Summary
Burada ayrıntılı bir Golgi-Cox protokolünü sunuyoruz. Bu güvenilir doku lekesi metodu, minimal sorun giderme ile hipokampustaki ve tüm beyindeki sitolojik mimarinin yüksek kaliteli bir değerlendirmesini sağlar.
Abstract
Dendritik dikenler, eksitatör sinapslar içeren nöronal dendritik millerin çıkıntılarıdır. Hipokampus içerisindeki nöronal dendritlerin morfolojik ve dallanmış varyasyonları biliş ve hafıza oluşumuyla ilişkilendirilir. Golgi boyama için çeşitli yaklaşımlar vardır, bunların hepsi dendritik alandların morfolojik özelliklerini belirlemek ve belirgin bir arka plan oluşturmak için kullanışlıdır. Mevcut Golgi-Cox yöntemi (ticari bir Golgi boyama kiti ile sağlanan protokolün ufak bir varyasyonu), kemoterapötik ilaç olan 5-flurouracil'in (5-Fu) nispeten düşük dozunun dendritik morfolojiyi nasıl etkilediğini değerlendirmek üzere tasarlanmıştır , Omurganın sayısı ve hipokampüs içindeki işlenmesi karmaşıklığı. 5-Fu, dendritik karmaşıklığı önemli derecede modüle etti ve bölgeye özel bir şekilde, hipokampustaki omurga yoğunluğunu azalttı. Sunulan veriler, Golgi boyama yönteminin efOlgun nöronları, CA1, CA3 ve hipokampus diş açısı (DG) lekelemiştir. Bu protokol, diğer araştırmacıların beyne dokuları yüksek kaliteli sonuçlar ve minimum sorun giderme ile güvenilir şekilde boyayabilmesi için her adımın ayrıntılarını bildirir.
Introduction
Dendritler, presinaptik girdi 1'i alan ve işleyen nöronların en büyük kısmıdır. Dendritik süreçleri, proksimal dalların distal dallardan daha büyük bir çapa sahip olduğu karmaşık bir geometriye sahiptir. Dendritler geliştikçe, dendritik arborizasyon olarak adlandırılan bir süreçte diğer nöronlarla birkaç bağlantı oluştururlar. Bu dallanma miktarı ve paterni, bir dendrite'nin 2'yi yeterince işleyebildiği sinaptik girdilerin miktarını belirler.
Dendritik koordinasyon, aktiviteye bağlı plastisite ve nöronal devrelerin düzgün gelişimi için gerekli bir süreçtir. Uzatma, geri çekme, dallanma ve sinaptojenez intrensek genetik programlar ve ekstrensek faktörlerden etkilenen karmaşık süreçlerdir. Hipokampus içerisindeki nöronal dendritlerin morfolojik ve dallanmış varyasyonları biliş ve hafıza oluşumuyla ilişkilendirilirF "> 3 , 4. Dendritik karmaşıklıktaki değişiklikler patofizyolojik ve davranışsal değişikliklerle ilişkilidir 5. Anormallikler Kırılgan X Sendromu ve Down Sendromu 6 dahil olmak üzere çeşitli hastalık durumlarıyla ilişkilidir.
Dendritik omurgalar, merkezi sinir sistemi içinde heyecan verici girdiler alan dendritik arbelerin uzmanlaşmış subselüler bölmeleridir. Dendritik dikenlerin üç morfolojik sınıfı vardır, her sınıfa boyutları ve şekilleri temel alınarak adı verilmiştir: 1) diğer dikenlere göre daha fazla glutamat reseptörü ile kompleks postsinaptik yoğunluklara sahip olan mantar dikenleri; 2) kökten yoksun sağlam dikenler; Ve 3) uzunlamasına dar bir gövdeden ve küresel bir baştan oluşan ince dikenler. Dendritik omurga hacmi, onları kısmen tanımlamak için kullanılır; genellikle küçük ince dikenler (0.01 μm3 3 ) 9 , 10 . Omurgalar olgunlaşma ile dengelenir. Örneğin, ince dikenler birkaç gün sonra geri çekilir veya mantar omurgalarına dönüşür. Alternatif olarak, mantar dikenleri nispeten kararlıdır ve uzun süre hayatta kalabilir. Nöronal bağlantıların kuvvetinin dikenlerin sayısına ve / veya hacmine 11 , 12 , 13 dayalı olduğu düşünülmektedir.
Klasik Golgi boyama yöntemi ve daha modern varyasyonları, dendritik omurga morfolojisi ve yoğunluğunu incelemek için kullanışlıdır. Golgi boyamasının benzersiz bir özelliği, rasgele toplam nöronların% 5'ini lekelediğidir, bu da bireysel nöronların izini sağlar 14,15. Golgi metasının tam mekanizması olsa daOd lekeleri bireysel nöronlar hala bilinmemektedir, yöntemin prensibi, gümüş kromat (Ag 2 CrO 4 ) 16 , 17'nin kristalleşmesine dayanmaktadır. Golgi yönteminin üç ana türü vardır: hızlı Golgi, Golgi-Cox ve Golgi-Kopsch 18 , 19 . Her üç yöntem de birkaç gün ila aylarca krom tuzlarında ilk inkübasyon evresi ile başlar ancak aralarında bazı önemli farklar vardır. Hızlı Golgi, ilk aşamada osmiyum tetroksit kullanırken, Golgi-Kopsch paraformaldehid içerir. Hem hızlı Golgi hem de Golgi-Kopsch boyama sonrasında, yaklaşık% 7 oranında,% 1-2 gümüş nitrat solüsyonunda inkübe edilir. Golgi-Cox yöntemi gümüş nitrat yerine mercurik klorür ve potasyum dikromat kullanır ve 2-4 hafta süreyle emprenyasyon süresine sahiptir. Dokular daha sonra kesitlendirilir ve seyreltilmiş amonyakÇözeltiyi, ardından tuzları gidermek için bir fotoğrafik düzeltici uygulayın. Üç tipten Golgi-Cox yönteminin, kısmen arka plana müdahale etmeden dendritik aplikleri boyamakta en iyi olduğu düşünülmektedir, çünkü kısmen kristal yapılar doku yüzeyinde oluşmaz (hızlı Golgi yönteminde olduğu gibi) 17 , 20 , 21 .
