Summary
Här presenterar vi ett Golgi-Cox-protokoll i stor detalj. Den här pålitliga vävnadsfärgsmetoden möjliggör en högkvalitativ bedömning av cytoarkitekturen i hippocampus, och genom hela hjärnan, med minimal felsökning.
Abstract
Dendritiska ryggraden är utskjutningarna från de neuronala dendritiska axlarna som innehåller excitatoriska synapser. De morfologiska och förgrenande variationerna av neuronaldenditerna inom hippocampus är inblandade i kognitions- och minnesbildning. Det finns flera tillvägagångssätt för Golgi-färgning, som alla har varit användbara för att bestämma de morfologiska egenskaperna hos dendritiska arbors och ge en klar bakgrund. Den nuvarande Golgi-Cox-metoden (en liten variation av protokollet som är försedd med ett kommersiellt Golgi-färgkit) var utformat för att bedöma hur en relativt låg dos av det kemoterapeutiska läkemedlet 5-flurouracil (5-Fu) skulle påverka dendritisk morfologi , Antalet spines och komplexiteten hos arborisering inom hippocampus. 5-Fu-modulen signifikant modulerade den dendritiska komplexiteten och minskade ryggradens densitet genom hippocampuset på ett regionspecifikt sätt. Uppgifterna visar att Golgi-färgmetoden efFektivt färgade de mogna neuronerna i CA1, CA3 och dentilgyrus (DG) hos hippocampusen. Detta protokoll rapporterar detaljerna för varje steg så att andra forskare på ett tillförlitligt sätt kan fläcka vävnad genom hjärnan med högkvalitativa resultat och minimal felsökning.
Introduction
Dendriter är den största delen av neuroner som tar emot och behandlar presynaptisk ingång 1 . Deras dendritiska processer har en komplex geometri, där de proximala grenarna har en större diameter än de distala grenarna. När dendriter utvecklas bildar de flera samband med andra neuroner i en process som kallas dendritisk arborisering. Graden och mönstret för denna förgrening bestämmer mängden synaptiska ingångar som en dendrit kan behandla tillräckligt 2 .
Dendritisk arborisering är en nödvändig process för aktivitetsberoende plasticitet och korrekt utveckling av neuronkretsar. Förlängning, retraktion, förgrening och synaptogenes är invecklade processer som innefattar inneboende genetiska program och influenser från extrinsiska faktorer. De morfologiska och förgreningsvariationerna av neuronaldenditerna inom hippocampus är inblandade i kognitions- och minnesbildningF "> 3 , 4. Ändringarna i dendritisk komplexitet är associerade med patofysiologiska och beteendemässiga förändringar 5. Abnormaliteter är relaterade till flera sjukdomstillstånd, inklusive bräckligt X-syndrom och ned-syndrom 6 .
Dendritiska spines är de specialiserade subcellulära facken hos de dendritiska arborsna som får excitatorisk inmatning i centrala nervsystemet. Det finns tre morfologiska klasser av dendritiska ryggraden, med namnet på varje klass baserat på storlek och form: 1) svampspinsar, som har komplexa postsynaptiska densiteter med mer glutamatreceptorer än andra ryggraden 7 ; 2) Stubbiga spines, som saknar en stam; Och 3) tunna ryggraden, som består av en långsträckt smal stam och ett globärt huvud 8 . Dendritisk ryggradsvolymen används delvis för att definiera dem, med tunna ryggraden i allmänhet mindre (0,01 μm 3 3 ) 9 , 10 . Ryggraden stabiliseras med mognad. Till exempel, de tunna ryggraden antingen dra sig tillbaka efter några dagar eller utvecklas till svampspines. Alternativt är svampspindlarna relativt stabila och kan överleva under en längre tid. Styrkan hos neuronala förbindelser antas vara baserad på antalet spines och / eller deras volymer 11 , 12 , 13 .
Den klassiska Golgi-färgmetoden och dess modernare variationer har alla varit användbara för att undersöka dendritisk ryggradsmorfologi och densitet. En unik aspekt av Golgi-färgningen är att den slumpmässigt fläckar omkring 5% av de totala neuronerna, vilket möjliggör spårning av enskilda neuroner 14 , 15 . Även om den exakta mekanismen som Golgi methOd fläckar enskilda neuroner är fortfarande okända, principen för metoden är baserad på kristalliseringen av silverkromat (Ag 2 CrO 4 ) 16 , 17 . Det finns tre huvudtyper av Golgi-metoden: den snabba Golgi, Golgi-Cox och Golgi-Kopsch 18 , 19 . Alla tre metoderna börjar med en initial inkubationsfas i kromsalter i flera dagar till månader, men det finns vissa viktiga skillnader mellan dem. Den snabba Golgi använder osmiumtetroxid i det första steget, medan Golgi-Kopsch innehåller paraformaldehyd. Färgningen i både den snabba Golgi och Golgi-Kopsch följs av en inkubation i en 1-2% silvernitratlösning under ca 7 dagar. Golgi-Cox-metoden använder kvicksilverklorid och kaliumdikromat istället för silvernitrat och har en impregneringstid på 2-4 veckor. Vävnaderna snittas sedan och placeras snabbt i en utspädd ammoniakLösning följt av en fotografisk fixerare för avlägsnande av salter. Av de tre typerna anses Golgi-Cox-metoden vara bäst vid färgning av de dendritiska arborerna utan stor bakgrundsinterferens, delvis, eftersom kristallartefakterna inte uppträder på ytan av vävnaden (till skillnad från i den snabba Golgi-metoden) 17 , 20 , 21 .
