Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultur von gemischten murine kleinen Darmzellen. Diese primären intestinalen Kulturen ermöglichen die Untersuchung von Signalwegen zugrunde liegenden Darmpeptid die Sekretion einer Reihe von Techniken.
Abstract
Der Darm ist das größte endokrine Organ des Körpers, mit hormonsezerniere enteroendokrinen Zellen entlang der Länge des Magen-Darm-Epithel entfernt. Trotz ihrer physiologischen Bedeutung, repräsentieren enteroendokrinen Zellen nur einen kleinen Teil der epithelialen Zellpopulation und in der Vergangenheit hat ihre Charakterisierung eine große Herausforderung in einer Abhängigkeit von Zelllinie Modellen resultierende präsentiert. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für die Isolierung und Kultur von gemischten murine kleinen Darmzellen. Diese Primärkulturen wurden verwendet, um die Signalwege, die unter der Stimulierung und Hemmung von Darmpeptid Sekretion in Reaktion auf eine Reihe von Nährstoffen und Neuropeptiden sowie pharmakologische Wirkstoffe zu identifizieren. Ferner wird in Kombination mit der Verwendung von transgenen Mäusen fluoreszierender Reporter haben wir gezeigt, daß diese Primärkulturen ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung von fluoreszenzmarkierten Zellen an den enteroendokrinen in wordenzellulären Ebene, unter Verwendung von Verfahren wie Patch-Clamp und Einzelzellen-Calcium und cAMP-FRET-Bildgebung.
Introduction
Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist, zu isolieren und Kultur gemischt murinen Darmzellen die Untersuchung der Darm-Peptid-Sekretion und Live Cell Imaging von enteroendokrinen Zellen zu ermöglichen. Eine frühe Version dieses Verfahrens wurde ursprünglich im Jahr 2008 von Reimann et al. Und 1 hat , da die Basis von weiteren 20 Veröffentlichungen unserer Arbeitsgruppe gebildet. Aus diesem Manuskript, wählten wir auf kleine Darm-Kulturen zu konzentrieren, da sie schwieriger sind als Kolon-Kulturen zu etablieren.
Enteroendokrinen Zellen sezernieren eine Reihe von Darmpeptide einschließlich Glucagon-like Peptid 1 (GLP-1), glukoseabhängige insulinotrope Peptid (GIP), Cholecystokinin (CCK) und Peptid YY (PYY) 2. Diese Darmpeptide haben wichtige physiologische Rolle in der postprandialen Reaktionen wie die Verlangsamung der Darmtransit orchestriert, Potenzierung der Glucose-stimulierte Freisetzung von Insulin und Induktion der Sättigung. GLP-1-Mimetika and Medikamente , die seinen Abbau hemmen , werden derzeit für die Behandlung von Typ - 2 - Diabetes zugelassen , und es gibt die laufende Beurteilung des therapeutischen Potenzials der endogene Sekretion dieses Peptids 3 stimuliert. Ein besseres Verständnis der enteroendokrinen Physiologie und die Mechanismen, durch die die Sekretion entweder stimuliert oder gehemmt ist daher von entscheidender Bedeutung.
Gut Peptid - Sekretion untersucht wird , kann eine Vielzahl von in vitro und ex vivo unter Verwendung von experimentellen Modellen, die jeweils Vor- und Nachteilen (für eine umfassende aktuelle Übersicht abdeckt auch die Verwendung von in - vivo - Modellen siehe Svendsen et al. 4). Ex - vivo - Techniken , wie beispielsweise der Darm isoliert perfundierten 5 und Ussing - Kammern 6 sind derzeit verwendeter Darm - Peptid - Sekretion als Antwort auf verschiedene Substanzen zu entdecken. Der Hauptvorteil dieser Methoden, wiePrimärkulturen im Vergleich zu, ist, dass die unmittelbare Umgebung der enteroendokrinen Zellen weitgehend intakt bleibt und vor allem wird die Polarität der Zellen erhalten. Daher ist es möglich , Informationen zu entlocken , die die Zelloberfläche ein Sekretagogum auf 6 wirkt. Diese sind jedoch typischerweise geringe Durchsatzverfahren, und die Qualität der von ihnen abgeleiteten Daten stützt sich stark auf die Integrität und Lebensfähigkeit des Darmgewebes, die zwangsläufig mit der Zeit abnehmen.