Mevcut yöntem, ticari bir Golgi boyama kiti ile sağlanan protokolün hafif bir varyasyonudur ve nispeten düşük bir dozda 5-Fu'nın dendritik morfolojik özellikleri ve omurganın yoğunluğunu nasıl etkilediğini değerlendirmek üzere tasarlanmıştır. Elde edilen veriler, kemoterapötik tedavinin nöronal devreleri nasıl etkilediği konusunda daha fazla bilgi sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denemeler, UAMS 'da Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan etik standartlara uygun olarak yürütülmüştür.
1. Hayvanlar ve 5-Fu Enjeksiyon Paradigması
- 6 aylık erkek C57Bl6 / J vahşi tipli fareler satın alarak bunları 1 yaşına gelene kadar sabit 12 saat aydınlık / karanlık döngü içinde yerleştirin.
- 5-Fu'yı% 0.9 steril tuzlu suda inceltin. Fare başına gerekli doz olarak 60 mg / kg kullanın.
- 5-Fu'nun intraperitoneal enjeksiyonlarını yapın (haftada bir kez üç hafta boyunca).
- Her gün aynı periyotta intraperitoneal enjeksiyonları verin. Örneğin, saat 09.00-1200 arasında.
- Hayvanları durdurun ve son enjeksiyondan 30 gün sonra beyinlerini alın.
2. Ötenazi Prosedürü ve Beyin Çıkarma
- Kemirgenleri sıkın ve kuyruk tabanı tutun. Öte yandan başparmak ya da parmağınızıKemirgen hayvanının boynu tabanı. Kemiricinin boynuna hızla baskı uygulayın ve diğer eliniz kuyruk tutarken geriye doğru çekin.
- Kemirganı bir elinizle ve büyük makas makinesini diğeri ile tutun. Kemirgenlerin boynunu iki bıçak arasına yerleştirin ve kafayı çabucak kesin.
- Kopmuş fare kafasını kaldırın ve kafatasının üstündeki kürkü düzeltmek için ince makasları kullanın. Daha sonra, makasın uçlarını her bir göz soketine yerleştirin ve hafifçe kuvvetle makarayı kapatın.
- Serebellumun sağında ve solunda kafatasını kesmek için yaylı makas kullanın.
- Serebellumu çevreleyen kafatasının bir kısmını yukarı kaldırıp kaldırmak için forseps kullanın.
- Kafatasının midsagittal çizgisini kesmek için makas kullan.
- Kafatasının kalan kısmını beyinden kaldırmak için forseps kullanın.
- Beyni istenilen kaba koymak için bir spatula ve bir sonda kullanın. Paslanmaz çeliktenTeel bıçakla, her beyin midsagital düzlem boyunca kes. Sağ hemisferlerde aşağıdaki Golgi-Cox yöntemini uygulayın.
3. Golgi Boyama ve Doku Hazırlama
- Yeni hasat edilen yarım beyinleri, 10 mL'lik konik bir tüpteki 5 mL cıva klorür esaslı çözeltiye (kitten çözelti A) daldırın. Cıvalı klorür çözeltisi ışığa duyarlıdır; Tüpü folyo ile örtün. Numuneyi oda sıcaklığında karanlıkta saklayın.
NOT: Çözüm A, malzeme tablosunda listelenen kit içinde sağlanmıştır. Dikkat! Çözelti A (ayrıca civalı klorür çözeltisi olarak da adlandırılır), potasyum dikromat, mercurik klorür ve potasyum kromat gibi toksik reaktifler içerir. Koruyucu eldiven takın ve duman kabininde çalışın. - 1 gün sonra solüsyonu geçici bir kaba (büyük bir tartım botu gibi) yavaşça boşaltın ve bir biyolojik tehlikeli atık kabına atın. Beyinlerini (orijinal 10 mL konik tüplerde hala) 5 mLMercurik klorür solüsyonu ilave edin ve numuneyi oda sıcaklığında 13 gün daha karanlığa döndürün.
- 90 ml damıtılmış veya deiyonize suya (dH20) 30 g emdirme sonrası tampon ekleyin. 6 oyuklu bir tabakın her kuyucuğunu 6.5 ml'lik post-emprenye tamponuyla, beyne göre birer tane doldurun
NOT: Emdirme sonrası tampon maddesi, malzeme tablosunda listelenen kit içinde sağlanmaktadır.- Cıva klorür solüsyonunda 14 gün sonra (toplamda), dokuyu dH20 ile durulayın, daha sonra emdirme sonrası tamponla birlikte 6 gözlü plakalara aktarın. Tabakları folyo ile örtün ve karanlıkta oda sıcaklığında saklayın.
