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Neuroscience

Bewertung der Hippocampalen Dendritischen Komplexität bei gealterten Mäusen unter Verwendung der Golgi-Cox-Methode

Published: June 22, 2017 doi: 10.3791/55696
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2, 1,2,3
1Division of Radiation Health, University of Arkansas for Medical Sciences, 2Department of Pharmaceutical Sciences, University of Arkansas for Medical Sciences, 3Neurobiology & Developmental Sciences, University of Arkansas for Medical Sciences

Summary

Hier stellen wir ein Golgi-Cox-Protokoll ausführlich vor. Diese zuverlässige Gewebe-Fleck-Methode ermöglicht eine qualitativ hochwertige Beurteilung der Cytoarchitektur im Hippocampus und im gesamten Gehirn mit minimaler Fehlersuche.

Abstract

Dendritische Stacheln sind die Ausstülpungen aus den neuronalen dendritischen Schächten, die exzitatorische Synapsen enthalten. Die morphologischen und verzweigten Variationen der neuronalen Dendriten innerhalb des Hippocampus sind in die Erkenntnis- und Gedächtnisbildung verwickelt. Es gibt mehrere Ansätze zur Golgi-Färbung, die alle für die Bestimmung der morphologischen Eigenschaften der dendritischen Lauben nützlich waren und einen klaren Hintergrund hervorbringen. Die vorliegende Golgi-Cox-Methode (eine leichte Variation des Protokolls, die mit einem kommerziellen Golgi-Färbe-Kit versehen ist) wurde entworfen, um zu beurteilen, wie eine relativ niedrige Dosis des chemotherapeutischen Arzneimittels 5-Flurouracil (5-Fu) die dendritische Morphologie beeinflussen würde , Die Anzahl der Stacheln und die Komplexität der Arborisierung im Hippocampus. Die 5-Fu modulierten die dendritische Komplexität signifikant und reduzierten die Wirbelsäulendichte im gesamten Hippocampus regionalspezifisch. Die dargestellten Daten zeigen, dass die Golgi-Färbemethode efDie fälligen Neuronen in der CA1, dem CA3 und dem Dentat Gyrus (DG) des Hippocampus fungiert. Dieses Protokoll berichtet die Details für jeden Schritt, so dass andere Forscher können zuverlässig Flecken Gewebe im gesamten Gehirn mit qualitativ hochwertigen Ergebnissen und minimale Fehlersuche.

Introduction

Dendriten sind der größte Teil der Neuronen, die den präsynaptischen Eingang empfangen und verarbeiten 1 . Ihre dendritischen Prozesse haben eine komplexe Geometrie, wo die proximalen Zweige einen größeren Durchmesser haben als die distalen Zweige. Da Dendriten sich entwickeln, bilden sie mehrere Verbindungen mit anderen Neuronen in einem Prozess, der als dendritische Arborisierung bezeichnet wird. Das Ausmaß und Muster dieser Verzweigung bestimmt die Menge der synaptischen Eingaben, die ein Dendrit adäquat verarbeiten kann 2 .

Dendritische Arborisierung ist ein notwendiger Prozess für die aktivitätsabhängige Plastizität und die richtige Entwicklung von neuronalen Schaltungen. Extension, Retraktion, Verzweigung und Synaptogenese sind komplizierte Prozesse, die intrinsische genetische Programme und Einflüsse aus extrinsischen Faktoren beinhalten. Die morphologischen und verzweigten Variationen der neuronalen Dendriten innerhalb des Hippocampus sind in die Erkenntnis- und Gedächtnisbildung verwickeltF "> 3 , 4. Die Veränderungen der dendritischen Komplexität sind mit pathophysiologischen und Verhaltensänderungen verbunden 5. Anomalien beziehen sich auf mehrere Krankheitszustände, darunter zerbrechliches X-Syndrom und Down-Syndrom 6 .

Dendritische Stacheln sind die spezialisierten subzellulären Kompartimente der dendritischen Dorn, die exzitatorische Eingaben im zentralen Nervensystem erhalten. Es gibt drei morphologische Klassen von dendritischen Stacheln, wobei der Name jeder Klasse auf ihrer Größe und Form basiert: 1) Pilzstacheln, die komplexe postsynaptische Dichten mit mehr Glutamatrezeptoren haben als andere Stacheln 7 ; 2) Stubby Stacheln, denen ein Stamm fehlt; Und 3) dünne Stacheln, die aus einem langwierigen, schmalen Stamm und einem Kugelkopf bestehen 8 . Das dendritische Wirbelsäulenvolumen wird teilweise verwendet, um sie zu definieren, wobei dünne Stacheln im allgemeinen kleiner sind (0,01 μm 3 3 ) 9 , 10 . Die Stacheln stabilisieren sich mit Reifung. Zum Beispiel ziehen sich die dünnen Stacheln nach einigen Tagen zurück oder entwickeln sich zu Pilzstacheln. Alternativ sind die Pilzstacheln relativ stabil und können über einen längeren Zeitraum überleben. Die Stärke der neuronalen Verbindungen beruht auf der Anzahl der Stacheln und / oder deren Volumen 11 , 12 , 13 .