Intestinale Organoide werden jetzt in zunehmendem Maße als in vitro - Modelle für die Untersuchung der enteroendokrinen Zellfunktion und Entwicklung 7 verwendet wird. Organoide, die sowohl von murinen und humanen Geweben abgeleitet werden können, hat den Vorteil der 3D ‚Krypta-like‘ Strukturen bilden, die Zellpolarität in Kultur halten. Jedoch haben organoiden abgeleitetes enteroendokrinen Zellen noch nicht vollständig an natives L cel charakterisiert und ihre Ähnlichkeit werdenls bleibt weitgehend unbekannt. Primäre Kulturen haben den Vorteil, einen Schritt näher an der physiologischen Einstellung zu sein, wie enteroendokrinen Zellen sind nicht in künstlichen Bedingungen für längere Zeiträume aufrechterhalten und differenziert.
Eine alternative Primärkulturverfahren , die für die Bewertung der Darm - Peptid - Sekretion eingesetzt wurde , ist die Isolierung von fötalen Rattendarmzellen (FRICS) 8. Allerdings hat sich die Kultur von adulten Darmgewebe mit weniger Erfolg und einige Unterschiede wurden in der Ansprechbarkeit von FRICS vs. erwachsenen Mäuse - Darm-Zellen (zB Glucose 8) beobachtet.
Enteroendokrinen artigen Zelllinien (zB GLUTag, STC-1 und NCI-H716) werden traditionell verwendet worden vs direkt zu unterscheiden. indirekte Wirkungen auf Zellen und enteroendokrinen zugrunde liegende molekulare Mechanismen sezieren, um Sekretionskopplung Reiz; siehe Kuhre et al 9 für die Peptidproduktion und Sekretion von ‚L zellähnliche‘ immortalisierte Zelllinien. Dies wurde als enteroendokrinen Zellen notwendig gewesen, entlang des Magen - Darm - Trakt verstreut, bilden knapp 1% der intestinalen Epithelzellen 10 und sortierten Zellen, in unseren Händen, nicht überleben in Kultur 1. Zelllinien nützliche Werkzeuge bleiben aufgrund der Tatsache, dass sie eine weitgehend homogene Zellpopulation sind, die auf genetische Manipulationen, wie Gen-Silencing förderlich ist. Folglich ist es leicht, die Rolle von Proteinen zu untersuchen, die nicht pharmakologisch ausgerichtet werden können, wenn transgene Mäuse nicht verfügbar sind. Allerdings Zelllinien sind nicht immer gültig Modelle von Primärzellen. Zwar gibt es viele Ähnlichkeiten, Erkenntnisse aus Primärkulturen gelegentlich hervorgehoben haben Unterschiede in den Signalweg durch bestimmte Nährstoffe in primären L - Zellen im Vergleich zu GLUTag Zellen aktiviert, zum Beispiel (z. B. Peptone <sup class = "xref"> 11). Entscheidend ist, dass in Kombination mit transgenen Mäusen fluoreszierenden Reporter, das primäre Kulturmodell ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der einzelnen Primär enteroendokrinen Zellen an der intrazellulären Ebene. Fluoreszenz-markierte L - Zellen innerhalb von Primärkulturen werden für die Patch - Clamp - 1, 12 Studien , die von unserer Gruppe verwendet wurden, und Einzelzellen - Calcium 11, 13 und cyclischem Adenosinmonophosphat-FRET - Bildgebung 14 Studien, die wesentliche Fortschritte auf dem Gebiet der enteroendokrinen nachgegeben Physiologie.
Das folgende Protokoll ist für die Durchführung der Sekretion Experimente optimiert, eine 24-Well-Platte oder für die Herstellung von bis zu 16 Abbildungs Geschirr, aus einem 10 cm-Abschnitt des Dünndarms von einer einzigen erwachsenen Maus. Das Protokoll kann leicht für die Untersuchung von Kolon-Zellen modifiziert werden, indem Aufschlusszeiten zu erhöhen und Collagenase Konzentration.
Protocol
Alle Tier Verfahren wurden von der University of Cambridge Tierschutz und ethische Prüfungsgremium genehmigt und entsprachen den Animals (Scientific Procedures) Act 1986 Änderung der Verordnungen (SI 2012/3039).
1. Vorbereitung im Voraus
- Einen aliquoten Teil Basalmembranmatrix (BMM) (~ 200 & mgr; l) auf Eis auftauen.
HINWEIS: Die BMM erstarrt bei Raumtemperatur (RT). - Vorwärmen 50 ml sterile Hoch Glukose Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) (ohne Zusätze) und ~ 40 ml steriles Kulturmedium (High-glucose DMEM mit 10% fötalen Rinderserum (FBS), 100 U / ml Penicillin und 0,1 mg / ml Streptomycin (P / S) und 2 mM L-Glutamin) in 50 ml - Zentrifugenröhrchen in einem Wasserbad bei 37 o C.
