir çift kullanarak T1 omurun. DRG vertebranın enine foramen yakınında yer almaktadır.
NOT: C3 - C7 omurları önemli bir spinöz prosesi yok. C5 DRG C4 ve C5 omurlar arasında yer alan C8 DRG C7 ve T1 vertebralar arasında iken, C6-DRG, böylece C5 ve C6 vertebralar arasında, ve. bir C8 omur bir C8 DRG varlığında ve bir C8 omurilik segmenti rağmen vardır. - DRG kadar enjeksiyon için maruz kaldıktan sonra, stereotaksik şırınga tutucuya ısmarlama, 33-gauge küt iğneye sahip virüs doldurulmuş mikrolitre şırınga yerleştirerek şırıngayı hazırlar. enjeksiyondan önce, enjeksiyon iğnesinin sokulmasından yardımcı olmak üzere, hedeflenen DRG her bir yüzeyel açıklığı yapmak için bir 30-gauge şevli iğne kullanın.
- 33 g yerleştirinstereotaksik koordinatları ayarlamak için hafifçe düğmeleri çevirerek DRG merkezine auge iğne. Bu sıvı DRG ventral taraftan dışarı sızmasına neden olabileceğinden, iğne aşırı sokmayın. Meydana hemen iğnenin konumunu ayarlamak sızdırma.
NOT: sayısal stereotaksik koordinatlar kullanılmaz; ancak, enjeksiyon için iğne tutmak için çerçeve kullanmak yararlıdır. - bir infüzyon şırınga pompası kullanılarak 0.2 uL / dakika, her DRG virüsün 1 uL enjekte edilir. iğne çekilmeden önce üç dakika daha bekleyin. virüs çözümü renkli bir boya içeriyorsa Enjeksiyon sırasında, DRG yavaşça rengi değişir.
- Eş zamanlı bir C5 gerçekleştirmek için - C8 dorsal kök ezilme yaralanması, her bir kök 10 sn için üç kez ezmeye her biri kullanılarak tamamen forseps uçlarına karşı ince uçlu forseps (Bonn Mikro), bir çift; dokuda beyaz çizgi ezilme yerinde görünmelidir. Forc ile gerekli daha derine gitmeBu şekilde eps, ventral kök hasara neden olabilir.
- Enjeksiyon ve / veya ezilme takiben, kanama veya hayvan yukarı kapatmadan önce kesi yerinde sol kemik parçalarının küçük parçalar olduğundan emin olun. Tercih edilmesi durumunda, maruz omurilik ve DRG üstünde cerrahi emilebilen sünger küçük bir parça koyun.
- kasının üçüncü tabaka dikiş olmadan omurga üzerine doğal olarak geri toplanmasını sağlayınız. Gevşek olarak, ikinci tabaka üzerinde iki uzunlamasına kas emilebilir 6-0 sütür malzemesi (≈ 3 sütür kesilmiş) dikin. emilebilir 6-0 sütür malzemesi ile kas birinci tabaka (≈ 5 sütür kesintiye) dikin.
- emilebilir 5-0 sütür malzemesi ile deri (≈ 10 dikiş kesilmiş) dikin.
NOT: dikişler çok sıkı olmadığından emin olun. Cildin Şişkin aşırı sıkma bir işaretidir ve hayvana rahatsızlık verebilir. - yoğun kanama ameliyat sırasında meydana gelmesi halinde, deri altından enjekte 1-2yerel yönetmeliklere göre izin verilen salin ml hayvandan sıvı kaybını önlemek için.
- yenilebilir nemlendirici jel sağlar ve tutma alanına geri hayvan dönmeden önce en az 1 saat boyunca normal izleme yapılması, hayvan anesteziden bütünüyle geri izin verir.
- duyu aksonu rejenerasyon değerlendirmek için en uygun transgen ifadesi için en az 3 hafta süreyle hayvan tutun.
Hayvan 5. Sahne Ameliyat sonrası bakım
- ilk hafta sonrası ameliyat sırasında hayvan için yiyecek püre ve yumuşak pamuklu yatak sağlayın. Gerekirse, yerel / ulusal düzenlemelere ve veteriner tavsiyesi doğrultusunda iyileşme ile yardımcı olmak için analjezik ve antibiyotik ilave dozları uygulama.
- 10 gün - 7 sonra ciltte dikiş çıkarın.