Die klassische Golgi-Färbemethode und ihre moderneren Variationen sind alle für die Untersuchung der dendritischen Wirbelsäulenmorphologie und -dichte nützlich gewesen. Ein einzigartiger Aspekt der Golgi-Färbung ist, dass es zufällig etwa 5% der gesamten Neuronen, die für die Verfolgung der einzelnen Neuronen 14 , 15 erlaubt. Obwohl der genaue Mechanismus, in dem die Golgi MethOd stains einzelne Neuronen ist noch unbekannt, das Prinzip des Verfahrens basiert auf der Kristallisation von Silberchromat (Ag 2 CrO 4 ) 16 , 17 . Es gibt drei Haupttypen der Golgi-Methode: den schnellen Golgi, den Golgi-Cox und den Golgi-Kopsch 18 , 19 . Alle drei Methoden beginnen mit einer anfänglichen Inkubationsphase in Chromsalzen für mehrere Tage bis Monate, aber es gibt bestimmte wichtige Unterschiede zwischen ihnen. Der schnelle Golgi nutzt Osmiumtetroxid im ersten Schritt, während der Golgi-Kopsch Paraformaldehyd enthält. Die Färbung sowohl im Rapid-Golgi als auch im Golgi-Kopsch folgt eine Inkubation in einer 1-2% Silbernitratlösung für etwa 7 Tage. Die Golgi-Cox-Methode verwendet Quecksilberchlorid und Kaliumdichromat anstelle von Silbernitrat und hat eine Imprägnierungszeit von 2-4 Wochen. Die Gewebe werden dann geschnitten und schnell in ein verdünntes Ammoniak gegebenLösung, gefolgt von einem fotografischen Fixierer, um Salze zu entfernen. Von den drei Typen wird die Golgi-Cox-Methode als am besten angesehen, um die dendritischen Dorn ohne große Hintergrundinterferenz zu färben, zum Teil weil die Kristallartefakte nicht auf der Oberfläche des Gewebes auftreten (anders als bei der schnellen Golgi-Methode) 17 , 20 , 21 .

Die vorliegende Methode ist eine leichte Variation des Protokolls, das mit einem kommerziellen Golgi-Färbe-Kit versehen ist, und wurde entworfen, um zu beurteilen, wie eine relativ niedrige Dosis des 5-Fu die dendritischen morphologischen Eigenschaften und die Wirbelsäuredichte beeinflussen würde. Alle gewonnenen Daten könnten einen weiteren Einblick geben, wie sich die chemotherapeutische Behandlung auf die neuronale Schaltung auswirkt.

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Protocol

Experimente wurden in Übereinstimmung mit den ethischen Standards durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee bei UAMS genehmigt wurden.

1. Tiere und 5-Fu Einspritzung Paradigma

  1. Kaufen Sie 6 Monate alte männliche C57Bl6 / J Wildtyp Mäuse und beherbergen sie unter einem konstanten 12 h Licht / Dunkel Zyklus bis sie 1 Jahr alt sind.
  2. Verdünnen Sie die 5-Fu in 0,9% steriler Kochsalzlösung. Verwenden Sie 60 mg / kg als benötigte Dosis pro Maus.
  3. Geben Sie die intraperitonealen Injektionen der 5-Fu (einmal pro Woche für drei Wochen).
    1. Geben Sie die intraperitonealen Injektionen um die gleiche Zeit an jedem Tag. Zum Beispiel zwischen 0900-1200 h.
  4. Euthanisieren Sie die Tiere und extrahieren Sie die Gehirne 30 Tage nach der letzten Injektion.

2. Euthanasie-Verfahren und Hirn-Extraktion

  1. Das Nagetier zurückhalten und die Schwanzbasis greifen Mit der anderen Hand, legen Sie den Daumen oder den ersten Finger auf thE Grund des Nagetieres. Schnell den Druck auf den Nagetier stellen und nach vorne drücken, während die andere Hand, die den Schwanz hält, nach hinten zieht.
  2. Halten Sie das Nagetier mit einer Hand und die große chirurgische Schere mit dem anderen. Setzen Sie den Nagetier Hals zwischen die beiden Klingen und schnell enthaupten den Kopf.
  3. Nimm den abgetrennten Mauskopf und benutze die feine Schere, um das Fell über dem Schädel zu schneiden, bis zu den Augen. Als nächstes legen Sie die Spitzen der Schere in jede Augenhöhle und schließen Sie die Schere mit leichter Kraft.
  4. Verwenden Sie die Frühjahrsschere, um den Schädel nach links und rechts vom Kleinhirn zu schneiden.
  5. Verwenden Sie Pinzette, um den Teil des Schädels, der das Kleinhirn umgibt, direkt auf und ab zu heben.
  6. Benutze die Frühlingsschere, um die midsagittale Linie des Schädels zu schneiden.
  7. Benutze die Pinzette, um den restlichen Teil des Schädels vom Gehirn zu heben.
  8. Verwenden Sie einen Spatel und eine Sonde, um das Gehirn in den gewünschten Behälter zu schöpfen. Mit rostfreiem sTeel Klinge, schneiden Sie jedes Gehirn entlang der midsagittalen Ebene. Führen Sie die folgenden Golgi-Cox-Methode auf den rechten Halbkugeln durch.