- Vorkühlung Calcium- und Magnesium-enthaltende Phosphat-gepufferte Saline (PBS).
- Abwiegen 15 mg Kollagenase (XI roh), in dem ein 50 ml Zentrifugenröhrchen halten und es auf Eis.
2. Gewebeentnahme
- Hinzufügen ~ 20 ml L-15-Medium in ein 50 ml-Zentrifugenröhrchen und ihn auf Eis.
- Euthanize eine Maus durch zervikale Dislokation oder andere Zeitplan 1 Methode zugelassen.
HINWEIS: Darmgewebe wird in der Regel von Mäusen auf einem C57BL6 Hintergrund erhalten. Allerdings haben andere genetische Hintergründe auch zB 129 / SvEv 15 verwendet. Imaging Experimente erfordern die Verwendung von fluoreszierenden Reporter Mäuse zB GLU-Venus 1. Das Gewebe wird von erwachsenen Mäusen (2-6 Monate) beiderlei Geschlechts erhalten. Die Mäuse werden in individua untergebrachtlly belüftete Käfige mit ad libitum Zugang zu Wasser und reguläres Futter. Allerdings kann die Wirkung einer hohes Fett - Diät, zu testen , Experimente zum Beispiel auf enteroendokrinen Zellfunktion 16 durchgeführt werden , wenn sie von einer Projektlizenz unterstützt. - Sezieren und sanft entfernen Maus Darms (von Pylorus des Rektums zu starten) unter Verwendung einer Pinzette und Schere Dissektion. Bewahren Sie es in L-15-Medium auf Eis bis zum Gebrauch.
3. Gewebepräparation
- Platzieren Darmgewebe in einer 10 cm Petrischale ausreichend PBS, das um das Gewebe zu bedecken. Nehmen 10 cm von gewünschten Geweben (zB oberen Dünndarm, top 10 cm, distal Pylorus).
- Auszuspülen Darminhalt unter Verwendung einer Kunststoff - Pasteurpipette und gekühlt PBS.
- Mit einer Pinzette vorsichtig Griff ein Ende des intestinalen Segments und Ort der Spitze einer Pasteur-Pipette hinein. Auszuspülen Inhalt mit gekühltem PBS. Wiederholen von beiden Enden bis zum majorität des Inhalts ausgespült wurde. Übertragen auf eine saubere Petrischale frisch gekühlt PBS enthält.
- Mit einer Pinzette, entfernen Sie das Fettgewebe und Gekröse, kümmert sich die Muskelschicht in der gleichen Zeit nicht abziehen.
- Peel die Muskelschicht „wie eine Socke“ unter einem Präpariermikroskop mit zwei Sätzen von feiner Pinzette aus.
HINWEIS: Dieser Schritt ist nicht wesentlich, aber sehr zu empfehlen. Es gibt alternative Möglichkeiten, die Muskelschicht, die die hier beschriebenen entfernen. Zum Beispiel kann der Darm in Längsrichtung offen erster geschnitten werden, vor der Entfernung des Muskelschicht.- Finden Sie einen Ausgangspunkt an dem mehr proximalen Ende des Gewebes, wo es eine sichtbare Klappe des Muskels ist. Ziehen Sie eine kleine Menge der Muskelschicht den ganzen Weg um den Darm entfernt.
HINWEIS: Um ein Reißen der Muskelschicht oder das Darmepithel zu vermeiden, verringern die Spannkraft durch eine größere Oberfläche Spann anstatt die tips der feinen Pinzette. - Festzuklemmen Darm und so viel von den Muskellappen wie möglich ziehen sanft auseinander und beginnt, die Muskelschicht aus dem ganzen Darm Abblättern. Um zu vermeiden, beide Schicht und Epithel des Muskels reißen, halten Sie die Position der Zange Nachstellen, um sie zusammen zu halten schließen. Auf diese Weise entfernen die gesamte Länge des Darmsegments und Verwerfen der Muskelschicht.
- Finden Sie einen Ausgangspunkt an dem mehr proximalen Ende des Gewebes, wo es eine sichtbare Klappe des Muskels ist. Ziehen Sie eine kleine Menge der Muskelschicht den ganzen Weg um den Darm entfernt.
- Schneiden Sie den Darm offen längs und Wäsche in einem sauberen Petrischale mit frischen, gekühlten PBS wirbeln. Bei Bedarf wiederholen alle verbleibenden Speisebrei oder Schleim zu entfernen.