Föreliggande metod är en liten variation av protokollet som tillhandahålls med ett kommersiellt Golgi-färgkit och utformades för att utvärdera hur en relativt låg dos av 5-Fu skulle påverka de dendritiska morfologiska egenskaperna och ryggradens densitet. Alla förvärvade uppgifter kan ge ytterligare inblick i hur kemoterapeutisk behandling påverkar neuronalkretsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experiment utfördes i enlighet med de etiska normer som godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid UAMS.
1. Djur och 5-Fu-injektionsparadigm
- Köp 6 månaders gamla manliga C57Bl6 / J vildtypande möss och hushåll dem under en konstant 12 h ljus / mörk cykel tills de når 1 år.
- Späd 5-Fu i 0,9% steril saltlösning. Använd 60 mg / kg som den önskade dosen per mus.
- Ge intraperitoneala injektioner av 5-Fu (en gång per vecka i tre veckor).
- Ge intraperitoneala injektioner runt samma tid på varje dag. Till exempel mellan 0900-1200 h.
- Euthanize djuren och extrahera hjärnorna 30 dagar efter den slutliga injektionen.
2. Eutanasi Procedure och Brain Extraction
- Håll kvar gnagaren och ta tag i svansen. Å andra sidan, placera tummen eller fingerfingeren på thE basen av gnagerns nacke. Tryck snabbt på gnagerns nacke och tryck framåt medan den andra handen håller svansen dra bakåt.
- Håll gnagen med en hand och den stora kirurgiska saxen med den andra. Placera gnagerns nacke mellan de två bladen och snabbt avkapa huvudet.
- Ta det avskilda mushuvudet och använd den fina saxen för att trimma pälsen ovanför skallen upp till ögonen. Sätt sedan saksens spetsar i varje ögonkontakt och stäng saxen med liten kraft.
- Använd vårsax för att klippa skallen till vänster och höger om hjärnbenet.
- Använd tång för att lyfta den del av skallen som omger cerebellum direkt upp och ner.
- Använd vårsaxen för att klippa längs midsagittallinjen på skallen.
- Använd tången för att lyfta resten av skallen från hjärnan.
- Använd en spatel och en sond för att skopa ut hjärnan i önskad behållare. Använda en rostfri sKotblad, skär varje hjärna längs midsagittalplanet. Utför följande Golgi-Cox-metod på högra hemisfärerna.
3. Golgi-färgning och vävnadsberedning
- Fördjupa de nyligen skördade halvhjärnorna i 5 ml kvicksilverbaserad lösning (lösning A från satsen) i ett 10 ml koniskt rör. Kvicksilverkloridlösningen är lättkänslig; Täcka röret med folie. Förvara provet i mörkret vid rumstemperatur.
OBS! Lösning A finns i satsen som anges i materialtabellen. Varning! Lösning A (även kallad kvicksilverkloridlösning) innehåller giftiga reagens, såsom kaliumdikromat, kvicksilverklorid och kaliumkromat. Använd skyddshandskar och arbeta i en avluftningsskydd. - Efter 1 dag, dekantera lösningen långsamt i en temporär behållare (till exempel en stor väghyta) och kassera den i en biobaserad avfallsbehållare. Fördjupa hjärnorna (fortfarande i de ursprungliga 10 ml koniska rören) med 5 mlKvicksilverkloridlösningen och returnera provet till mörkret vid rumstemperatur i ytterligare 13 dagar.
- Tillsätt 30 g efterimpregneringsbuffert till 90 ml destillerat eller avjoniserat vatten (dH 2 O). Fyll varje brunn i en 6-brunnsplatta med 6,5 ml av impregneringsbufferten, en brunn per hjärna
OBS: Efterimpregneringsbuffert tillhandahålls i satsen som anges i materialtabellen.- Efter 14 dagar (totalt) i kvicksilverkloridlösningen sköljs vävnaden med dH20 och överför dem sedan till plattor med 6 brunnar med postimpregneringsbuffert. Täck tallrikarna med folie och förvara dem vid rumstemperatur i mörkret.