NOT: Ameliyattan yaygın yan etkileri, kesi yerinde seroma veya hematom oluşumunu kapsar nedeniyle sebep olduğu kaşıntı için ciltte iz çizikİç emilebilir dikişlerle, ince duyusal veya lokomosyon açıkları ve dorsal kök ezilme yaralanması sonrası deafferented pençe üzerinde kendini yaralama işaretler. esasen beklenenden daha şiddetli herhangi refah sorunları için acil veteriner başvurun.
6. Aksonal İzleme için bir İleriye CTB Enjeksiyonu Sahne
NOT: doku koleksiyonuna bir hafta önceden izleme kolera toksini B alt birimi (CTB) aksonal gerçekleştirmek için tavsiye edilir.
- üreticinin talimatlarına göre% 1 CTB çözeltisi hazırlayın.
- İsteğe bağlı: Daha sonra, enjeksiyon kolay görülmesi için çözeltiye% 1 renkli boya ekleyin. çok nazikçe çözüm karıştırın.
- hayvan anestezisi (adım 3.2.1) ve tabloya ekstremite bantlama, sol forepaw kararlı hale getirir.
- El ve yavaş yavaş deri altından tüysüz ayak tabanı merkezine% 1 CTB 1 uL enjekte dört basamaklı bir mikrolitre şırınga monte wi kullanılarakısmarlama, 33-geyçlik iğne th.
NOT: Enjeksiyon önce, ilk enjeksiyon iğne yerleştirilmesi konusunda yardımcı ciltte küçük yüzeysel açılışını yapmak için 30-gauge eğimli iğne kullanmak için yardımcı olur. - hayvan bekleme salonuna hayvan dönmeden önce anestezi tamamen kurtarmak için izin verin.
7. Toplama Doku
- İmmünohistokimya için, virüs enjekte DRG ve omurilik toplamak için, anestezi aşırı dozda uygulanması ve transkardiyal soğuk% 4 paraformaldehid, ardından fosfat tamponlu tuzlu su ile hayvan serpmek. Dikkatle mikroskop altında sabit doku toplamak omurga üzerinde tam laminektomi gerçekleştirmek. Analiz 4, 5, 6 için gerekli olan doku terkibi, kesit ve işleme devam edin.
Not: s varlığı ile gözlendi olarak elde yara yeri, açıkça görüleceğiaraba dokusu. - Alternatif olarak, in vitro kültür için virüs enjekte DRG toplamak için, örneğin, karbon dioksit, bir yükselen konsantrasyonu olarak, uygun bir yöntem ile insani hayvan kurban. Dikkatle mümkün olduğunca aseptik koşullar sağlanması mikroskop altında DRG teşrih. 10, 6, 5, 4, istenen doku kültürü ile devam edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
bir temsili olarak, bağlı DRG enine bir omurilik bölümü C7 doğrudan, DRG nöronlarını transduse ve dört hafta kontrol virüsü, AAV5-GFP enjekte sonra omurilikte duyu aksonları izleme bu protokol etkinliğini göstermek için sunulmaktadır dorsal kök ezilme yaralanması (Şekil 1A) olmadan DRG. Sırt kolon ve omurilik dorsal boynuzu hem de Aksonlar GFP (Şekil 1B), hem de enjekte DRG (Şekil 1C) içinde hücre gövdeleri ve aksonlar ifade eder. Kama şeklinde çekirdeğin ek anatomik analizi, beyin sapı duyu aksonu terminali, pozitif anterograd CTB (Şekil 1D) izleme ortaya koymaktadır.
DRG enjeksiyon tam bir C5-C8 dorsal kök ezilme yaralanması olan eşzamanlı gerçekleştirildiğinde, omurilik ya da CTB-pozitif terminalde GFP pozitif aksonlarkama şeklinde çekirdeğe s (Şekil 2A) gözlenir. Ancak, axotomized duyusal aksonlar hala ama ötesinde omurilik 4, 5 (Şekil 2A) içine, bir PNS ortamdır tamamen ezilmiş dorsal kökü, dorsal kök giriş bölgesi kadar yenileyebilir belirtmekte fayda olduğunu. Enjekte virüs büyüme potansiyeli olan bir destekleyici proteinin transgen içerir durumunda, omurilikte etiketli aksonların mevcudiyeti rejenerasyon ya da eksik bir dorsal kök ezilme yaralanması (Şekil 2B) ya da temsil edebilir. Bu iki çıktıları arasında ayrımcılık için, cuneate çekirdeğinde CTB aksonal izleme analiz edilmelidir. CTB-pozitif terminaller yokluğu yeniden akson omuriliğe kısmi rejenerasyon, anlaşılacağı ise kama şeklinde çekirdekte CTB-pozitif terminaller varlığı, tam olmayan yaralanma (Şekil 2C) olasılığını vurgulamaktadırcuneate çekirdeği (Şekil 2B) ulaşmak için tüm mesafeyi büyümeye muhtemeldir mümkün değildir. Bugüne kadar, kama şeklinde çekirdeğe başarılı duyu aksonu yenilenmesi çoğunlukla yüksek servikal yaralanması 11, 12 ya da nörotrofinlerin 13, 14 uygulama ile vakalarda bildirilmiştir. Eksik yaralanma belirtileri gösteren herhangi bir hayvan akson rejenerasyon çalışmalarının dışında tutulmalıdır.