- Mince Gewebe mit einem chirurgischen Skalpell zu erreichen Quadrate ~ 1-2 mm 2 und fügen diese zu ~ 20 ml gekühlte PBS in einem 50-ml - Zentrifugenröhrchen mit einer Pasteurpipette. Zur Vermeidung von Gewebestücken an der Pipette haften, abgeschnitten der Spitze und benetzen die Pipette durch Verreiben mit PBS.
- Vorsichtig schütteln das Rohr weitere Stücke um das Gewebe zu waschen. Lassen Sie das Gewebe besiedeln und gießen oder pipette die Mehrheit der PBS ab und wiederholen Sie mit frischem PBS, bis die PBS klar aussieht.
4. Herstellung von BBM-beschichteten Platte / Geschirr und Digestionsmedium
HINWEIS: Die folgenden Schritte sollten in einer Gewebekulturhaube durchgeführt werden (mit Inkubationsschritte in 37 ° C-Wasserbad).
- Vorbereiten einer 2% Lösung in gekühltes BMM DMEM (ohne Zusätze). Während der Arbeit, halten Sie die Lösung auf Eis. Für eine 2% ige Lösung, 140 & mgr; l aufgetaut fügt BMM auf 7 ml DMEM (genug , um eine einzige 24-Well - Platte herzustellen).
- Nach Eintragen von 250 & mgr; l 2% BMM-Lösung pro Well (24-Well-Platte) oder pro Glasboden Abbildungs Schal.
- mindestens 30 min in einem Inkubator bei 37 ° C inkubieren beschichteten Platten / Geschirr für für eine ausreichende Polymerisation des BMM zu ermöglichen.
- Fügen Sie den 50 ml vorgewärmten DMEM (ohne Zusätze) zu dem 15 mg Kollagenase (aus den Schritten 1.2 und 1.4) , um eine 0,3 mg / ml - Lösung zu bilden und invertieren aufzulösen.
- Aufce vollständig gelöst, eine 20 ml-Spritze, filtern die Kollagenase-Lösung durch einen 0,2 um Sterilfilter in ein neues steriles 50 ml-Zentrifugenröhrchen. Beschriften Sie diese als Digestionsmedium.
5. Gewebeverdauungs
- Entfernen Sie die Gewebestücke aus dem PBS 10 ml serologische Pipette und fügen in ein steriles 50-ml - Zentrifugenröhrchen gekühltes steriles DMEM , das (ohne Zusätze), Wirbel und dann DMEM entfernen.
HINWEIS: Zur Vermeidung von Gewebe an der serologischen Pipette kleben, nass ist es durch Verreiben mit DMEM, bevor sie mit dem Gewebe in Kontakt zu treten. - ‚Digest‘ 1 und 2: Entfernung von Zelltrümmern und Einzelzellen
- In 7 ml Digestionsmedium auf die Gewebestücke und gibt einen Wirbel der Röhre.
- Inkubieren Sie für 5 min in einem Wasserbad bei 37 ° C.
- Sachte schütteln das Rohr für ~ 3 s (nicht wirbeln).
- Lassen Sie das Gewebe besiedeln und das Digestionsmedium zu verwerfen, eine Reservierungkleines Volumen an unter dem Mikroskop zu betrachten.
HINWEIS: Vor allem, wenn ausgehend, ist es sehr empfehlenswert, ein kleines Volumen jedes ‚verdauen‘ (~ 30 ul) unter dem Mikroskop zu untersuchen den Fortschritt des Verdauungsprozesses zu messen. Wenn viele Krypten in diesem Stadium beobachtet werden, kann das Rütteln zu heftig sein. Für repräsentative Bilder von dem, was die verschiedenen ‚verdauen‘ Stufen typischerweise aussehen, siehe Abbildung 1. - Wiederholen Sie die Schritte 5.2.-5.2.4 (mit frischem Digestionsmedium).
- ‚Digests‘ 3 bis 5: Sammlung von Krypta - Fragmenten
- In 7 ml Digestionsmedium zum Gewebe.
- bei 37 ° C für 10 min inkubieren.
- Während der Inkubation schütteln alle 5 min für 10-12 s.
HINWEIS: Das Rütteln ist kräftiger als das Schütteln für ‚verdaut‘ 1 und 2.
- Während der Inkubation schütteln alle 5 min für 10-12 s.
- Erlauben unverdaute Gewebe zu besiedeln und die Digestionsmedium in einem 15 ml-Zentrifugenröhrchen zu sammeln. ObGewebe wird versehentlich zusammen mit dem Medium gesammelt, lassen es zu, Entfernen einer serologischen 10 ml-Pipette und übertragen sie zurück in die 50-ml-Zentrifugenröhrchen das unverdaute Gewebe enthält.