3. Golgi-Färbung und Gewebevorbereitung

  1. Tauchen Sie die frisch geernteten Halbhirne in eine 5-ml-Quecksilberchlorid-basierte Lösung (Lösung A aus dem Kit) in ein 10 ml konisches Röhrchen ein. Die Quecksilberchloridlösung ist lichtempfindlich; Den Schlauch mit Folie bedecken. Die Probe im Raum bei Raumtemperatur aufbewahren.
    HINWEIS: Die Lösung A ist im Kit enthalten, das in der Werkstoffliste aufgeführt ist. Vorsicht! Lösung A (auch Quecksilberchloridlösung genannt) enthält toxische Reagenzien wie Kaliumdichromat, Quecksilberchlorid und Kaliumchromat. Schutzhandschuhe tragen und in einer Dunstabzugshaube arbeiten.
  2. Nach 1 Tag langsam dekantieren die Lösung in einen temporären Container (wie ein großes Wägeboot), und entsorgen Sie es in einem biohazard Abfallbehälter. Tauchen Sie die Gehirne (noch in den ursprünglichen 10 ml konischen Röhrchen) mit 5 mlDie Quecksilberchloridlösung, und die Probe bei Raumtemperatur für 13 weitere Tage zur Dunkelheit zurückkehren.
  3. Füge 30 g Nachimprägnierungspuffer zu 90 ml destilliertem oder deionisiertem Wasser (dH 2 O) hinzu. Füllen Sie jede Vertiefung einer 6-Well-Platte mit 6,5 ml des Nachimprägnierungspuffers, einer gut pro Gehirn
    HINWEIS: Der Nachimprägnierungspuffer ist im Kit enthalten, der in der Materialliste aufgeführt ist.
    1. Nach 14 Tagen (insgesamt) in der Quecksilberchloridlösung das Gewebe mit dH 2 O ausspülen und dann mit Nachimprägnierungspuffer in 6-Well-Platten überführen. Die Platten mit Folie bedecken und bei Raumtemperatur im Dunkeln aufbewahren.
  4. Den Nachimprägnierungspuffer nach 1 Tag Eintauchen ausspülen und mit frischem Nachimprägnierungspuffer erneuern; 1 Tag im Dunkeln bei Raumtemperatur aufbewahren. Falls erforderlich, bei 4 ° C bis zu 1 Monat 22 lagern.

4. Schnitt

  1. Etikettieren Sie die 12-Well-Platten auf ihren Deckeln mit Zahlen in aufsteigender Reihenfolge von links nach rechts und up-to-down.
  2. Bereiten Sie zwei oder drei 12-Well-Platten pro Gehirn vor, wenn Sie das gesamte Gehirn schneiden.
    1. Beschriften Sie die Oberseite jedes 12-Well-Plattendeckels mit der Identifikationsnummer des Gehirns.
    2. Pipette 2 ml von 1x PBS in jede Vertiefung jeder Platte.
  3. Richten Sie die Bühne ein und schalten Sie das Vibratom ein. Sicherstellen, dass genügend 1x PBS im Behälter vorhanden ist, um das Gewebe zu bedecken.
    1. Schneiden Sie zwei Stücke von Plastik-Paraffin-Film und falten Sie sie über zweimal. Legen Sie sie über die Löcher für die Probenhalterknöpfe, um zu verhindern, dass 1x PBS auf den Zähler austritt.
    2. Legen Sie das Band auf den Gewebeblock des Probenhalters und legen Sie dann Cyanacrylat-Klebstoff (siehe Materialtabelle) darauf ein.
  4. Entfernen Sie das Gehirn aus der 6-Well-Platte und legen Sie es auf eine Plastik- oder Glasschale. Verwenden Sie den rostfreienStahl-Doppelklinge, um etwa die Hälfte des Kleinhirns abzuschneiden.
    1. Schneiden Sie den Kleinhirn kaudal. Vergewissern Sie sich, dass der noch verbleibende Teil des Zerebellums gerade ist.
  5. Sofort die flache Oberfläche des verbleibenden Kleinhirns auf den Leim legen.
    HINWEIS: Der dorsale Teil des Gewebes (der Hirnrinde) sollte gegenüber der Klinge nach links oder rechts liegen Das rostrale Ende, das zuvor die beigefügte olfaktorische Glühbirne enthielt, sollte nach oben zeigen.
    1. Warten Sie mindestens ein paar Minuten, um sicherzustellen, dass der Leim voll trocknet.
  6. Während der Leim, der das Gehirn an Ort und Stelle hält, trocknet, gießt 1x PBS in das Probenbad. Nachdem der Kleber trocken ist, legen Sie den Probenhalter mit dem Gewebe in das Probenbad.
    1. Wenn die Gewebeprobe nicht vollständig bedeckt ist, gießen Sie mehr 1x PBS in das Probenbad.
  7. Befestigen Sie die Klinge am Klingenhalter des Vibratoms und langsam lDie Klinge in das Probenbad schieben, bis sie vollständig in 1x PBS untergetaucht ist. Setzen Sie die Klinge fort, bis sie etwas unter der Oberseite des Gewebes liegt.
  8. Setzen Sie die Vibrationsgeschwindigkeit auf 7, die Amplitude auf 6 und den Schneidwinkel auf 12 ° (siehe Tabelle der Materialien für Vibratom-Modell). Starten Sie die Vibration und schneiden Sie 200 μm Abschnitte 23 .
    1. Verwenden Sie einen großen Pinsel, um die Gewebeabschnitte aus dem Probenbad in jede ausgewiesene Vertiefung der 12-Well-Platten zu bewegen.
  9. Weiter, um das Gewebe zu schneiden, bis die gewünschte Anzahl von Gewebeschnitten erreicht ist.