- 1 gün daldırıldıktan sonra emprenye sonrası tampon maddeyi pipetleyin ve yeni emdirme sonrası tampon ile yenileyin; Oda sıcaklığında karanlıkta 1 gün saklayın. Gerekirse, bunu 1 aya kadar 4 ° C'de saklayın 22 .
4. Kesit alma
- Kapaklardaki 12 yuvalı plakları, soldan sağa ve yukarıdan aşağıya artan sırayla numaralandırın.
- Beynin her birine bölünürse, beyin başına iki ya da üç 12 plakalı tabak hazırlayın.
- Her bir 12 bölmeli plakanın üst kısmını, kesit alan beyin tanımlama numarası ile etiketleyin.
- Her plakanın her kuyusuna 2 mL 1x PBS pipetleyin.
- Sahneyi kurun ve vibratome'yu açın; Dokuyu kapatacak kadar kapta yeterli 1x PBS bulunduğundan emin olun.
- İki parça plastik parafin filmi kesin ve iki kat daha katlayın. 1x PBS'nin sayaca sızmasını önlemek için numune tutacağı çıkıntılarının deliklerine yerleştirin.
- Şişeyi örnek tutucunun doku bloğuna koyun ve sonra siyanoakrilat yapışkan tutkalı (malzeme tablolarına bakın) koyun.
- Beyni 6 kuyucuklu plakadan çıkarın ve bir plastik veya cam tabak üzerine koyun. Paslanmaz çeliktenSerebellumun yarısını kesmek için çelik iki kanatlı bıçak.
- Serebellini kaudally kesin. Kalan kalan serebellinin bile eşit olduğundan emin olun.
- Geri kalan serebellumun düz yüzeyini tutkal üzerine derhal yerleştirin.
NOT: Dokunun dorsal kısmı (serebral korteks) bıçağın sağına veya sağına bakmalıdır. Daha önce koku alma ampulünün bulunduğu rostral uç yukarı bakmalıdır.- Tutkalın tamamen kurutulduğundan emin olmak için en az birkaç dakika bekleyin.
- Beyni yerinde tutan yapışkan kuruysa da numune banyosuna 1x PBS dökün. Tutkal kuruduktan sonra numune tutacağını doku ile birlikte numune banyosuna yerleştirin.
- Doku örneği tam olarak kaplanmamışsa, numune banyosuna 1x PBS daha dökün.
- Bıçağı, vibratomun bıçak tutucusuna ve yavaşça l1x PBS'ye tamamen batıncaya kadar bıçağı numune banyosuna geçirin. Bıçağı, dokunun üstünün biraz altına düşene kadar indirmeye devam edin.
- Vibrasyon hızı 7'ye, genliği 6'ya ve kesme açısını 12 °'ye ayarlayın (vibratome model için malzeme tablosuna bakın). Titreşimi başlatın ve 200 μm kesitleri kesin 23 .
- Doku bölümlerini numune banyosundan 12 oyuklu plakaların belirlenmiş her bir oyuğuna taşımak için büyük bir fırça kullanın.
- İstenen sayıda doku kesitine ulaşana kadar dokuyu kesmeye devam edin.
5. Post-boyama
- Aşağıdaki boyama adımları ve durulamalar için her biri için belirtilen çözeltiden 2 mL kullanın. Çözümleri oyuklara aktarmak için motorlu bir pipet dolgusu kullanın (materyal tablosuna bakın). Çözümleri kuyulardan ve uygun atıklara aktarmak için bir transfer pipeti (bkz. Malzeme tablosu) kullanınkonteynerler.
- Parçaları 0.01 M PBS-T'nin bir 30 dakika yıkamasında durulayın (3.0 mL deterjan ekleyin (materyal tablosuna bakın) 1000 mL 0.01 M PBS'ye ekleyin).
- Amonyum hidroksit solüsyonunu (Dikkat) 3: 5 oranında dH20 ile seyreltin, kullanımdan hemen önce. Seyreltilmiş amonyum hidroksit solüsyonundaki kısımları 19-21 dakika boyunca boyayın.
- Işık hassas amonyum hidroksit solüsyonunu folyo ile koruyun.
NOT: Çözeltideki amonyum hidroksit konsantrasyonu ~% 10'dur ve "tehlikeli" olarak sınıflandırılmıştır. Amonyum hidroksit çözeltisi deriyle temas halinde yanıklara neden olabilir. Solunduğunda solunum borusu tahrişine neden olabilir. Koruyucu eldiven takın ve duman kabininde çalışın.
- Işık hassas amonyum hidroksit solüsyonunu folyo ile koruyun.
- Bölümleri, boyama sonrası tamponda boyayın (19 dakika boyunca 21 dakika boyunca 500 mL dH20 içinde 90 g reaktif D ekleyin). Boyama sonrası tampon ışığa duyarlıdır; Folyo ile koruyun 22 .
- Kesitleri üç, 0.01 M PBS-T'nin 5-10 dk yıkaması.
6. Montaj, Temizleme ve Kaplama
- Büyük fırça ile% 1 jelatin kaplı slaytlara bölümleri monte edin. Oda sıcaklığında 20-30 dakika boyunca kurumalarını bekleyin ve sonra gece boyunca bir Coplin kavanozuna koyun.