- Zentrifuge gesammelt Medium / Überstand bei RT für 3 min bei 100 x g.
- Überstand verwerfen und resuspendiere das Zellpellet in 5 ml vorgewärmtes Kulturmedium durch vorsichtiges Zerreiben und beiseite gestellt.
- Inspizieren ein kleines Volumen der Zellsuspension unter dem Mikroskop (siehe Anmerkung aus Schritt 5.2.4).
HINWEIS: Idealerweise beginnen Krypta-Fragmente in ‚verdaut‘ 3 zusammen mit Zelltrümmern und einzelnen Zellen zu erscheinen. ‚Digests‘ 4 und 5 enthalten , eine signifikant größere Anzahl von Krypta - Fragmenten mit reduzierter Zelldebris (Abbildung 1). Intensität einstellen wie erforderlich Schütteln dh , wenn das Gewebe nicht verdaut und Krypta - Fragment nicht angezeigt werden, stärker schütteln. - Wiederholen Sie die Schritte 5.3.1-5.3.6 bis 5 ‚verdaut‘ gewesenabgeschlossen oder bis der größte Teil des Gewebes hat (a 6. verdauen kann erforderlich sein) verdaut worden.
- Wenn alle Überstände von ‚Digests‘ 3-5 (oder 3-6) wurden gesammelt, die Zentrifuge verdauen Überstand bei RT für 3 min bei 100 x g.
- Zum Sekretion Experimenten, vereinige die Überstände von ‚Digests‘ 3-5 (oder 3-6) vor der Zentrifugation.
HINWEIS: Weniger Gewebe für die Bildgebung Experimente benötigt wird, also den Digest Überstand wählen, das die sauberste (Fehlen von Zelltrümmern und Einzelzellen) mit der größeren Anzahl der Krypta Fragmente ist. Dies ist in der Regel ‚verdauen‘ 4 oder 5. - Überstand verwerfen und sanft resuspendieren Sie das Pellet durch Verreiben, bis keine Klumpen sichtbar sind. Resuspendieren des Pellets in vorgewärmtem Kulturmedium mit 10 & mgr; M Y-27632 - Dihydrochlorid ergänzt (zur Verhinderung anoikis 17). Verwenden 5 ml für die Sekretion Experimente und 2 ml Kulturmedium für die Bildgebung Experimente.
- FilterZellsuspension durch ein 100-um-Filter (jede unverdaute Gewebe zu entfernen). Führen Sie eine weitere 2 ml vorgewärmtes Kulturmedium durch den Filter zu waschen (Gesamtvolumen: 7 ml und 4 ml für die Sekretion und Bildgebung, respectively).
HINWEIS: Die Filterung ist nicht wesentlich, jedoch größere Gewebestücke neigen dazu, nicht auf die Platte / Geschirr zu halten.
Abbildung 1: repräsentative Bilder von ‚Digests‘ von primären Dünndarms Kulturverfahren. (A) Typisches Material aus ‚Digests‘ 1 und 2 , das im Wesentlichen Einzelzellen und Zelltrümmer. (B) Ein Beispiel für Produkte von ‚verdauen‘ 3. Die schwarzen Pfeile zeigen Krypta - Fragmente in dem Material verdauen erscheinen. (C) Typisch für ‚verdauen‘ 4 oder 5 ist Panel (D) gepoolte Material verdauen darstellt aus‚Digests‘ 3-5 durch einen 100 - um - Filter geleitet , um die größeren unerwünschten Gewebefragmente zu entfernen , in (C) zu sehen. Alle Bilder wurden unter Verwendung eines digitalen inverses Mikroskop mit einem 20x-Objektiv genommen. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
6. Plating Intestinal Cultures (angereichertes für Kryptenzellen)
- Entfernen überschüssige BMM-Lösung von der Platte oder Geschirr, und fügt auch 250 & mgr; l vorgewärmtes Kulturmedium pro Sekretion.
HINWEIS: Imaging Schalen werden ohne Medium belassen, so zum nächsten Schritt schreiten schnell den Schal vor dem Austrocknen zu verhindern. - Platte 250 & mgr; l Zellsuspension pro Well (24-Well - Platte) oder pro Glasbodenschale.
- Platte tropfenweise in einer langsamen ‚Zick-Zack‘ Bewegung über die Brunnen. Allow Krypta-Fragmente für ~ 5 min absetzen, bevor die Platte zu bewegen the Inkubator.
Hinweis: Dies sollte eine gleichmäßige Verteilung der Krypten / Zellen innerhalb des Schachtes fördern.