- Pipettera efterimpregneringsbufferten efter 1 dag nedsänkning och förnya med färsk postimpregneringsbuffert; Lagra i 1 dag i mörkret vid rumstemperatur. Förvara detta vid 4 ° C i upp till 1 månad 22 .
4. Sektionering
- Märk 12-brunnsplåtarna på locket med siffror i stigande ordning från vänster till höger och uppåt.
- Förbered två eller tre 12-brunnsplattor per hjärna om du delar hela hjärnan.
- Märk toppen av varje 12-brunnsplåtlock med identifikationsnumret för hjärnans sektion.
- Pipettera 2 ml 1x PBS i varje brunn på varje platta.
- Ställ upp scenen och sätt på vibratomen; Se till att det finns tillräckligt med 1x PBS i behållaren för att täcka vävnaden.
- Skär två stycken plastparaffinfilm och vik dem över två gånger. Placera dem över hålen för provhållarens rattar för att förhindra att 1x PBS läcker ut på räknaren.
- Sätt tillbaka tejp på provhållarens vävnadsblock och sätt sedan ihop limet av cyanoakrylatlim (se tabell över material) på den.
- Ta bort hjärnan från 6-brunnsplattan och placera den på en plast- eller glasskål. Använd rostfrittStål dubbelkantat blad för att avskurna ungefär hälften av cerebellum.
- Klipp cerebellumet caudalt. Se till att den kvarvarande delen av cerebellum är jämn.
- Placera omedelbart den kvarvarande spetsen av det kvarvarande spetsen på limet.
OBS: Den dorsala delen av vävnaden (hjärnbarken) ska vända mot vänster eller höger i förhållande till bladet. Det rostrala änden som tidigare innehöll den olfaktoriska glödlampan som fästs ska vända uppåt.- Vänta minst några minuter för att se till att limet torkar helt.
- Medan limet som håller hjärnan på plats torkar, häll 1x PBS i provbadet. När limet är torrt, placera provhållaren med vävnaden i provbadet.
- Om vävnadsprovet inte är helt täckt, häll mer 1x PBS i provbadet.
- Fäst bladet på vibratomets bladhållare och sakta lLägg bladet i provbadet tills det är helt nedsänkt i 1x PBS. Fortsätt sänka bladet tills det ligger något under toppen av vävnaden.
- Ställ in vibratomhastigheten till 7, amplituden till 6 och skärvinkeln till 12 ° (se tabell över material för vibratomodell). Starta vibrationen och klippa 200 μm sektioner 23 .
- Använd en stor pensel för att flytta vävnadssektionerna från provbadet i varje utpekad brunn i 12-brunnsplåtarna.
- Fortsätt att skära vävnaden tills önskat antal vävnadssektioner uppnås.
5. Efterfärgning
- För varje av följande färgningssteg och sköljningar använd 2 ml av den angivna lösningen per brunn. Använd ett motoriserat pipettfyllmedel (se materialtabell) för att överföra lösningarna i brunnarna. Använd en överföringspipett (se tabell över material) för att överföra lösningar ur brunnarna och in i det korrekta avfalletbehållare.
- Skölj avsnitten i en 30 min tvätt av 0,01 M PBS-T (tillsätt 3,0 ml tvättmedel (se tabell över material) till 1000 ml 0,01 M PBS).
- Späd ammoniumhydroxidlösning (Varning) 3: 5 i volym med dH 2 O omedelbart före användning. Färga sektionerna i den utspädda ammoniumhydroxidlösningen under 19-21 min.
- Skydda den ljuskänsliga ammoniumhydroxidlösningen med folie.
OBS: Ammoniumhydroxid inom lösningen har en koncentration av ~ 10% och det klassificeras som "farligt". Ammoniumhydroxidlösning kan orsaka brännskador om den kommer i kontakt med huden. Det kan orsaka irritation av andningsorganen vid inandning. Använd skyddshandskar och arbeta i en avluftningsskydd.
- Skydda den ljuskänsliga ammoniumhydroxidlösningen med folie.
- Färga sektionerna i efterfärgningsbufferten (sätt 90 g reagens D i 500 ml dH 2 O) i 19-21 min. Efterfärgningsbufferten är ljuskänslig; Skydda den med folie 22 .
- Skölj avdelningarna i tre, 5-10 min tvättar på 0,01 M PBS-T.
6. Montering, rengöring och täckning
- Montera sektionerna på 1% gelatinbelagda objektglas med den stora penseln. Låt dem torka i 20-30 minuter vid rumstemperatur och placera dem sedan i en Coplinburk över natten.