- Eldivenleri eldivenli ellerle Coplin kavanozundan çıkarın ve plastik bir rafa koyun (materyal tablosuna bakın). Plastik rafı% 100 etanol içeren boyama kabına (bkz. Malzeme tablosu) yerleştirin. Onları üç tane 5 dk yıkayarak kurutun.
- Slaytları, her biri% 99 ksilen içinde 5 dakika boyunca iki kez yıkayın. Sürgüleri bir cam rafa yerleştirin ve rafı, metal saplı ksilen içeren bir cam boyama kabına indirin (bkz. Malzeme tablosu).
NOT: Dikkat, ksilen inhale edildiğinde zararlıdır ve deriye dokunursa tahrişe neden olur. Sıvı ve buhar hallerinde son derece yanıcıdır. Koruyucu eldiven takın ve duman kabininde çalışın. - Slaytları xyl'den kaldırEne birer birer alın ve dokuyu ~ 0.25 mL montaj medyasıyla hızlıca kaplayın (bkz. Malzeme Tablosu). Daha sonra, slayt kapaklarını alın ve onları ortamın üzerine koyun.
- Kapakların altındaki sıkışmış hava kabarcıklarını, bir fırça sonu gibi kör bir nesneyle kenara itin.
- Slaytları güneş ışığından uzak bir alana yerleştirin ve 2-3 gün kurumalarını bekleyin.
- Bir mikroskop kullanarak görüntü elde etmeye ve uygun yazılımla analiz etmeye devam edin.
7. Görüntü Yığını Edinme
- Görüntüleme programını açın (bkz. Malzeme Tablosu ). Slayt mikroskop sahnesine yerleştirin. Programın üst kısmındaki menüde, "Edinme" yi tıklayın ve ardından "Canlı Resim" i tıklayın.
- Mikroskopu 10X yapın. Tercih nöronunu belirleyin ve ardından kırmızı bir X gibi görünen imleci soma'nın merkezine getirin. Referans noktasını ayarlamak için sol tıklayın.
- Mikroskopu 40X yapın. Programın üst kısmındaki menüden "Taşı" yı tıklayın ve ardından "Referans Noktasına" tıklayın.
- Odak dışına gelene kadar dokunun üzerindeki ince objektifi elle kaydırarak görüntü yığını oluşturmaya başlayın.
- "Image Acquisition" başlığı altındaki programın sağ alt köşesindeki "Üstü Ayarla" yı tıklayın.
- Dokudan biraz dışarı doğru kaydırın ve ardından "Resim Alma" altındaki "Altını Ayarla" yı tıklayın. Ardından, "Görüntü Yığını Al" ı tıklayın.
- Görüntü yığını edinildikten sonra, görüntülenen pencerede görüntü dosyası için istediğiniz adı yazın. "MBF Ascii dosyası" olarak kaydedin.
- İstendiğinde, dosya türünü "MBF JPEG2000 yığın dosyası" olarak seçin ve ardından "Kaydet" i tıklayın.
8. Nöronal İzleme
- Toolba'daR menüsünün altındaki "Kontur Adı" başlıklı kutuyu tıklayın. Açılır menüden "Soma" yı seçin.
- Elle soma izini almak. Ardından sağ tıklayın ve izleme tamamlandığında "Cell Body'yi Sonlandır" ı seçin.
- "AutoNeuron Workflow" başlıklı başka bir sekme açmak için "AutoNeuron" u seçin.
- "Yapılandırma Türü" nin altında "Yeni" yi seçin. Parametreleri ayarlayın ve "Soma Algılama" alt başlığını getirmek için "Sonraki Adım" ı tıklayın.
- Parametreleri ayarlamak için "Parlaklık Alanı" nı seçin. Ardından, "Maksimum İşlem Çapı" altında, "Ölçüm Başlat" ı tıklayın. İmleci kullanarak, dendritin tabanına gidin ve elle çapı ayarlayın.
- Kullanıcının tüm görüntüyü izlemesini isteyen pencerede "Evet" seçeneğini tıklayın. Elle soma izini almak. "Tohum Yerleşimi" alt başlığını getirmek için Tıklayın ve ardından "Sonraki adım" a tıklayın.
- "Doğrulama Tohumunu" tıklayınS "yazıp" Next Step "e basarak" Neuron Reconstruction "alt başlığını getirin.
- "Neuron" altında, "Etkileşimli" yi tıklayın. Dendritlerin programındaki yönergeleri izleyerek ve program tarafından izlenen vurgulanan alanı tamamlamak için sağ tıklayarak etkileşimli izlemeyi gerçekleştirin. Tüm dendritleri izledikten sonra "Sonraki Adım" ı tıklayın.
- Yeni bir pencere göründükten sonra, yeni konfigürasyonu istediğiniz başlık ile kaydedin. "Kaydet" i tıklayın.
9. Analiz
- Analiz programını açın (materyal tablosuna bakın).
- Üst menüden "Dosya" yı tıklayın ve ardından "Veri Dosyasını Aç" ı tıklayın. İlgilenilen dosyayı seçin.
- Analiz alt başlığı altında, "Sholl Analizi" ni seçin.
- "Sholl Analysis" penceresinde başlangıç yarıçapını 10 μm olarak ayarlayın. "Analiz" altında, "Dendritler" ve "Şube Siparişleri" kutularını tıklayın.