- Platte tropfenweise in einer langsamen ‚Zick-Zack‘ Bewegung über die Brunnen. Allow Krypta-Fragmente für ~ 5 min absetzen, bevor die Platte zu bewegen the Inkubator.
- Inkubieren Platte oder Teller über Nacht bei 37 ° C und 5% CO 2.
ANMERKUNG: Ein ‚flächendeckend‘ einschichtig sollte gebildet haben. Für ein repräsentatives Bild von Kulturen folgenden drei Wäschen, siehe 2A. - ‚Hochwasser‘ Bildgebungsschalen mit 2 ml vorgewärmtem Kulturmedium pro Schale.
HINWEIS: Diese Gerichte werden für die Bildgebung geeignet für bis zu ~ 72 h Plattierung folgen. Kolon-Kulturen dauern in der Regel länger, bis zu 7 Tage. Zellen, die nicht eingehalten haben, können durch einen Waschschritt entfernt werden. Primärkulturen sind nun bereit für Experimente verwendet werden.
Representative Results
Die Verwendung von serieller Verdauung Schritten ermöglicht die Sammlung von einer relativ sauberen Herstellung von Krypta-Fragmenten für Experimente überzogen werden. Die ersten beiden Digests Entfernen hauptsächlich Einzelzellen und Zelltrümmer aus dem Aufschlußmaterial (1A). Während des dritten digest erscheinen Krypta - Fragmente in dem aufgeschlossenen Material (1B). Digests 4 und 5 ergab eine größere Anzahl von Krypta - Fragmenten mit weniger einzelnen Zellen (1C). Filtern des gepoolten Materials von Digests 3-5 größere Stücke von unverdauten Gewebe entfernt, was zu der Kultur nachteilig sein kann, die Herstellung einer sauberen Krypta Fragment Zubereitung (1D).
Folgende 18-24 h der Kultur, Monoschichten von Primärzellen des Dünndarms beobachtet (2A). Unter Verwendung von transgenen Mäusen erzeugt Kulturen spezifisch die cal exprimierendenCium Fluoreszenzsensor, GCaMP3, unter der Kontrolle des Promotors Proglucagon 11 sind L - Zellen leicht erkennbar und durchsetzt in der Kultur (2B). In primären Kulturen Dünndarms, Verbindungen , die die G q -Ca 2+ Targeting i und cAMP i -abhängigen Wege die Sekretion von GLP-1 (für die Sekretion Experiment Methodik siehe Reimann et al. 1) stimuliert. Bombesin (BBS, 100 nM) und Co-Applikation von Forskolin und 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX) (F / I, 10 & mgr; M jeweils) lösten eine 2- und 11-fach, Stimulation von GLP-1-Freisetzung im Verhältnis zu basalen bzw. (2C). Spezifische L-Zellexpression von GCaMP3 ermöglicht die Identifizierung von und Echtzeit-Überwachung der Calciummobilisierung in einzelnen L-Zellen. Sowohl 100 nM Bombesin (BBS) und 30 mM Kaliumchlorid (KCl) stimuliert vorübergehende Anstiege des intrazellulären Calciums , welches die bekannten G q </ sub> - und elektrogen gekoppelter Pfade in primären L - Zellen (2D).
Abbildung 2: Repräsentative Daten aus primären Dünndarms Kulturen abgeleitet. Beispiel Bilder aus gemischten primären Dünndarms Kulturen verwendet für (A) Sekretion und (B) Bildgebung Experimente Stütze 24 h Plattierung. (A) Bild von einer 24-Well - Platte entnommen, ein digitales inverses Mikroskop mit einem 4X - Ziel verwendet wird . Maßstabsbalken = 500 & mgr; m. (B) Unter Verwendung von GLU-Cre x ROSA26 GCamP3 Mäuse - L - Zellen in dem Sichtfeld (grüner Zellen) wurden durch die Fluoreszenz von GCaMP3 identifiziert. Maßstabsbalken entspricht 50 & mgr; m. (C) GLP-1 - Sekretion wurde in Reaktion gemessen Bombesin (BBS, 100 nM) und Forskolin / 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX) (F / I, 10 & mgr; M jeweils). Prozentsatz GLP-1-Sekretion wurde berechnet,durch GLP-1-Spiegel in den Überständen und Zelllysaten gemessen. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM von n = 3 für jede Bedingung. (D) GCaMP3 Fluoreszenz (Reflexions cytosolische Calcium) der beiden Zellen in (B) dargelegt und in Echtzeit in Reaktion auf Kaliumchlorid überwacht (KCl, 30 mM) und BBS (100 nM). Einzelzellen-Bildgebung wurde mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop mit einem 40X Ölimmersionsobjektiv durchgeführt. GCaMP3 wurde bei 475/10 nm angeregt wird, eine 75-W-Xenon-Bogenlampe und einen Monochromator durch Fluoreszenz-Imaging-Software gesteuert. Emission wurde mit einer hochauflösenden digitalen charge-coupled device (CCD) Kamera aufgenommen einen dichroitischen Spiegel und ein 510-560 nm Bandfilter verwendet wird. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultur von gemischten murine Dünndarmzellen die Untersuchung von Darmpeptid Sekretion und Einzelzellen-Bildgebung von markierten enteroendokrinen Zellen zu ermöglichen.