5. Nachfärbung

  1. Für jede der folgenden Färbungsschritte und Spülungen 2 ml der angegebenen Lösung pro Vertiefung verwenden. Verwenden Sie einen motorisierten Pipettenfüller (siehe Materialtabelle), um die Lösungen in die Vertiefungen zu übertragen. Verwenden Sie eine Transferpipette (siehe Materialtabelle), um Lösungen aus den Brunnen und in den richtigen Abfall zu transportierenBehälter.
  2. Spülen Sie die Sektionen in einer 30 min Waschung von 0,01 M PBS-T (fügen Sie 3,0 ml Waschmittel (siehe Tabelle der Materialien) auf 1.000 mL 0,01 M PBS).
  3. Verdünnung der Ammoniumhydroxidlösung (Achtung) 3: 5 nach Volumen mit dH 2 O unmittelbar vor Gebrauch. Färben Sie die Abschnitte in der verdünnten Ammoniumhydroxidlösung für 19-21 min.
    1. Schützen Sie die lichtempfindliche Ammoniumhydroxidlösung mit Folie.
      HINWEIS: Ammoniumhydroxid in Lösung hat eine Konzentration von ~ 10% und wird als "gefährlich" eingestuft. Ammoniumhydroxidlösung kann Verbrennungen hervorrufen, wenn sie die Haut berühren. Bei Atemstillstand kann es zu Reizungen der Atemwege kommen. Schutzhandschuhe tragen und in einer Dunstabzugshaube arbeiten.
  4. Färben Sie die Abschnitte in den Nachfärbepuffer (fügen Sie 90 g Reagenz D in 500 ml dH 2 O) für 19-21 min hinzu. Der Nachfärbepuffer ist lichtempfindlich; Schütze es mit Folie 22 .
  5. Spülen Sie die Abschnitte in drei, 5-10 min Wäschen von 0,01 M PBS-T.

6. Montage, Reinigung und Abdeckung

  1. Montieren Sie die Abschnitte auf 1% mit Gelatine beschichtete Folien mit dem großen Pinsel. Lassen Sie sie für 20-30 min bei Raumtemperatur trocknen, und legen Sie sie dann über Nacht in ein Coplin-Glas.
  2. Entfernen Sie die Folien mit Handschuhen aus dem Coplin-Gefäß und legen Sie sie in ein Plastikgestell (siehe Materialtabelle). Legen Sie das Plastikgestell in die Färbeplatte (siehe Materialtabelle) mit 100% Ethanol. Dehydrieren Sie sie mit drei 5 min Wäschen.
  3. Die Folien zweimal für jeweils 5 min in 99% Xylol waschen. Legen Sie die Objektträger in ein Glasgestell und senken Sie das Gestell in eine Glasfärbeplatte, die Xylol mit einem Metallgriff enthält (siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: Vorsicht, Xylol ist schädlich bei Einatmen und verursacht Reizungen, wenn es die Haut berührt. Es ist leicht entflammbar in flüssigen und Dampfzuständen. Schutzhandschuhe tragen und in einer Dunstabzugshaube arbeiten.
  4. Entfernen Sie die Folien aus dem XylEne eins zu einer Zeit und schnell decken das Gewebe mit ~ 0,25 mL Montagemedien (siehe Material Tabelle). Als nächstes nehmen Sie die Rutschenabdeckungen und legen sie über die Medien.
    1. Schieben Sie alle eingeschlossenen Luftblasen unter die Schiebeabdeckungen an den Rand mit einem stumpfen Gegenstand, wie das Ende eines Pinsels.
  5. Legen Sie die Objektträger in einen Bereich weg von Sonnenlicht und lassen Sie sie für 2-3 Tage trocknen.
  6. Fahren Sie mit dem Aufnehmen von Bildern mit einem Mikroskop und analysieren Sie mit der entsprechenden Software.

7. Bildstapel erwerben

  1. Öffnen Sie das Imaging-Programm (siehe Materialtabelle ). Legen Sie die Folie auf die Bühne des Mikroskops. Klicken Sie im Menü oben auf dem Programm auf "Akquisition" und dann auf "Livebild".
  2. Stellen Sie das Mikroskop auf 10X. Identifizieren Sie das Neuron der Präferenz und bringen Sie dann den Cursor, der wie ein rotes X erscheint, auf die Mitte des Somas. Klicken Sie mit der linken Maustaste, um den Referenzpunkt zu setzen.
  3. Stellen Sie das Mikroskop auf 40X. Klicken Sie auf "Verschieben" aus dem Menü am oberen Rand des Programms und klicken Sie dann auf "Zum Referenzpunkt".
  4. Beginnen Sie mit dem Erstellen des Bildstapels, indem Sie manuell mit dem feinen Objektiv über dem Gewebe scrollen, bis es etwas unscharf ist.
    1. Klicken Sie auf "Set Top" in der rechten unteren Ecke des Programms unter der Überschrift "Image Acquisition".
    2. Blättern Sie leicht unter das Gewebe, bis es etwas unscharf ist und klicken Sie dann unter "Bildaufnahme" auf "Set Bottom". Klicken Sie anschließend auf "Image Stack erwerben".
  5. Nachdem der Bildstapel erfasst wurde, geben Sie den gewünschten Namen für die Bilddatei in das angezeigte Fenster ein. Speichern als "MBF-Ascii-Datei".
    1. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, wählen Sie den Dateityp als "MBF JPEG2000 Stack-Datei" und klicken Sie dann auf "Speichern".