- Ta bort glidglasen med handsken från Coplinburken och placera dem i en plasthylla (se materialtabell). Placera plaststället i färgningsskålen (se tabell över material) innehållande 100% etanol. Dehydrera dem med tre 5 min tvättar.
- Tvätta bilderna två gånger i 5 minuter vardera i 99% xylen. Placera objektglasen i ett glasskivor och sänk stativet i en glasfärgskål som innehåller xylen med ett metallhandtag (se materialtabell).
OBS! Varning Xylen är skadligt vid inandning och orsakar irritation om den berör huden. Det är mycket brandfarligt i flytande och ångtillstånd. Använd skyddshandskar och arbeta i en avluftningsskydd. - Ta bort bilderna från xylenEn i taget och täck snabbt vävnaden med ~ 0,25 ml monteringsmedia (se materialbord). Ta sedan bildskyddet och lägg dem över media.
- Skjut in några fångade luftbubblor under glidkåpan till kanten med ett trubbigt föremål, såsom en pensels ände.
- Placera bilderna i ett område borta från solljus och låt dem torka i 2-3 dagar.
- Fortsätt att skaffa bilder med hjälp av ett mikroskop och analysera med lämplig programvara.
7. Skaffa bildstack
- Öppna bildprogrammet (se materialtabellen ). Placera bilden på mikroskopets stadium. På menyn längst upp i programmet klickar du på "Acquisition" och klickar sedan på "Live Image."
- Sätt mikroskopet till 10X. Identifiera neuron av preferens och sedan placera markören, som verkar som en röd X, i mitten av summan. Vänster klicka för att ställa in referenspunkten.
- Sätt mikroskopet till 40X. Klicka på "Flytta" från menyn längst upp i programmet och klicka sedan på "Till referenspunkt".
- Börja skapa bildstapeln genom att manuellt rulla med det fina målet ovanför vävnaden tills det är något ur fokus.
- Klicka på "Set Top" i det nedre högra hörnet av programmet under rubriken "Image Acquisition."
- Bläddra något under vävnaden tills det är något ur fokus och klicka sedan på "Set Bottom" under "Image Acquisition." Klicka sedan på "Acquire Image Stack."
- Efter att bildstapeln har förvärvats, skriv det önskade namnet för bildfilen i fönstret som visas. Spara som "MBF Ascii-fil."
- När du uppmanas väljer du filtypen som "MBF JPEG2000 stapelfil" och klickar sedan på "Spara".
8. Neuronal spårning
- I verktygetR under menyn, klicka på rutan med titeln "Kontour Name". Välj "Soma" i rullgardinsmenyn.
- Manuellt spåra soma. Högerklicka sedan och välj "Slutför cellkroppen" när spårningen är klar.
- Välj "AutoNeuron" för att få fram en annan flik med titeln "AutoNeuron Workflow."
- Under "Konfigurationstyp" väljer du "Ny". Ställ parametrarna och klicka sedan på "Nästa steg" för att få upp "Soma Detection" underrubrik.
- För att ställa in parametrarna, välj "Brightfield". Därefter klickar du på "Startmätning" under "Max processdiameter". Med markören går du till basen av dendritet och ställer in diametern manuellt.
- Klicka på "Ja" i fönstret som begär att användaren spårar hela bilden. Manuellt spåra soma. Unclick och klicka sedan på "Nästa steg" för att hämta "Seed Placement" underrubrik.
- Klicka på "Bekräfta utsädeS "och klicka sedan på" Nästa steg "för att få upp" Neuron Reconstruction "underrubrik.
- Under "Neuron" klickar du på "Interaktiv". Utför interaktiv spårning genom att följa riktningen från programmet för dendrit och högerklicka för att slutföra det markerade området som spåras av programmet. Efter spårning av alla dendriter, klicka på "Nästa steg".
- När ett nytt fönster visas, spara den nya konfigurationen med önskad titel. Klicka på "Spara".
9. Analys
- Öppna analysprogrammet (se materialtabellen).
- Klicka på "File" från toppmenyn och klicka sedan på "Öppna datafil". Välj filen av intresse.
- Under analysunderrubriket väljer du "Sholl Analysis."
- I fönstret "Sholl Analysis" ställer du in startradien till 10 μm. Under "Analys" klickar du på rutorna "Dendrites" och "Branch Orders".
- Höger clIck de nyöppnade windows och klicka på "Excel Export." Klicka på "Spara".
- Under analysen klickar du på "Grenad strukturanalyser". Välj "Alla möjliga analyser".