Um die Wahrscheinlichkeit der kleinen intestinalen Kulturen, erfolgreich zu erhöhen, ist es wichtig, dass das Protokoll so schnell wie möglich durchgeführt wird (idealerweise innerhalb von 3 h der Gewebeernte), und dass das Gewebe wird in eiskaltem Medium gehalten oder Puffer vor auf die Verdauung, den Zelltod zu begrenzen. Zwar ist es nicht unbedingt notwendig, vor allem für Kolon-Kulturen ist, die Entfernung von der Muskelschicht aus dem Dünndarm wird stark gefördert. Das kleine Darm-Kultur-Protokoll wird so weit wie möglich standardisiert. Allerdings ist es wichtig, dass kein Verdauungsprozess ist identisch zu beachten. Es gibt viele Schritte in diesem Protokoll wo Variabilität kann zum Beispiel des Grades des Muskelabbaus, die Größe von t an einem Tag zu Tag eingeführt werdener Gewebestücke ‚gehackt‘, um die Stärke des Schüttelns, um die Wirksamkeit einer bestimmten Charge von Kollagenase etc. Es ist daher von größter Bedeutung, Teilmengen von jedem der verschiedenen ‚verdaut‘ unter dem Mikroskop zu untersuchen den Fortschritt der Verdauung und Schneider das Schütteln und die Zahl der ‚Digests‘ entsprechend zu bewerten. Es wird empfohlen, mehr sanft zu schütteln und zu beginnen, wenn Krypta Fragmente aus nicht offensichtlich sind ‚verdauen‘ 3 ab, zu beginnen mehr heftiges Schütteln.
Aus unserer Erfahrung nicht in Kultur enteroendokrinen Zellen vermehren sich und werden in der Regel von kleinen Darm Kulturen innerhalb von 4 Tagen verloren. Dennoch ermöglicht diese genügend Zeit gut Peptid-Sekretion Experimente (in der Regel mehr als 2 h, 18-24 h nach Plattieren) auszuführen physiologischen Stimuli und / oder pharmakologische Mittel zu testen. Versuche vor dem Experiment Sekretion einer Inkubation über Nacht erfordern , sind auch denkbar , zum Beispielim Fall der Vorbehandlung mit Pertussistoxin 15.
Die primäre Kulturtechnik präsentiert hier ist ein gut etabliertes Verfahren, wie durch das Volumen der Forschungsergebnisse belegen sie im Laufe der Jahre hervorgebracht hat. Das primäre Kulturmodell wird verwendet, um die Sekretion einer Vielzahl von gut Peptide zu untersuchen, einschließlich GLP-1 1, GIP 18 und PYY 19, in Reaktion auf diverse Nährstoff- und nicht-Nährstoff 14, 20 Stimuli und Inhibitoren. Darüber hinaus hat die gleiche Technik , 21 zu der Kultur von menschlichen Darmzellen erfolgreich eingesetzt worden. Oft wird eine Kombination aus dem primären Zellkultur - Verfahren zusammen mit einem zusätzlichen experimentellen Modell zB. ex vivo oder in vivo können die meisten Einblick 6 liefern. Insbesondere und im Gegensatz zu anderen Methoden, diese Technik hat important Anwendungen, die über die Messung von Darmpeptidfreisetzung. Wir haben gezeigt , dass primäre Kulturen aus Dünndarm - transgenen Mäusen reporter leistungsfähige Werkzeuge gekoppelt , um die Abfrage von intrazellulären Signalwege sind abgeleitetes Peptid - Sekretion darm, beispielsweise unter Verwendung der Ca 2+ und cAMP - Sensoren, GCaMP3 11, 13 und 14 Epac2camps jeweils sowie elektrophysiologische Techniken 12.