8. Neuronale Verfolgung

  1. In der toolbaR unter dem Menü, klicken Sie auf das Feld mit dem Titel "Konturname". Wählen Sie "Soma" aus dem Dropdown-Menü.
  2. Manchmal das Soma verfolgen. Dann klicken Sie mit der rechten Maustaste und wählen Sie "Finish Cell Body", wenn die Ablaufverfolgung abgeschlossen ist.
  3. Wählen Sie "AutoNeuron", um einen weiteren Tab mit dem Titel "AutoNeuron Workflow" aufzurufen.
  4. Wählen Sie unter "Konfigurationstyp" die Option "Neu". Setzen Sie die Parameter und klicken Sie dann auf "Next Step", um die Unterposition "Soma Detection" aufzurufen.
    1. Um die Parameter einzustellen, wählen Sie "Hellfeld". Als nächstes klicken Sie unter "Max. Prozessdurchmesser" auf "Messvorgang starten". Mit dem Cursor auf die Basis des Dendrits gehen und den Durchmesser manuell einstellen.
  5. Klicken Sie auf "Ja" im Fenster, das den Benutzer auffordert, das gesamte Bild zu verfolgen. Manchmal das Soma verfolgen. Unclick und dann auf "Next step" klicken, um die Unterposition "Seed Placement" aufzurufen.
  6. Klicken Sie auf "Samen überprüfen"S "und klicken Sie dann auf" Next Step ", um die Unterposition" Neuron Reconstruction "aufzurufen.
  7. Unter "Neuron" klicken Sie auf "Interaktiv". Führen Sie eine interaktive Verfolgung durch, indem Sie der Richtung aus dem Programm der Dendriten folgen und mit der rechten Maustaste klicken, um den hervorgehobenen Bereich des Programms zu vervollständigen. Nach dem Tracing alle Dendriten, klicken Sie auf "Next Step".
  8. Nachdem ein neues Fenster erscheint, speichern Sie die neue Konfiguration mit einem gewünschten Titel. Klicken Sie auf "Speichern".

9. Analyse

  1. Öffnen Sie das Analyseprogramm (siehe Tabelle der Materialien).
  2. Klicken Sie im oberen Menü auf "Datei" und dann auf "Datei öffnen". Wählen Sie die interessante Datei aus.
  3. Wählen Sie unter der Unterkategorie "Sholl-Analyse".
  4. Im Fenster "Sholl-Analyse" den Startradius auf 10 μm einstellen. Klicken Sie unter "Analyse" auf die Felder "Dendrites" und "Branch Orders".
  5. Rechts clIck die neu geöffneten Fenster und klicken Sie auf "Excel Export." Klicken Sie auf "Speichern".
  6. Klicken Sie unter der Analyse auf "Verzweigte Strukturanalysen". Wählen Sie "Alle möglichen Analysen".
  7. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das neu geöffnete Fenster und klicken Sie auf "Excel Export" 24 .

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Representative Results

Die Effekte der 5-Fu-Behandlung auf die dendritische Arborisierung und Komplexität im Hippocampus von Golgi-gefärbten Gehirnabschnitten wurden mit einer handelsüblichen Imaging-Software quantifiziert und verfolgt. Nach der Verfolgung wurden die dendritische Arborisierung, die Wirbelsäulendichte und die Wirbelsäulenmorphologie unter Verwendung der Sholl-Analyse und des dendritischen Komplexitätsindex (DCI) analysiert. Sholl-Analyse ist eine quantitative analytische Methode, die verwendet werden kann, um die dendritische Arbor-Morphologie zu bestimmen 25 . Ausgehend von der soma, Kreise 10 μm voneinander getrennt überlagern die dendritischen Spuren. Die Länge der Dendriten wird durch die Anzahl der Kreise bestimmt, die die Dendriten kreuzen. Die Verzweigungspunktanalyse, eine Methode zur Ermittlung der Komplexität eines dendritischen Ladens, basiert auf der Gesamtzahl und der Reihenfolge der Verzweigungspunkte.