- Högerklicka på det nyöppnade fönstret och klicka på "Excel Export" 24 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effekterna av 5-Fu-behandlingen på den dendritiska arboriseringen och komplexiteten i hippocampus av Golgi-färgade hjärnsektioner kvantifierades och spårades med användning av en kommersiellt tillgänglig bildhanteringsprogramvara. Efter spårning analyserades den dendritiska arboriseringen, ryggradens densitet och ryggradsmorfologin med användning av Sholl-analys och det dendritiska komplexitetsindexet (DCI). Shollanalys är en kvantitativ analysmetod som kan användas för att bestämma dendritisk arbormorfologi 25 . Från och med soma överlagrar cirklarna 10 μm från varandra de dendritiska spåren. Dendriternas längd bestäms av antalet cirklar som dendriterna korsar över. Bränslepunktsanalysen, en metod för att fastställa komplexiteten hos en dendritisk trädborrning, är baserad på det totala antalet och ordningen av grenpunkter.
En grenpunkt definieras som när aGren splittras i två delgrenar. Filialordern är ett mått på komplexiteten baserat på hur många gånger filialerna delar sig. Till exempel skulle en första ordningens grenpunkt vara den ursprungliga dendriten som sträcker sig från soma, medan en andra ordergrenpunkt skulle vara den punkt vid vilken filialen delas in i två delgrenar. Genom att undersöka både grenpunkterna och filialordern, är komplexiteten hos den dendritiska trädborrningen (baserat på antalet grenpunkter) och vid vilka punkter förgreningen sker (en mindre grenorder ligger närmare summan medan en större grenorder är Längre från summan) kan bestämmas. Dessa parametrar användes på DCI. CA1 och CA3 delades in i apikala och basala delar och analyserades oberoende av 26 , 27 .
Dendriterna av CA1- och CA3-pyramidala neuronerna och granule-neuronerna i generaldirektoratet analyserades. Alla neuroner valdes foR varje experimentgrupp uppfyllde följande kriterier: 1) dendriterna hade mörk och konsekvent Golgifärgning över hela sin längd, 2) dendriterna var synligt inaktiva och 3) varje neuron hade tillräckligt med utrymme mellan dem för att förhindra störningar under analysen 28 . Figur 1 visar en neuron som uppfyller ovanstående kriterier. Data uttrycktes som medelvärde ± SEM. För att bestämma de statistiska skillnaderna mellan sham och 5-Fu-grupperna användes en parvis två-tailed t- test. Alla statistiska analyser utfördes med hjälp av analytisk mjukvara (se tabell över material) och p <0,5 ansågs betydande. En variansanalys av varians (ANOVA) användes för att utvärdera effekterna av 5-Fu-behandlingen och Sholl-raden. Fisher LSD post-hoc tester användes efter ANOVA vid behov 29 .
I båda CA 1 ( t = 7,68, p <0,01, Figur 2A ) och CA3 ( t = 7,54, p <0,01; Figur 3A ) apikala pyramidaldenditer, var det en signifikant total reduktion i ryggrad efter 5-Fu-behandlingen. Medan 5-Fu-behandlingen inte signifikant påverkar den alkaliska ryggradens densitet hos CA1 ( t = 1,79, p = 0,15, Figur 2 B ) minskade den signifikant CA3-basala pyramidala dendritiska ryggraden ( t = 5,57, p <0,05; B ). Vidare visade Fisher LSD post-hoc-testen en minskning av den dendritiska arboriseringen av CA1-apikala pyramidaldenditerna vid 40-100 ^ im (Fishers LSD, p <0,001, Figur 2C) och 130-160 ^ im (Fishers LSD, p < 0,05;Ig "> Figur 2 C ) bort från summan jämfört med de saltbehandlade kontrollerna. Ett liknande fenomen ses i CA1-basala apikala dendriter vid 30-60 ^ im (Fishers LSD, p <0,001, Figur 2 D ) och 70-110 Μm (Fisher's LSD, p <0,05; Figur 2 D ) bort från soma 29 .
När det gäller CA3-apikala pyramidaldenditer var det inte någon signifikant skillnad i segmentdendritisk längd efter 5-Fu-behandlingen jämfört med de saltbehandlade kontrollerna ( F (28,87) = 0,91; p = 0,59; Figur 3C ). För de CA3 basala pyramidala dendriterna var emellertid en signifikant skillnad mellan 5-Fu-behandlingen och de saltbehandlade kontrollerna i segmentdendritisk längd ( F (25, 78) =1,85; P <0,05; Figur 3 D ). Fishers LSD avslöjade att 5-Fu-behandlingen minskade den dendritiska arboriseringen vid 90-100 μm ( p <0,01, Figur 3 D ), 70-80 μm och 110-120 μm (Fisher's LSD, p <0,05; Figur 3 D ) Borta från soma 29 .