Şekil 1: Bir Dorsal Kök ezilme yaralanması olmaksızın DRG Enjeksiyon. (AC) dört hafta AAV5-GFP enjeksiyonundan sonra DRG (C) 'de, sırt kolon ve dorsal boynuzu (B) ve hücre gövdeleri içeren omurilikteki GFP pozitif aksonlar (A) gösteren Omurilik bölümü. <kama şeklinde çekirdeğin güçlü> (D) CTB-pozitif duyusal akson terminalleri CTB enjeksiyonun bir hafta ardından. Ölçek çubuğu 650 um (AC) ve 250 um (D) 'dir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 2: Dorsal Kök Yaralanma ve Axon Rejenerasyon Crush değerlendirilmesi. (A), kama şeklinde çekirdeğinde omurilik veya CTB-pozitif akson terminallerinde bir etiketli aksonlarda tam bir dorsal kök ezilme yaralanması sonucu. Axotomized duyusal aksonlar ama ötesinde omurilik içine, dorsal kök giriş bölgesi kadar yeniden oluşturabilirsiniz. (BH) omurilikte etiketli aksonların mevcudiyeti eksik yaralanma veya regenerati herhangi birini temsil eder(B). Bunların yokluğu omurilik (D) içine tam yaralanma ve potansiyel olarak kısmi rejenerasyon anlaşılacağı ise ek analizi ile, kama şeklinde çekirdekte CTB-pozitif terminaller varlığı, tam olmayan yaralanma (C) göstermektedir. ölçek çubuğu 250 um'dir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede, bir yetişkin farenin alt servikal spinal kord bir DRG enjeksiyon ve dorsal kök ezilme yaralanması gerçekleştirmek için adım adım kılavuzu mevcut. Bu son derece invaziv ve hassas cerrahi olduğu için, şiddetle tüm potansiyel kullanıcılar hayvan ameliyatı yaşamaya ilerlemeden önce yeterli eğitim ve uygulama elde öneririz. Kullanıcıların omurilik anatomisi ile değil, aynı zamanda çevredeki kas dokularının, omurga kemik yapısı ve damar sistemine sahip sadece aşina olmalıdır. İdeal olarak, yetkili bir kullanıcının omuriliğe zarar indüklemeden omurların bir bölümünün ortadan kaldırılması ile temiz bir laminektomi gerçekleştirilmesi, çevre dokulara en az hasar ile işlemi gerçekleştirmek mümkün olmalıdır. omurilik yaralanması belirgin olarak, omurilikteki küçük lezyon tüm sinir sistemi için yaygın bir zararlı bir etkiye sahip olabilir. Buna ek olarak, bir "temiz" ameliyat geçiren hayvanlar beklenmedik Direk- muzdarip olasılığı daha düşüktürameliyat komplikasyonları ve sosyal sorunlar ve bu nedenle arzu edilen deneysel zaman noktasından önce kurban edilmesi için daha az muhtemeldir.
15 intravenöz, intraperitoneal 16, intratekal 17 veya doğrudan enjeksiyon hedef 4, 8 içine: sinir sistemi içine virüsü yönetmek için bir uygulama birkaç olası yolları vardır. Damar içi ve intraperitoneal enjeksiyonlar nispeten invazif olmayan bir olmasına rağmen, kan-beyin bariyerinin kesişme bir sorun 18 olabilir ve bu rotalar özel bir akson rejenerasyonunun çalışmasında yararlı olmayacaktır spesifik olmayan transdüksiyon ile sonuçlanır. Benzer şekilde, subaraknoid boşluk, daha istilacı yönetim rotasına, zar içi enjeksiyon için, CNS içindeki çoğu nöronal ve nöronal olmayan hücre tipleri, potansiyel olarak spesifik olmayan ya da off-targe üretilmesi, dönüşüm yoluylat etkileri. Böylece, DRG içine virüsün doğrudan enjeksiyon olumlu seçenek ve diğer yöntemlere göre çok daha yüksek transdüksiyon etkisi sonuçlanması muhtemeldir. Bu seçeneğin en büyük dezavantajı ise uzman eğitim gerektirir cerrahi prosedür, bir invazivlik olduğunu.