Ein Verzweigungspunkt ist definiert als wenn aZweig spaltet sich in zwei Unterzweige. Die Zweigreihenfolge ist ein Maß für die Komplexität, die auf, wie oft die Zweige sich teilen. Beispielsweise wäre ein Verzweigungspunkt erster Ordnung der ursprüngliche Dendrit, der sich von dem Soma erstreckt, während ein Zweigpunkt zweiter Ordnung der Punkt wäre, an dem der Zweig in zwei Unterzweige teilt. Durch die Betrachtung sowohl der Verzweigungspunkte als auch der Zweigordnung wird die Komplexität des dendritischen Dorns (basierend auf der Anzahl der Verzweigungspunkte) und an welchen Punkten die Verzweigung auftritt (eine kleinere Zweigordnung ist näher an dem Soma, während eine größere Zweigreihenfolge ist Weiter von der soma) bestimmt werden kann. Diese Parameter wurden auf das DCI angewendet. Die CA1 und CA3 wurden in apikale und basale Teile aufgeteilt und unabhängig voneinander analysiert 26 , 27 .

Die Dendriten der CA1- und CA3-Pyramidenneuronen und Granulatneuronen im DG wurden analysiert. Alle Neuronen ausgewählt ausR jede experimentelle Gruppe erfüllte die folgenden Kriterien: 1) die Dendriten hatten eine dunkle und konsistente Golgi-Färbung über ihre gesamte Länge, 2) die Dendriten waren sichtbar in-takt, und 3) jedes Neuron hatte genug Platz zwischen ihnen, um Interferenz während der Analyse zu verhindern 28 Abbildung 1 zeigt ein Neuron, das die oben genannten Kriterien erfüllt. Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. Um die statistischen Unterschiede zwischen den Schein- und den 5-Fu-Gruppen zu bestimmen, wurde ein gepaartes Zwei-tailed- t- test verwendet. Alle statistischen Analysen wurden mit analytischer Software (siehe Tabelle der Materialien) durchgeführt und p <0,5 wurde als signifikant angesehen. Zur Bewertung der Effekte der 5-Fu-Behandlung und des Sholl-Radius wurde eine Varianzanalyse der Varianz (ANOVA) verwendet. Fisher LSD Post-hoc-Tests wurden nach ANOVA nach Bedarf verwendet 29 .

In beiden CA 1 ( t = 7,68, p <0,01, Abbildung 2 A ) und CA3 ( t = 7,54, p <0,01, Abbildung 3 A ) apikale pyramidale Dendriten, eine signifikante Gesamtreduktion der Stacheln nach der 5-Fu-Behandlung. Während die 5-Fu-Behandlung die Basal-Wirbelsäulen-Dichte von CA1 nicht signifikant beeinflusste ( t = 1,79, p = 0,15, Abbildung 2 B ), verringerte sie signifikante CA3-basale pyramidale dendritische Stacheln ( t = 5,57, p <0,05; B ). Darüber hinaus zeigten die Fisher-LSD-post-hoc-Tests eine Abnahme der dendritischen Wölbung der CA1 apikalen pyramidalen Dendriten bei 40-100 μm (Fisher's LSD, p <0,001, Abbildung 2 C ) und 130-160 μm (Fisher's LSD, p < 0,05;Ein ähnliches Phänomen wurde in den CA1 basalen apikalen Dendriten bei 30-60 μm (Fisher's LSD, p <0,001, Abbildung 2 D ) und 70-110 gesehen Μm (Fisher's LSD, p <0,05, Abbildung 2 D ) weg von der Soma 29 .

In Bezug auf die CA3 apikalen pyramidalen Dendriten gab es keinen signifikanten Unterschied in der segmentalen dendritischen Länge nach der 5-Fu-Behandlung im Vergleich zu den mit Kochsalzlösung behandelten Kontrollen ( F (28,87) = 0,91, p = 0,59, Fig. 3 C ). Für die CA3-Basalpyramiden-Dendriten gab es jedoch einen signifikanten Unterschied zwischen der 5-Fu-Behandlung und den mit Kochsalzlösung behandelten Kontrollen in der segmentalen dendritischen Länge ( F (25, 78) =1,85; P <0,05; Abbildung 3 D ). Die LSD von Fisher ergab, dass die 5-Fu-Behandlung die dendritische Dornierung bei 90-100 μm ( p <0,01, Abbildung 3 D ), 70-80 μm und 110-120 μm verringerte (Fisher's LSD, p <0,05, Abbildung 3 D ) Weg von der soma 29 .

Um die dendritische Komplexität zu bestimmen, wurde eine Zweigreihenanalyse verwendet, um die 5-Fu-behandelten und die mit Kochsalzlösung behandelten Kontrollgruppen zu vergleichen. Innerhalb der DG zeigte die Zweigordnungsanalyse einen signifikanten Unterschied zwischen jeder Behandlungs- und Verzweigungsreihenfolge ( F (8, 36) = 25,61, p <0,001, Fig. 4 ). Dies wurde weiter analysiert mit dem Fisher's LSD, was darauf hindeutete, dass es eine verminderte Länge am 4. und 6.Reihenfolge nach der 5-Fu-Behandlung ( p <0,001; Abbildung 4 ) 29 .