För att bestämma den dendritiska komplexiteten användes en grenorderanalys för att jämföra 5-Fu-behandlade och saltlösningsbehandlade kontrollgrupperna. Inom generaldirektoratet visade filialorderanalysen en signifikant skillnad mellan varje behandlings- och grenordning ( F (8, 36) = 25,61, p <0,001; Figur 4 ). Detta analyserades ytterligare med hjälp av Fishers LSD, vilket indikerade att det fanns en minskad längd vid 4: e och 6: eOrder efter 5-Fu behandling ( p <0.001; Figur 4 ) 29 .
Figur 1 : Golgi-färgad neuron som representerar kriterierna för avbildning och ytterligare analys. Alla tre ryggradstyper kan lätt ses efter Golgi-färgningen. Staining är konsekvent över hela längden av dendrit och dendriten är isolerad från andra neuroner. Skala bar, 5 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2 : Golgi färgad n Euroner visade signifikanta skillnader i ryggradens densitet mellan de 5-Fu behandlade och de saltbehandlade grupperna i den apikala CA1 men inte den basala CA1. Det var en signifikant skillnad i ryggradslängden mellan 5-Fu behandlade och saltlösningsbehandlade grupper i både apikal och basal CA1. ( A ) I CA1-apikala pyramidaldendriterna minskade 5-Fu signifikant ryggradens densitet. ( B ) I de basala dendriterna fanns inga signifikanta förändringar i den totala densiteten hos ryggraden. ( C ) Sholl-analys visade att 5-Fu-behandlingen signifikant minskade dendritisk arborisering vid 40-100 μm och 130-160 μm bort från soma i CA1-apikala pyramidaldendriter. ( D ) I basaldendriterna minskade 5-Fu-behandlingen den dendritiska arboriseringen vid 30-60 μm och 70-110 μm bort från soma. Genomsnitt ± SEM (n = 6). * P <0,05; ** p <0,01, ANOVA 29 .= "Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55696/55696fig2large.jpg" target = "_ blank"> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3 : Golgi-färgade neuroner demonstrerade signifikanta skillnader i ryggradens densitet mellan 5-Fu-behandlade och saltlösningsbehandlade grupper i både apikal och basal CA3. Det var en signifikant skillnad i ryggradslängden mellan 5-Fu behandlade och saltlösningsbehandlade grupper i apical CA3, men inte basal CA3. ( A ) I CA3-apikala pyramidaldendriterna minskade 5-Fu signifikant ryggradens densitet. ( B ) I de basala dendriterna minskade 5-Fu signifikant den totala densiteten hos ryggraden. ( C ) Det var ingen signifikant effekt av 5-Fu behandling i CA 3 apikala området. ( D ) I de basala dendriterna, 5-Fu treaTment minskade dendritisk arborisering 70-120 μm bort från soma. Genomsnitt ± SEM (n = 6). *, P <0,05; **, p <0,01, ANOVA 29 . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4 : Golgi-färgade neuroner inom generaldirektoratet visade minskad längd vid den 4: e och 6: e ordningen efter 5-Fu-behandling jämfört med den saltbehandlade gruppen. Längd per grenordning i pyramidala neuroner i CA1 hippocampala regionen. Genomsnitt ± SEM (n = 6). * P <0,05; ** p <0,01, ANOVA 29 . GrundenSe klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Jämfört med modernare tekniker har Golgi-Cox-metoden flera fördelar som gör den till den föredragna metoden för att undersöka ryggradsmorfologi: 1) Färgningen kan användas för väsentligen vilken vävnad, 2) Ett grundläggande ljusmikroskopinställning är allt som behövs för att Förvärva Golgi-baserade bilder, 3) Golgi-Cox-avbildning är snabbare än konfokal avbildning, och 4) Golgi-färgade sektioner är genomförbara i flera månader till år längre än prover som är fluorescensmärkta. Även med dessa fördelar har Golgi-Cox-metoden fortfarande vissa begränsningar. För det första är hela processen mycket tidskrävande, vilket kräver flera veckor av färgning följt av analys av bilderna. Som det ses med detta protokoll, tar det 14 dagar i lösning A och 1 dag i lösning B innan sektionen kan börja. Dessutom, utförande av sektioner, efterfärgning och montering tar 2-3 timmar per hjärna. Varje bildruta måste torka i 1 dag före rengöring och täcka dem. Efter vilken tid tidDet kommer att ta till bild och analysera sektionerna beror på individen. För det andra kan det finnas problem med konsekvens mellan data från analytiker på grund av skillnader i kategorisering av spines 30 . Av denna anledning rekommenderas att en person utför bild- och analysdelen av varje experiment, vilket ytterligare förlänger tiden för att projektet ska slutförts.
