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Neuroscience

Valutazione della complessità dendritica ippocampale nei topi invecchiati utilizzando il metodo Golgi-Cox

Published: June 22, 2017 doi: 10.3791/55696
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2, 1,2,3
1Division of Radiation Health, University of Arkansas for Medical Sciences, 2Department of Pharmaceutical Sciences, University of Arkansas for Medical Sciences, 3Neurobiology & Developmental Sciences, University of Arkansas for Medical Sciences

Summary

Qui presentiamo un protocollo Golgi-Cox in dettagli estesi. Questo metodo affidabile di macchie di tessuto consente una valutazione di alta qualità della cytoarchitettura nell'ippocampo, e in tutto il cervello, con una minima risoluzione dei problemi.

Abstract

Le spline dendritiche sono le protuberanze degli alberi dendritici neuronali che contengono sinapsi eccitatoriali. Le variazioni morfologiche e ramificanti dei dendriti neuronali all'interno dell'ippocampo sono implicati nella formazione della cognizione e della memoria. Ci sono diversi approcci alla colorazione Golgi, tutti utili per determinare le caratteristiche morfologiche degli archi dendritici e produrre uno sfondo chiaro. L'attuale metodo Golgi-Cox, (una leggera variazione del protocollo fornito con un kit di colorazione Golgi commerciale), è stato progettato per valutare come una dose relativamente bassa del farmaco chemioterapico 5-flurouracil (5-Fu) avrebbe influenzato la morfologia dendritica , Il numero di spine e la complessità dell'arborizzazione all'interno dell'ippocampo. Il 5-Fu ha significativamente modulato la complessità dendritica e ha ridotto la densità della colonna vertebrale in tutto l'ippocampo in un modo specifico della regione. I dati presentati mostrano che il metodo di colorazione Golgi efHa colorato esattamente i neuroni maturi nel CA1, nel CA3 e nel dentato gyrus (DG) dell'ippocampo. Questo protocollo riporta i dettagli di ogni passaggio in modo che altri ricercatori possano affidare affidabilmente il tessuto in tutto il cervello con risultati di alta qualità e minima risoluzione dei problemi.

Introduction

I dendriti sono la parte più grande dei neuroni che ricevono e trattano l'input presinaptico 1 . I loro processi dendritici hanno una geometria complessa, in cui i rami prossimi hanno un diametro maggiore rispetto ai rami distali. Come sviluppano i dendriti, formano diversi collegamenti con altri neuroni in un processo denominato arborizzazione dendritica. L'estensione e il modello di questa ramificazione determina la quantità di input sinaptici che un dendrite può elaborare adeguatamente 2 .

L'arborizzazione dendritica è un processo necessario per la plasticità dipendente dall'attività e lo sviluppo appropriato dei circuiti neuronali. L'estensione, la retrazione, la ramificazione e la sinaptogenesis sono processi intricati che includono programmi genetici intrinseci e influenze da fattori estrinseci. Le variazioni morfologiche e ramificanti dei dendriti neuronali all'interno dell'ippocampo sono implicati nella formazione della cognizione e della memoriaF "> 3 , 4. Le alterazioni della complessità dendritica sono associate a alterazioni fisiopatologiche e comportamentali 5. Le anomalie sono legate a diversi stati malattie, tra cui la sindrome del X fragile e la sindrome di Down 6 .

Le spine dendritiche sono gli scompartimenti subcellulari specializzati degli archi dendritici che ricevono entità eccitatorie all'interno del sistema nervoso centrale. Ci sono tre classi morfologiche di spine dendritiche, con il nome di ciascuna classe basata sulla loro dimensione e forma: 1) spine di funghi, che hanno densità postinaptica complesse con più recettori di glutammato rispetto alle altre spine 7 ; 2) spine stubby, che non hanno uno stelo; E 3) spine sottili, che sono costituite da uno stelo protratto e stretto e da una testa a globo 8 . Il volume della spina dendritica viene utilizzato in parte per definirli, con spine sottili generalmente più piccole (0.01 μm 3 3 ) 9 , 10 . Le spine si stabilizzano con la maturazione. Ad esempio, le spine sottili ritirarsi dopo pochi giorni o svilupparsi in spine fungine. In alternativa, le spine del fungo sono relativamente stabili e possono sopravvivere per un lungo periodo di tempo. La forza delle connessioni neuronali si basa sul numero di spine e / o sul loro volume 11 , 12 , 13 .