Abbildung 1
Abbildung 1 : Golgi-gefärbtes Neuron, das die Kriterien für die Bildgebung und die weitere Analyse darstellt. Alle drei Wirbelsäulentypen sind nach der Golgi-Färbung leicht zu sehen. Die Färbung ist über die gesamte Länge des Dendrits konsistent und der Dendrit wird von anderen Neuronen isoliert. Maßstab, 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2 : Golgi gefärbt n Euronen zeigten signifikante Unterschiede in der Wirbeldichte zwischen den 5-Fu-behandelten und den mit Salzlösung behandelten Gruppen im apikalen CA1, aber nicht im basalen CA1. Es gab einen signifikanten Unterschied in der Wirbelsäulenlänge zwischen 5-Fu-behandelten und mit Salzlösung behandelten Gruppen sowohl im apikalen als auch im basalen CA1. ( A ) In den apy-pyramidenförmigen Dendriten von CA1 verringerte 5-Fu die Wirbelsäule signifikant. ( B ) In den basalen Dendriten gab es keine signifikanten Veränderungen in der Gesamtdichte der Stacheln. ( C ) Die Sholl-Analyse ergab, dass die 5-Fu-Behandlung die dendritische Wurzelung bei 40-100 μm und 130-160 μm von dem Soma in den apikalen pyramidalen Dendriten von CA1 signifikant verringerte. ( D ) In den basalen Dendriten verringerte die 5-Fu-Behandlung die dendritische Arborisierung bei 30-60 μm und 70-110 μm von dem Soma. Durchschnitt ± SEM (n = 6). * P <0,05; ** p <0,01, ANOVA 29 .= "Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55696/55696fig2large.jpg" target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3
Abbildung 3 : Golgi-gefärbte Neuronen zeigten signifikante Unterschiede in der Wirbelsäuredichte zwischen 5-Fu-behandelten und mit Salzlösung behandelten Gruppen sowohl im apikalen als auch im basalen CA3. Es gab einen signifikanten Unterschied in der Wirbelsäulenlänge zwischen 5-Fu-behandelten und mit Kochsalzlösung behandelten Gruppen in apikalen CA3, aber nicht basalen CA3. ( A ) In den CA3 apikalen pyramidalen Dendriten verringerte 5-Fu die Wirbelsäule deutlich. ( B ) In den basalen Dendriten verringerte 5-Fu die Gesamtdichte der Stacheln erheblich. ( C ) Es gab keinen signifikanten Effekt der 5-Fu-Behandlung im CA 3 apikalen Bereich. ( D ) In den basalen Dendriten, 5-Fu treaTung verringerte dendritische Arborisierung 70-120 μm weg von der soma. Durchschnitt ± SEM (n = 6). *, P <0,05; **, p <0,01, ANOVA 29 . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4 : Golgi-gefärbte Neuronen innerhalb der DG zeigten eine verminderte Länge bei der 4. und 6. Ordnung nach 5-Fu-Behandlung im Vergleich zu der mit Salzlösung behandelten Gruppe. Länge pro Zweigordnung in pyramidenförmigen Neuronen der CA1 Hippocampalregion. Durchschnitt ± SEM (n = 6). * P <0,05; ** p <0,01, ANOVA 29 . PlädoyerKlicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Im Vergleich zu moderneren Techniken hat die Golgi-Cox-Methode mehrere Vorteile, die es zur bevorzugten Methode zur Untersuchung der Wirbelsäulenmorphologie machen: 1) Die Färbung kann für im Wesentlichen jedes Gewebe verwendet werden, 2) Ein Grundlichtmikroskop-Setup ist alles, was benötigt wird Erwerben Golgi-basierte Bilder, 3) Die Golgi-Cox-Bildgebung ist schneller als konfokale Bildgebung und 4) Golgi-gefärbte Abschnitte sind für mehrere Monate bis Jahre länger als Proben, die fluoreszenzmarkiert sind, lebensfähig. Auch bei diesen Vorteilen hat die Golgi-Cox-Methode noch gewisse Einschränkungen. Zuerst ist der gesamte Prozess sehr zeitaufwendig und erfordert mehrere Wochen der Färbung, gefolgt von der Analyse der Bilder. Wie es bei diesem Protokoll zu sehen ist, dauert es 14 Tage in Lösung A und 1 Tag in Lösung B, bevor der Schnitt beginnen kann. Darüber hinaus wird die Durchführung von Schnitt, Nachfärbung und Montage 2-3 Stunden pro Gehirn. Jede Rutsche muss 1 Tag vor dem Reinigen trocknen und bedecken. Danach die ZeitdauerEs wird dauern, um zu bild und analysieren die abschnitte werden von der individuellen abhängen. Zweitens gibt es Probleme der Konsistenz zwischen den Daten von Analysten aufgrund von Unterschieden in der Kategorisierung von Stacheln 30 . Aus diesem Grund empfiehlt es sich, dass eine Person den Bild- und Analyseabschnitt jedes Experiments durchführt, der den Zeitaufwand für die Fertigstellung des Projekts weiter verlängert.