Kullanıcıların gerekli cerrahi beceri hakim olması, bu protokol esneklik büyük miktarda sunuyor. Toplanan dokular anatomik analiz veya doku kültürü 4 için de kullanılabilir sırasında bir akson rejenerasyonunun çalışmada, hayvanlar, örneğin, in vivo elektrofizyoloji ve duyusal-motor davranış testleri gibi diğer teknikler ile kombine olarak yapılabilir. Çeşitli deneysel zaman noktaları ile, bu tekniklerin bir kombinasyonu, örneğin, ezilme yaralanması 4 sonra dejenerasyonu ya da NF200, CGRP ve IB4 olarak farklı lif alt-tipleri, yenilenme ilerlemesini incelemek için kullanılabilir. Deneysel requireme bağlıNTS, bir ya da sunulan prosedürler diğer tek başına gerçekleştirilebilir. yalnız dorsal kök ezilme yaralanması ön pençe Deafferentasyon gereklidir herhangi çalışmalarda kullanılabilecek Örneğin, tek başına DRG enjeksiyon, aksonal izleme deneyleri için de kullanılabilir. Buna ek olarak, kullanıcılar virüsü ve enjeksiyon için, transgen ürünün tipi değişebilir, tam DRG enjekte edilir ve tam olarak dorsal kök hasarı için gereken. Mevcut ise, DRG içine hücre transplantasyonu, ya farmakolojik uygulama da bu protokolü kullanılarak gerçekleştirilebilir. Ayrıca omurilik fonksiyonunu 5 incelemek için, 19 veya dorsal kolon ezilme yaralanması - (hindlimb fonksiyonunu değerlendirmek için L5 L3 içine örneğin) edinilen cerrahi becerilerin üzerine kurulan deneyimli bir kullanıcı, bel bölgesinde DRG enjeksiyon gibi diğer tekniklerle geçebilirsiniz.
Sonuç olarak, DRG enjeksiyon ve dorsal kök ezilme yaralanması duyusal akson reg incelemek için yararlı bir model olduğuna inandığımızeneration. invaziv cerrahi işlem gerçekleştirmek için özelleşmiş eğitim için gerekliliğe rağmen, protokol esnektir ve potansiyel kullanıcıların deneysel gereksinimlerini karşılamak için birçok parça değiştirebilir. Bu prosedürler, duyu aksonu yenileme çalışmaları için uygun bir hayvan modeli arama için bir temel olarak hizmet edebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma Christopher ve Dana Reeve Vakfı, Tıbbi Araştırma Konseyi, Avrupa Araştırma Konseyi ECMneuro ve Cambridge NHMRC Biyomedikal Araştırma Merkezi tarafından finansal olarak desteklenmiştir. Biz çekimler sırasında kendi teknik yardım için Heleen Merel van 't Spijker ve Justyna Barratt için en derin şükranlarımı istiyoruz. Biz AAV üretiminde yardımcı olmak için Doktor Elizabeth Moloney ve Profesör Joost Verhaagen (Nörobilim Hollanda Enstitüsü) teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fast Green FCF dye | Sigma-Aldrich | F7258 | For visualizing colorless solution. Recommended concentration: 1% |
| Cholera Toxin B subunit | List Biological Laboratories | 104 | For anterograde axonal tracing. Recommended concentration: 1% |
| IsoFlo | Zoetis | 115095 | Inhalation anesthetic (active ingredient: isoflurane) |
| Baytril 2.5% injectable | Bayer | 05032756093017 | Antibiotic (active ingredient: enrofloxacin). Manufacturer's recommended dosage: 10 mg/kg |
| Carprieve 5.0% w/v | Norbrook | 02000/4229 | Analgesic (active ingredient: carprofen). Manufacturer's recommended dosage: 4 mg/kg |
| Lacri-Lube | Allergan | PL 00426/0041 | Eye ointment |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | FST 12502-12 | |
| Friedman Pearson Rongeur Curved 0.7 mm Cup | Fine Science Tools | FST 16121-14 | |
| Bonn Micro Forceps | Fine Science Tools | FST 11083-07 | For performing dorsal root crush injury |
| Tissue Separating Scissors | Fine Science Tools | FST 14072-10 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | FST 14058-11 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | FST 11018-12 | |
| Goldstein Retractor | Fine Science Tools | FST 17003-03 | |
| Vannas Spring Scissors (straight) | Fine Science Tools | FST 15018-10 | |
| SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge | Ethicon | 1972 | For bleeding control |
| Microliter Syringe RN701 (10 μL) | Hamilton | 80330 | |
| Custom-made Removable Needle (for DRG injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 38 mm, point style 3 |
| Custom-made Removable Needle (for CTB injection) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 10 mm, point style 3 |
| UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 |
References
- Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog Brain Res. 201, 253-294 (2012).