Det finns flera kritiska steg i Golgi-Cox-metoden som kräver exakt timing och uppmärksamhet. Vid färgning av sektionerna med ammoniumhydroxidlösningen är det absolut nödvändigt att sektionerna kvarstår i lösningen i minst 19 minuter, men inte över 21 minuter. Om sektionerna inte finns i ammoniumhydroxidlösningen för tillräckligt med tid kommer de inte att vara ordentligt färgade, vilket innebär att neuronerna kommer att se mindre definierade vid bildbehandling, vilket gör det svårare att analysera dem. Om delarna finns i ammoniumhydroxidlösningen i över 21 minuter kan de bli ovEr-färgad, vilket gör det svårt att identifiera de enskilda neuronerna. Därför måste forskaren flytta snabbt när lösningarna utlöses. Ett annat viktigt steg är överföringen av sektionerna på objektglas. Innan du flyttar sektionerna med den stora penseln är det bäst att först lägga en liten mängd av PBS-T på bilden. Detta gör att sektionerna enkelt kan placeras på glidbanan och manövreras utan att eventuellt brytas. Ett mer kritiskt steg är torkningssteget efter att sektionerna är placerade på en bild. Om glidbanorna inte torkar i minst 20 minuter vid rumstemperatur, kommer vissa avdelningar sannolikt att falla av under dehydratiseringsstegen. Om glidorna torkar längre än 30 min, kommer de troligen att bli spröda och bryta isär under dehydratiseringsstegen.
När du utför denna procedur finns det vissa steg som kan vara besvärliga. Till exempel, om hela cerebellum är avskuret innan du placerar hjärnan på specImenhållaren och snittet, kan hjärnan spricka ifrån varandra innan generaldirektoratet är fullständigt snittat vilket gör några ytterligare avsnitt oanvändbara. Därför är det viktigt att endast skära caudalt genom ungefär hälften av cerebellum. Ett annat steg som kan påverka sektionerna negativt är vibratomhastigheten och amplituden. Medan de rekommenderade inställningarna är för respektive 7 respektive 6, kan vissa sektioner sönderfalla i PBS vid skurning eller visas ojämnt. För att korrigera detta, justera antingen vibratomhastigheten eller amplituden, en i taget tills sektionerna är in-takt och jämn, mellan inställningarna 6-8.
Även om kommersiella kits för Golgi-färgning är tillgängliga saknar de ofta exakta detaljer för varje enskilt steg. Med detta protokoll rapporterar vi i detalj alla steg som användes för att tillåta andra laboratorier att på ett tillförlitligt sätt fläcka vävnad av hög kvalitet med minimal felsökning. Materialen som används är tillgängliga för de flesta neurovetenskapslaboratorier. Aberrations i dendrit morpHologi och förändringar i antalet dendritiska ryggraden är relaterade till en mängd neurologiska sjukdomar 31 . Vidare kan dessa störningar av den dendritiska arboriseringen representera ett signifikant morfologiskt kännetecken för den kemoterapiinducerad skada i hjärnan 32 . I framtiden kommer vi att undersöka hur de strukturella förändringar som induceras av 5-Fu kan relatera till beteendemässiga, cellulära och molekylära förändringar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett pilotbidrag enligt NIH P20 GM109005 (ARA) och av Center for Translational Neuroscience IDeA-programpriset P30 GM110702.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| superGolgi Kit | Bioenno Lifesciences | 30100 | Contains hazardous materials. |
| PBS 10x powder concentrate | Fisher | BP665-1 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| Permount | Fisher | SP 15-100 | |
| Slide cover | Fisher | 12-546-14 | |
| 7 mL Transfer pipette | Globe Scientific | 135030 | |
| 10 mL Falcon tubes | BD Biosciences | 352099 | |
| Foil | Fisher | 01-213-105 | |
| 12-well plate | BD Biosciences | 353043 | |
| 200 proof Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Xylene | Acros Organics | 1330-20-7 | Hazardous. |
| Permabond 200 | Permabond LLC | GF2492 | |
| 25 mL serological pipette | Sigma | SIAL1489 | |
| Parafilm | Midsci | HS234526C | |
| Vibratome | World Precision Instruments | NVSLM1 | |
| C57Bl/6 Male Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Axio Imager 2 | ZEISS | Multiple components, see website for details. | |
| AxioCam MRc Camera | ZEISS | 426508-9902-000 | |
| Staining Dish , Green | Tissue-Tek | 62541-12 | |
| Staining Dish Set | Electron Microscopy Sciences | 70312-20 | |
| Motorized Pipet Filler | Fisher | 03-692-168 | |
| Neurolucida | mbf Bioscience | ||
| Neurolucida Explorer | mbf Bioscience | ||
| Prism | GraphPad |
References
- Stuart, G. J., Spruston, N. Dendritic integration: 60 years of progress. Nat Neurosci. 18 (12), 1713-1721 (2015).