- Sağ clYeni açılan pencereleri tıklayın ve "Excel Dışa Aktar" ı tıklayın. "Kaydet" i tıklayın.
- Analizde "Dallanmış Yapı Analizleri" ni tıklayın. "Tüm Olası Analizler" i seçin.
- Yeni açılan pencereyi sağ tıklatın ve "Excel Dışa Aktar" ı tıklayın 24 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
5-Fu işleminin, Golgi ile boyanmış beyin bölümlerinin hipokampusundaki dendritik taşlama ve kompleksite üzerindeki etkileri, ticari olarak mevcut bir görüntüleme yazılımı kullanılarak nicelleştirildi ve izlendi. İzlemeden sonra, dendritik kabarcıklanma, omurga yoğunluğu ve omurga morfolojisi Sholl analizi ve dendritik karmaşıklık indeksi (DCI) kullanılarak analiz edildi. Sholl analizi, dendritik çember morfolojisini belirlemek için kullanılan nicel bir analitik yöntemdir25. Soma'dan başlayarak, birbirinden 10 μm'lik daireler dendritik izlerin üzerine bindirilir. Dendritlerin uzunluğu, dendritlerin geçtiği dairelerin sayısıyla belirlenir. Bir dendritik çemberin karmaşıklığını belirlemek için bir yöntem olan dal noktası analizi, dallanma noktalarının toplam sayısı ve sırasına dayanır.
Bir dal noktası,Dal iki alt dalda bölünür. Şube emri, şubelerin kaç kez bölündüğüne bağlı olarak karmaşıklığın bir ölçüsüdür. Örneğin, bir birinci mertebeden dallanma noktası, soma uzanan orijinal dendrit olacaktır; ikinci mertebe bir dal noktası, dalın iki alt dala ayrıldığı nokta olacaktır. Hem dallanma noktalarını hem de dallanma düzenini inceleyerek dendritik arborun karmaşıklığı (dallanma noktalarının sayısına bağlı olarak) ve dallanmanın hangi noktalarda gerçekleştiği (daha küçük bir dallanma düzeni soma'ya daha yakın olmakla birlikte, daha büyük bir dallanma düzeni Soma dışında) belirlenebilir. Bu parametreler DCI'ya uygulandı. CA1 ve CA3 apikal ve bazal kısımlara ayrılmış ve bağımsız olarak 26 , 27 analiz edilmiştir.
DG'de CA1 ve CA3 piramidal nöron ve granül nöronlarının dendritleri analiz edildi. Tüm nöronlar,Her bir deney grubu aşağıdaki kriterleri karşılamıştır: 1) dendritlerin tüm uzunluğu boyunca karanlık ve tutarlı Golgi boyaması, 2) dendritler görülebilir şekilde incitmiştir ve 3) her nöron, analiz sırasında girişim önlemek için aralarında yeterli boşluk bırakmıştır 28 . Şekil 1 , yukarıdaki kriterleri yerine getiren bir nöron göstermektedir. Veriler ortalama ± SEM olarak ifade edildi. Sahte ve 5-Fu grupları arasındaki istatistiksel farklılıkları saptamak için, eşleştirilmiş bir iki-kuyruklu t -testi kullanıldı. Tüm istatistiksel analizler analitik yazılım (bakınız tablo) kullanılarak yapıldı ve p <0.5 anlamlı kabul edildi. 5-Fu tedavisinin ve Sholl yarıçapının etkilerini değerlendirmek için karışık faktör analizi (ANOVA) kullanıldı. Uygun olduğunda, Fisher LSD post-hoc testleri ANOVA sonrasında kullanıldı 29 .
Her iki CA'da 1 ( t = 7.68, p <0.01; Şekil 2A) ve CA3 ( t = 7.54, p <0.01) Şekil 3 A ) apikal piramidal dendritlerde, 5-Fu tedavisini takiben omurgalarda belirgin bir azalma vardı. 5-Fu tedavisi, CA1'in bazal omurga yoğunluğunu önemli ölçüde etkilemese de ( t = 1.79, p = 0.15; Şekil 2 B ), CA3 bazal piramidal dendritik omurgalarını önemli ölçüde azalttı ( t = 5.57, p <0.05; Şekil 3 B ). Ayrıca, Fisher LSD post-hoc testleri, CA1 apikal piramidal dendritlerin 40-100 μm'de (Fisher LSD, p <0.001; Şekil 2 C ) ve 130-160 μm'de (Fisher LSD, p <0.05) dendritik arborizasyonunda azalma olduğunu ortaya koydu 0.05;Benzer şekilde, CA1 bazal apikal dendritlerde 30-60 μm'de (Fisher's LSD, p <0.001; Şekil 2 D ) ve 70-110'da görülen benzer bir fenomen görüldü Μm (Fisher LSD, p <0.05; Şekil 2 D ) uzaklaştırıldı 29 .
CA3 apikal piramidal dendritleri ile ilgili olarak, 5-Fu tedavisini takiben segmental dendritik uzunlukta tuzla muamele edilen kontrollerle ( F (28,87) = 0.91; p = 0.59; Şekil 3 C ) karşılaştırıldığında anlamlı bir farklılık yoktu. Bununla birlikte, CA3 bazal piramidal dendritler için, segmental dendritik uzunlukta 5-Fu tedavisi ile salin ile kontrol edilen kontroller arasında belirgin bir fark vardı ( F (25, 78) =1.85; P <0.05; Şekil 3 D ). Fisher LSD, 5-Fu muamelesinin 90-100 um ( p <0.01; Şekil 3 D ), 70-80 um ve 110-120 um'de dentritik arborizasyonu azalttığını ortaya koymuştur (Fisher LSD, p <0.05; Şekil 3 D ) Soma'dan uzak 29 .