- Wu, A., Lauschke, J. L., Morris, R., Waite, P. M. Characterization of rat forepaw function in two models of cervical dorsal root injury. J Neurotrauma. 26 (1), 17-29 (2009).
- Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases. Hum Gene Ther. 27 (7), 478-496 (2016).
- Cheah, M., et al. Expression of an Activated Integrin Promotes Long-Distance Sensory Axon Regeneration in the Spinal Cord. J Neurosci. 36 (27), 7283-7297 (2016).
- Andrews, M. R., et al. Alpha9 integrin promotes neurite outgrowth on tenascin-C and enhances sensory axon regeneration. J Neurosci. 29 (17), 5546-5557 (2009).
- Tan, C. L., et al. Kindlin-1 enhances axon growth on inhibitory chondroitin sulfate proteoglycans and promotes sensory axon regeneration. J Neurosci. 32 (21), 7325-7335 (2012).
- McCarty, D. M., Young, S. M., Samulski, R. J. Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors. Annu Rev Genet. 38, 819-845 (2004).
- Mason, M. R., et al. Comparison of AAV serotypes for gene delivery to dorsal root ganglion neurons. Mol Ther. 18 (4), 715-724 (2010).
- Hermens, W. T., et al. Purification of recombinant adeno-associated virus by iodixanol gradient ultracentrifugation allows rapid and reproducible preparation of vector stocks for gene transfer in the nervous system. Hum Gene Ther. 10 (11), 1885-1891 (1999).
- Kappagantula, S., et al. Neu3 sialidase-mediated ganglioside conversion is necessary for axon regeneration and is blocked in CNS axons. J Neurosci. 34 (7), 2477-2492 (2014).
- Alto, L. T., et al. Chemotropic guidance facilitates axonal regeneration and synapse formation after spinal cord injury. Nat Neurosci. 12 (9), 1106-1113 (2009).
- Bonner, J. F., et al. Grafted neural progenitors integrate and restore synaptic connectivity across the injured spinal cord. J Neurosci. 31 (12), 4675-4686 (2011).
- Wang, R., et al. Persistent restoration of sensory function by immediate or delayed systemic artemin after dorsal root injury. Nat Neurosci. 11 (4), 488-496 (2008).
- Wong, L. E., Gibson, M. E., Arnold, H. M., Pepinsky, B., Frank, E. Artemin promotes functional long-distance axonal regeneration to the brainstem after dorsal root crush. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6170-6175 (2015).
- Tanguy, Y., et al. Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice. Front Mol Neurosci. 8, 36 (2015).
- Foust, K. D., Poirier, A., Pacak, C. A., Mandel, R. J., Flotte, T. R. Neonatal intraperitoneal or intravenous injections of recombinant adeno-associated virus type 8 transduce dorsal root ganglia and lower motor neurons. Hum Gene Ther. 19 (1), 61-70 (2008).
- Vulchanova, L., et al. Differential adeno-associated virus mediated gene transfer to sensory neurons following intrathecal delivery by direct lumbar puncture. Mol Pain. 6, 31 (2010).
- Gray, S. J., et al. Directed evolution of a novel adeno-associated virus (AAV) vector that crosses the seizure-compromised blood-brain barrier (BBB). Mol Ther. 18 (3), 570-578 (2010).
- Fagoe, N. D., Attwell, C. L., Kouwenhoven, D., Verhaagen, J., Mason, M. R. Overexpression of ATF3 or the combination of ATF3, c-Jun, STAT3 and Smad1 promotes regeneration of the central axon branch of sensory neurons but without synergistic effects. Hum Mol Genet. 24 (23), 6788-6800 (2015).