Wie bei allen in vitro - Modellen, die primären intestinalen Kulturen bestimmte inhärente Beschränkungen einschließlich dem Verlust der Polarität der Epithelzellen in Kultur, sowie der Verlust der Blutversorgung und Innervation. Es ist schwierig, die potenziellen Auswirkungen dieser künstlichen Bedingungen auf enteroendokrinen Zellfunktion zu schätzen. Doch aus Primärkulturen gewonnenen Daten oft übersetzbar waren in dem in vivo setting (zB Wirkungen von kurzkettigen Fettsäuren auf die GLP-1 - Sekretion 15).
Die primären Darm-Kulturen sind eine vielseitige Technik mit vielen Anwendungsmöglichkeiten. Sie haben bereits wichtige mechanistische Einblicke in die Regulation des Darms Peptid Sekretion zur Verfügung gestellt.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
GLP-1-Immunoassays wurde von dem Core Biochemische Assay Laboratory am Addenbrooke Hospital durchgeführt.
Diese Arbeit hat, im Laufe der Jahre durch den Wellcome Trust (derzeit aktiv Zuschüsse 106262 / Z / 14 / Z und 106263 / Z / 14 / Z) und das Medical Research Council (MRC) (Zuschüsse MRC_MC_UU_12012 / 3 und MRC_MC_UU_12012 unterstützt / 5).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Costar | 3524 | For secretion experiments |
| Bombesin | Sigma-Aldrich | B4272 | Positive control (calcium imaging experiment) |
| Centrifuge tubes, 15 mL, sterile | Greiner bio-one | 188261 | For tissue preperation/digestion |
| Centrifuge tubes, 50 mL, sterile | Corning | 430828 | For tissue preperation/ digestion |
| Collagenase XI (Crude) | Sigma-Aldrich | C9407 | For making up digestion medium |
| Dichroic mirror | Cairn Research | - | For imaging experiments |
| DMEM High glucose (4500 mg) | Sigma-Aldrich | D6546 | For dissolving matrigel (keep at 4 °C). For making up digestion medium, pre-warm to 37 °C. |
| Emission Filter (Bandwidth 510-560 nm) | Cairn Research | - | For imaging experiments |
| Foetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | For making up culture medium |
| Forceps/Tweezers | Agar Scientific | AGT520 | For dissection/removal of intestine |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 | Positive control (secretion experiment) |
| Glass-bottomed dishes (35 mm) | MatTek | P35G-0-14-C | For imaging experiments |
| High precision tweezer (110 mm) | IDEAL-TEK | 3480641 (5 SA) | For removing muscle layer |
| High resolution digital CCD camera | Hamamatsu | ORCA-ER | For imaging experiments |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | Positive control (secretion experiment) |
| L-15 Medium (Leibovitz) | Sigma-Aldrich | L1518 | For collecting tissue, keep on ice |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | For making up culture medium |
| Matrigel | Corning | 354234 | Basement Membrane Matrix, for coating plates and dishes |
| MetaFluor | Molecular Devices (supplied by Cairn Research) | - | Fluorescence ratio imaging software |
| Mice (C57BL6) | Charles River Laboratories | C57BL/6J | Background mice used for breeding. Can also be used for secretion experiments |
| Mice (GLU-cre x ROSA26 GCaMP3) | in house | - | For calcium imaging and secretion experiments |
| Microscope (EVOS XL Core) | Thermo Fisher Scientific | AMEX1000 | For photomicrographs of cultures |
| Microscope | Olympus | IX71 | Inverted microscope with 40X oil objective used for imaging experiments |
| Monochromator | Cairn Research | - | For imaging experiments |
| Pasteur pipettes | Alpha Laboratories | LW4234 | For cleaning tissue |
| PBS containing Ca2+ and Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8662 | For washing tissue, keep on ice |
| Penicillin & Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | For making up culture medium |
| Petri dishes (100 mm x 20 mm) | Corning | CLS430167 | For cleaning tissue and removing muscle layer |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P/4280/53 | Positive control (calcium imaging experiment) |
| Scissors | Agar Scientific | AGT554 | For dissection/removal of intestine |
| Sterile cell strainer 100 µm | Fisher Scientific | 22363549 | For filtering crypt cell suspension prior to plating |
| Surgical scalpel blade No.22 (sterile, stainless) | Swann Morton | 0308 | For dicing tissue |
| Syringe filters, Minisart NML (0.2 µm pore size) | Sartorius | 16534-K | For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium) |
| Syringes, 20 mL, disposable, sterile, Luer slip | BD | 300613 | For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium) |
| Xenon arc lamp 75W | Cairn Research | - | For imaging experiments |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | ROCK inhibitor, prepare 10 mM stock solution in sterile water (use 1:1,000 in final culture medium) |
References
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