Dendritik karmaşıklığı belirlemek için, 5-Fu ile muamele edilen ve saline ile muamele edilen kontrol gruplarını karşılaştırmak için bir kol analizi yapılmıştır. Genel Müdürlük bünyesinde, şube analizi, her bir muamele ve şube sırası arasında anlamlı bir farklılık gösterdi ( F (8, 36) = 25.61, p <0.001; Şekil 4 ). Bu, Fisher's LSD kullanılarak daha da analiz edildi; bu, 4. ve 6. aylarda uzunluğun azaldığını gösterdi5-Fu tedavisini takiben ( p <0.001; Şekil 4 ) 29 .
Şekil 1 : Görüntüleme ve daha ileri analiz için kriterleri temsil eden Golgi lekeli nöron. Her üç omurga türü de Golgi boyamasını takiben kolayca görülebilir. Boyama, dendritin tüm uzunluğu boyunca tutarlıdır ve dendrit, diğer nöronlardan izole edilmiştir. Ölçek çubuğu, 5 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 : Golgi lekeli n Euronlar apikal CA1'de 5-Fu ile tedavi edilen gruplar ile tuzlu su ile tedavi edilen gruplar arasında omurga yoğunluğunda önemli farklılıklar olduğunu gösterdi, ancak bazal CA1'i değil. Hem apikal hem de bazal CA1'de 5-Fu ile tedavi edilen gruplar ile tuzlu su ile tedavi edilen gruplar arasındaki omurga uzunluğunda önemli bir fark vardı. ( A ) CA1 apikal piramidal dendritlerde, 5-Fu omurga yoğunluğunu önemli ölçüde azalttı. ( B ) Bazal dendritlerde, omurganın genel yoğunluğunda önemli bir değişiklik yoktu. ( C ) Sholl analizi, 5-Fu tedavisinin CA1 apikal piramidal dendritlerdeki soma 40-100 μm ve 130-160 μm uzakta dendritik arborizasyonu önemli ölçüde azalttığını ortaya koymuştur. ( D ) Bazal dendritlerde, 5-Fu muamelesi soma ile 30-60 μm ve 70-110 um'de dendritik arborizasyonu azalttı. Ortalama ± SEM (n = 6). * P <0.05; ** p <0.01, ANOVA 29 .= "Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55696/55696fig2large.jpg" target = "_ blank"> Bu figürde daha büyük bir versiyon görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3 : Golgi lekeli nöronlar, hem apikal hem de bazal CA3'te 5-Fu ile işleme tabi tutulmuş gruplar ile tuzlu su ile tedavi edilen gruplar arasındaki omurga yoğunluğunda önemli farklılıklar sergiledi. Apikal CA3'te 5-Fu ile ve saline ile tedavi edilen gruplar arasında omurga uzunluğunda önemli bir fark vardı, ancak bazal CA3'te değildi. ( A ) CA3 apikal piramidal dendritlerde, 5-Fu omurga yoğunluğunu önemli ölçüde azalttı. ( B ) Bazal dendritlerde, 5-Fu, omurganın genel yoğunluğunu önemli ölçüde azalttı. ( C ) CA 3 apikal bölgesinde 5-Fu tedavisinin anlamlı bir etkisi yoktu. ( D ) Bazal dendritlerde, 5-Fu treaSomatadan 70-120 μm uzakta dendritik arborazasyonu azalttı. Ortalama ± SEM (n = 6). *, P <0.05; **, p <0.01, ANOVA 29 . Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 4 : DG içerisindeki Golgi boyalı nöronlar, 5-Fu tedavisinden sonra 4. ve 6. siralarda salinle muamele edilen gruba kıyasla azalmış uzunluk gösterdi. CA1 hipokampal bölgesinin piramidal nöronlarındaki dal sırası başına uzunluk. Ortalama ± SEM (n = 6). * P <0.05; ** p <0.01, ANOVA 29 . SavunmaBu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Daha modern tekniklerle karşılaştırıldığında, Golgi-Cox yöntemi, omurga morfolojisini incelemek için tercih edilen yöntem olan çeşitli avantajlara sahiptir: 1) Boyama esasen herhangi bir doku için kullanılabilir 2) Basit bir ışık mikroskopu kurulumu, 3) Golgi-Cox görüntüleme konfokal görüntülemeden daha hızlıdır ve 4) Golgi lekeli bölümler birkaç ay ila yıllarca floresanla işaretlenmiş örneklerden daha uzun süre yaşayabilir. Bu avantajlarla bile, Golgi-Cox yönteminin hala bazı sınırlamaları vardır. İlk olarak, tüm süreç çok zaman alıcıdır, birkaç hafta boyunca boyama gerektirir ve ardından görüntülerin analizi yapılır. Bu protokol ile görüldüğü gibi, kesitlendirme başlamadan önce A çözeltisinde 14 gün, B çözümü için 1 gün sürer. Ek olarak, kesitlendirme, post-lekeleme ve montaj yapmak beyne 2-3 saat sürecektir. Her slayt temizleme ve örtme işleminden önce 1 gün boyunca kurumaya bırakılmalıdır. Ardından, zaman miktarıGörüntü alıp götürecek ve bölümlerini analiz edecek olan kişi bağlı olacaktır. İkincisi, kategorilere ayrılan dikenlerdeki farklılıklardan dolayı analistlerden gelen veriler arasında tutarlılık sorunları olabilir30. Bu nedenle, bir kişinin her denemenin görüntüleme ve analiz bölümünü gerçekleştirmesi ve böylece projenin tamamlanması için gereken süreyi uzatması önerilir.