Es gibt mehrere kritische Schritte der Golgi-Cox-Methode, die genaue Timing und Aufmerksamkeit erfordern. Beim Färben der Abschnitte mit der Ammoniumhydroxidlösung ist es zwingend erforderlich, dass die Abschnitte für mindestens 19 min, aber nicht über 21 min in der Lösung verbleiben. Wenn die Abschnitte nicht in der Ammoniumhydroxidlösung für genügend Zeit sind, werden sie nicht ordnungsgemäß gefärbt, was bedeutet, dass die Neuronen bei der Bildgebung weniger definitiv aussehen, wodurch es schwieriger wird, sie zu analysieren. Wenn die Abschnitte in der Ammoniumhydroxidlösung für über 21 min vorliegen, können sie ov werdenEr-gefärbt, so dass es schwierig, die einzelnen Neuronen zu identifizieren. Deshalb, beim Ausschalten der Lösungen, muss sich der Forscher schnell bewegen. Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Übertragung der Abschnitte auf Folien. Bevor Sie die Abschnitte mit dem großen Pinsel bewegen, ist es am besten, zuerst eine kleine Menge PBS-T auf die Folie zu legen. Dadurch können die Abschnitte einfach auf die Folie gelegt und manövriert werden, ohne dass sie auseinanderbrechen müssen. Ein weiterer kritischer Schritt ist der Trocknungsschritt, nachdem die Abschnitte auf eine Folie gelegt wurden. Wenn die Folien nicht mindestens 20 min bei Raumtemperatur trocknen, werden bestimmte Abschnitte höchstwahrscheinlich während der Entwässerungsschritte abfallen. Wenn die Objektträger länger als 30 min trocknen, werden sie höchstwahrscheinlich brüchig und brechen auseinander während der Entwässerungsschritte.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens gibt es bestimmte Schritte, die möglicherweise lästig sind. Zum Beispiel, wenn das gesamte Cerebellum abgeschnitten wird, bevor man das Gehirn auf die Spezifikation setztImen-Halter und Schnitt, kann das Gehirn auseinander knacken, bevor die DG vollständig geschnitten ist, was weitere Abschnitte unbrauchbar macht. Daher ist es wichtig, nur caudal durch etwa die Hälfte des Kleinhirns zu schneiden. Ein weiterer Schritt, der die Abschnitte negativ beeinflussen kann, ist die Vibrationsgeschwindigkeit und die Amplitude. Während die empfohlenen Einstellungen für 7 und 6 sind, können beim Schneiden bestimmte Abschnitte im PBS zerfallen oder uneben erscheinen. Um dies zu korrigieren, stellen Sie entweder die Vibrationsgeschwindigkeit oder die Amplitude ein einzeln ein, bis die Abschnitte in-takt sind und sogar zwischen den Einstellungen von 6-8.

Auch wenn kommerzielle Kits für Golgi-Färbung zur Verfügung stehen, fehlen ihnen oft genaue Details für jeden einzelnen Schritt. Mit diesem Protokoll berichten wir im Detail über alle Schritte, die verwendet wurden, um anderen Labors zu erlauben, Gewebe in einer hohen Qualität mit minimaler Fehlersuche zuverlässig zu färben. Die verwendeten Materialien stehen den meisten Neurowissenschaften zur Verfügung. Aberrationen in dendrit morpHologie und Veränderungen in der Zahl der dendritischen Stacheln sind mit einer Vielzahl von neurologischen Störungen verbunden 31 . Darüber hinaus könnten diese Störungen der dendritischen Arborisierung ein bedeutendes morphologisches Merkmal der durch Chemotherapie verursachten Verletzung im Gehirn darstellen 32 . In Zukunft werden wir untersuchen, wie sich die von 5-Fu induzierten strukturellen Veränderungen auf die Verhaltens-, Zell- und Molekularveränderungen beziehen können.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von einem Pilotstipendium unter NIH P20 GM109005 (ARA) und dem Zentrum für Translational Neuroscience IDeA Programmpreis P30 GM110702 unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
superGolgi Kit  Bioenno Lifesciences 30100  Contains hazardous materials. 
PBS 10x powder concentrate Fisher  BP665-1
Triton X-100 Sigma 9002-93-1
Permount  Fisher  SP 15-100
Slide cover  Fisher  12-546-14
7 mL Transfer pipette  Globe Scientific  135030
10 mL Falcon tubes  BD Biosciences  352099
Foil  Fisher  01-213-105
12-well plate  BD Biosciences  353043
200 proof Ethanol  Pharmco-AAPER 111000200
Xylene  Acros Organics  1330-20-7 Hazardous. 
Permabond 200 Permabond LLC GF2492
25 mL serological pipette Sigma SIAL1489
Parafilm Midsci HS234526C 
Vibratome  World Precision Instruments  NVSLM1
C57Bl/6 Male Mice  The Jackson Laboratory  000664
Axio Imager 2 ZEISS Multiple components, see website for details. 
AxioCam MRc Camera ZEISS 426508-9902-000
Staining Dish , Green Tissue-Tek 62541-12
Staining Dish Set  Electron Microscopy Sciences  70312-20
Motorized Pipet Filler  Fisher  03-692-168
Neurolucida  mbf Bioscience 
Neurolucida Explorer  mbf Bioscience 
Prism  GraphPad

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References

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Neurowissenschaften Ausgabe 124 Golgi Hippocampus dendritische Stacheln dendritische Morphologie Komplexität Arborisierung
Bewertung der Hippocampalen Dendritischen Komplexität bei gealterten Mäusen unter Verwendung der Golgi-Cox-Methode
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Groves, T. R., Wang, J., Boerma, M., … More

Groves, T. R., Wang, J., Boerma, M., Allen, A. R. Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method. J. Vis. Exp. (124), e55696, doi:10.3791/55696 (2017).

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