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
- Kulkarni, V. A., Firestein, B. L. The dendritic tree and brain disorders. Mol Cell Neurosci. 50 (1), 10-20 (2012).
- Kasai, H. Structural Dynamics of Dendritic Spines in Memory and Cognition. Trends Neurosci. 33 (3), 121-129 (2010).
- von Bohlen Und Halbach, O. Structure and function of dendritic spines within the hippocampus. Ann Anat. 191 (6), 518-531 (2009).
- Wayman, G. A., et al. Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2. Neuron. 50 (6), 897-909 (2006).
- Bourne, J. N., Harris, K. M. Balancing structure and function at hippocampal dendritic spines. Ann Rev Neurosci. 31, 47-67 (2008).
- Lai, K. O., Ip, N. Y. Structural plasticity of dendritic spines: the underlying mechanisms and its dysregulation in brain disorders. Biochim Biophys Acta. 1832 (12), 2257-2263 (2013).
- Harris, K. M. Structure, development, and plasticity of dendritic spines. Current Op Neurobiol. 9 (3), 343-348 (1999).
- Harris, K. M., Kater, S. B. Dendritic spines: cellular specializations imparting both stability and flexibility to synaptic function. Ann Rev Neurosci. 17, 341-371 (1994).
- Leuner, B., Shors, T. J. Stress, anxiety, and dendritic spines: what are the connections. Neuroscience. 251, 108-119 (2013).
- Harris, K. M., Fiala, J. C., Ostroff, L. Structural changes at dendritic spine synapses during long-term potentiation. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 358 (1432), 745-748 (2003).
- Kasai, H., Matsuzaki, M., Noguchi, J., Yasumatsu, N., Nakahara, H. Structure-stability-function relationships of dendritic spines. Trends Neurosci. 26 (7), 360-368 (2003).
- Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. The Golgi-Cox method. Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).
- Koyama, Y. The unending fascination with the Golgi method. OA Anat. 1 (3), 24 (2013).
- Pasternak, J. F., Woolsey, T. A. On the "selectivity" of the Golgi-Cox method. J Comp Neurol. 160 (3), 307-312 (1975).
- Friedland, D. R., Los, J. G., Ryugo, D. K. A modified Golgi staining protocol for use in the human brain stem and cerebellum. J Neurosci Methods. 150 (1), 90-95 (2006).
- Rosoklija, G., et al. Optimization of Golgi methods for impregnation of brain tissue from humans and monkeys. J Neurosci Methods. 131 (1-2), 1-7 (2003).
- de Castro, F., Lopez-Mascaraque, L., De Carlos, J. A.
- Gabbott, P. L., Somogyi, J. The "single" section Golgi-impregnation procedure: methodological description. J Neurosci Methods. 11 (4), 221-230 (1984).
- Zaqout, S., Kaindl, A. M. Golgi-Cox staining step by step. Front Neuroanat. 10 (38), (2016).
- superGolgi Kit. , Available from: http://www.ihcworld.com/products/ssdatasheets/superGolgi%20Kit%20Datasheet%20Protocol.pdf (2017).
- Vibroslice NVSL & Vibroslice NVSLM123. , Available from: https://www.wpiinc.com/clientuploads/pdf/NVSL_NVSLM1_IM.pdf (2000).
- Neurolucida 11.03. , MBF Bioscience. Williston, VT USA. (2017).
- Sholl, D. A. Dendritic organization in the neurons of the visual and motor cortices of the cat. J Anat. 87 (4), 387-406 (1953).
- Pillai, A. G., et al. Dendritic morphology of hippocampal and amygdalar neurons in adolescent mice is resilient to genetic differences in stress reactivity. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
- Morley, B. J., Mervis, R. F. Dendritic spine alterations in the hippocampus and parietal cortex of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor knockout mice. Neuroscience. 233, 54-63 (2013).
- Titus, A. D., et al. Hypobaric hypoxia-induced dendritic atrophy of hippocampal neurons is associated with cognitive impairment in adult rats. Neuroscience. 145 (1), 265-278 (2007).
- Groves, T. R., et al. 5-Fluorouracil chemotherapy upregulates cytokines and alters hippocampal dendritic complexity in aged mice. Behavioral Brain Research. 316, 215-224 (2017).
- Risher, W. C., Ustunkaya, T., Singh Alvarado, J., Eroglu, C. Rapid Golgi analysis method for efficient and unbiased classification of dendritic spines. PloS One. 9 (9), (2014).
- Kaufmann, W. E., Moser, H. W. Dendritic anomalies in disorders associated with mental retardation. Cerebral cortex. 10 (10), 981-991 (2000).
- Kulkarni, V. A., Firestein, B. L. The dendritic tree and brain disorders. Mol Cell Neurosci. 50 (1), 10-20 (2012).