Golgi-Cox yönteminde, kesin zamanlama ve dikkat gerektiren kritik adımlar vardır. Kesitleri amonyum hidroksit çözeltisi ile boyadığınızda, bölümlerin en az 19 dakika süreyle çözelti içinde kalması zorunludur, ancak 21 dakika boyunca gerekli değildir. Kesitler yeterli süre boyunca amonyum hidroksit solüsyonunda bulunmazlarsa, lekelenmeyeceklerdir, yani nöronlar görüntüleme sırasında daha az tanımlanacak, dolayısıyla onları daha zor analiz edecektir. Eğer bölümler amonyum hidroksit solüsyonunda 21 dakikadan fazla sürerse, ov olurlarEr lekelenmiş, bu nedenle bireysel nöronların belirlenmesini zorlaştırıyor. Bu nedenle, çözümleri değiştirirken, araştırmacı hızlı bir şekilde hareket etmelidir. Bir diğer önemli adım ise, bölümlerin slaytlara aktarılmasıdır. Kesitleri büyük boy fırça ile taşımadan önce, önce slayt üzerine az miktarda PBS-T eklemeniz daha iyidir. Bu, bölümlerin slayt üzerine kolayca yerleştirilmesine ve potansiyel olarak kopmadan manevra yapılmasına olanak tanır. Bir diğer kritik adım, bölümler bir slayda yerleştirildikten sonra kurutma basamağıdır. Sürgüler oda sıcaklığında en az 20 dakika kurumazsa, dehidrasyon adımları sırasında bazı bölümlerin düşmesi muhtemel olur. Sürgüler 30 dakikadan uzun süre kurumaya bırakıldıysa, dehidrasyon adımları sırasında büyük olasılıkla kırılabilirler ve parçalanırlar.
Bu işlemi yaparken, bazı adımlar zahmetli olabilir. Örneğin, beyni spektruma yerleştirmeden önce serebellum kesilirseImen tutucu ve kesit alma, beyin, DG tamamen kesilmeden önce parçalanabilir, böylece başka bölümler kullanılamaz hale gelir. Bu nedenle, serebellumun sadece yarısı boyunca kaudal olarak kesilmesi önemlidir. Bölümleri olumsuz etkileyebilecek bir diğer adım da vibratome hızı ve genliktir. Tavsiye edilen ayarlar sırasıyla 7 ve 6'dır, kesim üzerine bazı bölümler PBS'de parçalanabilir veya pürüzlü görünebilir. Bunu düzeltmek için, ya vibratome hızı ya da genliği, bölümler biraraya gelinceye kadar teker teker ve hatta 6-8 arasındaki ayarlar arasında ince ayarlayın.
Golgi lekelenmesi için ticari kitler mevcut olmasına rağmen, genellikle her adım için kesin ayrıntıları yoktur. Bu protokolle, diğer laboratuvarların minimum sorun giderme ile dokuları yüksek kalitede güvenilir şekilde leke yapmasına izin vermek için kullanılan tüm adımları ayrıntılı olarak rapor ediyoruz. Kullanılan malzemeler, çoğu sinirbilimi laboratuarı tarafından kullanılabilir. Dentrit morpundaki aberasyonlarHologram ve dendritik omurga sayısındaki değişiklikler çok sayıda nörolojik rahatsızlıkla ilişkilidir 31 . Ayrıca, dendritik arborizasyonun bu dalgalanmaları, beyindeki 32 kemoterapi ile oluşan yaralanmanın belirgin bir morfolojik damgasını temsil edebilir. Gelecekte, 5-Fu tarafından indüklenen yapısal değişikliklerin davranışsal, hücresel ve moleküler değişimlerle nasıl ilişkili olabileceğini inceleyeceğiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.
Acknowledgments
Bu çalışma, NIH P20 GM109005 (ARA) kapsamında bir pilot yardım ve Translational Neuroscience IDeA Programı ödül P30 GM110702 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| superGolgi Kit | Bioenno Lifesciences | 30100 | Contains hazardous materials. |
| PBS 10x powder concentrate | Fisher | BP665-1 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| Permount | Fisher | SP 15-100 | |
| Slide cover | Fisher | 12-546-14 | |
| 7 mL Transfer pipette | Globe Scientific | 135030 | |
| 10 mL Falcon tubes | BD Biosciences | 352099 | |
| Foil | Fisher | 01-213-105 | |
| 12-well plate | BD Biosciences | 353043 | |
| 200 proof Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Xylene | Acros Organics | 1330-20-7 | Hazardous. |
| Permabond 200 | Permabond LLC | GF2492 | |
| 25 mL serological pipette | Sigma | SIAL1489 | |
| Parafilm | Midsci | HS234526C | |
| Vibratome | World Precision Instruments | NVSLM1 | |
| C57Bl/6 Male Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Axio Imager 2 | ZEISS | Multiple components, see website for details. | |
| AxioCam MRc Camera | ZEISS | 426508-9902-000 | |
| Staining Dish , Green | Tissue-Tek | 62541-12 | |
| Staining Dish Set | Electron Microscopy Sciences | 70312-20 | |
| Motorized Pipet Filler | Fisher | 03-692-168 | |
| Neurolucida | mbf Bioscience | ||
| Neurolucida Explorer | mbf Bioscience | ||
| Prism | GraphPad |
References
- Stuart, G. J., Spruston, N. Dendritic integration: 60 years of progress. Nat Neurosci. 18 (12), 1713-1721 (2015).
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
- Kulkarni, V. A., Firestein, B. L. The dendritic tree and brain disorders. Mol Cell Neurosci. 50 (1), 10-20 (2012).
- Kasai, H. Structural Dynamics of Dendritic Spines in Memory and Cognition. Trends Neurosci. 33 (3), 121-129 (2010).
- von Bohlen Und Halbach, O. Structure and function of dendritic spines within the hippocampus. Ann Anat. 191 (6), 518-531 (2009).
- Wayman, G. A., et al. Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2. Neuron. 50 (6), 897-909 (2006).
- Bourne, J. N., Harris, K. M. Balancing structure and function at hippocampal dendritic spines. Ann Rev Neurosci. 31, 47-67 (2008).
- Lai, K. O., Ip, N. Y. Structural plasticity of dendritic spines: the underlying mechanisms and its dysregulation in brain disorders. Biochim Biophys Acta. 1832 (12), 2257-2263 (2013).
- Harris, K. M. Structure, development, and plasticity of dendritic spines. Current Op Neurobiol. 9 (3), 343-348 (1999).
- Harris, K. M., Kater, S. B. Dendritic spines: cellular specializations imparting both stability and flexibility to synaptic function. Ann Rev Neurosci. 17, 341-371 (1994).
- Leuner, B., Shors, T. J. Stress, anxiety, and dendritic spines: what are the connections. Neuroscience. 251, 108-119 (2013).
- Harris, K. M., Fiala, J. C., Ostroff, L. Structural changes at dendritic spine synapses during long-term potentiation. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 358 (1432), 745-748 (2003).
- Kasai, H., Matsuzaki, M., Noguchi, J., Yasumatsu, N., Nakahara, H. Structure-stability-function relationships of dendritic spines. Trends Neurosci. 26 (7), 360-368 (2003).
- Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. The Golgi-Cox method. Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).
- Koyama, Y. The unending fascination with the Golgi method. OA Anat. 1 (3), 24 (2013).
- Pasternak, J. F., Woolsey, T. A. On the "selectivity" of the Golgi-Cox method. J Comp Neurol. 160 (3), 307-312 (1975).
- Friedland, D. R., Los, J. G., Ryugo, D. K. A modified Golgi staining protocol for use in the human brain stem and cerebellum. J Neurosci Methods. 150 (1), 90-95 (2006).
- Rosoklija, G., et al. Optimization of Golgi methods for impregnation of brain tissue from humans and monkeys. J Neurosci Methods. 131 (1-2), 1-7 (2003).
- de Castro, F., Lopez-Mascaraque, L., De Carlos, J. A.
- Gabbott, P. L., Somogyi, J. The "single" section Golgi-impregnation procedure: methodological description. J Neurosci Methods. 11 (4), 221-230 (1984).
- Zaqout, S., Kaindl, A. M. Golgi-Cox staining step by step. Front Neuroanat. 10 (38), (2016).
- superGolgi Kit. , Available from: http://www.ihcworld.com/products/ssdatasheets/superGolgi%20Kit%20Datasheet%20Protocol.pdf (2017).
- Vibroslice NVSL & Vibroslice NVSLM123. , Available from: https://www.wpiinc.com/clientuploads/pdf/NVSL_NVSLM1_IM.pdf (2000).
- Neurolucida 11.03. , MBF Bioscience. Williston, VT USA. (2017).
- Sholl, D. A. Dendritic organization in the neurons of the visual and motor cortices of the cat. J Anat. 87 (4), 387-406 (1953).
- Pillai, A. G., et al. Dendritic morphology of hippocampal and amygdalar neurons in adolescent mice is resilient to genetic differences in stress reactivity. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
- Morley, B. J., Mervis, R. F. Dendritic spine alterations in the hippocampus and parietal cortex of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor knockout mice. Neuroscience. 233, 54-63 (2013).
- Titus, A. D., et al. Hypobaric hypoxia-induced dendritic atrophy of hippocampal neurons is associated with cognitive impairment in adult rats. Neuroscience. 145 (1), 265-278 (2007).
- Groves, T. R., et al. 5-Fluorouracil chemotherapy upregulates cytokines and alters hippocampal dendritic complexity in aged mice. Behavioral Brain Research. 316, 215-224 (2017).
- Risher, W. C., Ustunkaya, T., Singh Alvarado, J., Eroglu, C. Rapid Golgi analysis method for efficient and unbiased classification of dendritic spines. PloS One. 9 (9), (2014).
- Kaufmann, W. E., Moser, H. W. Dendritic anomalies in disorders associated with mental retardation. Cerebral cortex. 10 (10), 981-991 (2000).
- Kulkarni, V. A., Firestein, B. L. The dendritic tree and brain disorders. Mol Cell Neurosci. 50 (1), 10-20 (2012).