Il classico metodo di colorazione Golgi e le sue variazioni più moderne sono state utili per esaminare la morfologia e la densità della spina dendritica. Un aspetto unico della colorazione Golgi è che macchia casualmente circa il 5% dei neuroni totali, che permette la traccia dei singoli neuroni 14 , 15 . Anche se l'esatto meccanismo in cui il metodo GolgiOd di macchie di singoli neuroni è ancora sconosciuto, il principio del metodo è basato sulla cristallizzazione del cromato d'argento (Ag 2 CrO 4 ) 16 , 17 . Ci sono tre tipi principali del metodo Golgi: il Golgi rapido, il Golgi-Cox e il Golgi-Kopsch 18 , 19 . Tutti e tre i metodi iniziano con una fase iniziale di incubazione nei sali di cromo per diversi giorni a mesi, ma esistono alcune differenze fondamentali tra loro. Il rapido Golgi usa il tetroxido di osmium nel primo passaggio, mentre il Golgi-Kopsch include la paraformaldeide. La colorazione sia nel rapido Golgi che nel Golgi-Kopsch è seguita da un'incubazione in soluzione nitrato d'argento 1-2% per circa 7 giorni. Il metodo Golgi-Cox utilizza il cloruro di mercurio e il bicromato di potassio anziché il nitrato d'argento e ha un tempo di impregnazione di 2-4 settimane. I tessuti vengono quindi sezionati e posizionati rapidamente in una ammoniaca diluitaSoluzione, seguita da un fissatore fotografico per rimuovere sali. Tra i tre tipi, il metodo Golgi-Cox è considerato il più adatto alla colorazione degli archi dendritici senza molte interferenze di fondo, in parte perché gli artefatti cristallini non si verificano sulla superficie del tessuto (a differenza del metodo rapido Golgi) 17 , 20 , 21 .

Il metodo presente è una leggera variazione del protocollo fornito con un kit di colorazione commerciale Golgi ed è stato progettato per valutare come una dose relativamente bassa del 5-Fu influenzerebbe le caratteristiche morfologiche dendritiche e la densità della colonna vertebrale. Tutti i dati acquisiti potrebbero fornire ulteriori informazioni sul modo in cui il trattamento chemioterapico influenza la circuiteria neuronale.

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Protocol

Gli esperimenti sono stati condotti secondo gli standard etici approvati dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali a UAMS.

1. Animali e 5 paradigmi di iniezione

  1. Acquistare i maschi di tipo maschio C57Bl6 / J di 6 mesi e di alloggiarli sotto un ciclo di luce / buio costante da 12 h fino a quando non raggiungono 1 anno di età.
  2. Diluire la 5-Fu in soluzione salina sterile del 0.9%. Utilizzare 60 mg / kg come dose necessaria per mouse.
  3. Dare le iniezioni intraperitoneali del 5-Fu (una volta alla settimana per tre settimane).
    1. Date le iniezioni intraperitoneali attorno allo stesso tempo ogni giorno. Ad esempio, tra 0900-1200 h.
  4. Eutanizzare gli animali e estrarre il cervello 30 giorni dopo l'iniezione finale.

2. Procedura di eutanasia e estrazione del cervello

  1. Restringere il roditore e afferrare la base della coda. Con l'altra mano, posizionare il pollice o il primo dito a thBase del collo del roditore. Rapidamente mettere pressione sul collo del roditore e spingere in avanti mentre l'altra mano che tiene la coda tira indietro.
  2. Tenere il roditore con una mano e le grandi forbici chirurgiche con l'altra. Posizionare il collo del roditore tra le due lame e decapitare rapidamente la testa.
  3. Prendi la testa del mouse tagliata e usa le forbici belle per tagliare la pelliccia sopra il cranio, fino agli occhi. Quindi posizionare le punte delle forbici in ciascuna presa d'occhio e chiudere le forbici con una leggera forza.
  4. Usare forbici a molla per tagliare il cranio a sinistra ea destra del cervelletto.
  5. Usare la pinza per sollevare la parte del cranio che circonda il cervelletto direttamente e in su.
  6. Utilizzate le forbici a molla per tagliare lungo la linea midsagittale del cranio.
  7. Utilizzare la pinza per sollevare la parte rimanente del cranio dal cervello.
  8. Utilizzare una spatola e una sonda per scavare il cervello nel contenitore desiderato. Utilizzando un inoxLa lama di teel, taglia ogni cervello lungo il piano midsagittale. Eseguire il seguente metodo Golgi-Cox sugli emisferi destro.

3. Golgi colorazione e preparazione dei tessuti

  1. Immergere i semi-cervelli appena raccolti in 5 ml di soluzione a base di cloruro di mercurio (soluzione A dal kit) in un tubo conico da 10 ml. La soluzione di cloruro di mercurio è sensibile alla luce; Coprire il tubo con la pellicola. Conservare il campione al buio a temperatura ambiente.
    NOTA: La soluzione A è fornita nel kit elencato nella tabella dei materiali. Attenzione! La soluzione A (chiamata anche soluzione di cloruro di mercurio) contiene reagenti tossici quali il bicromato di potassio, il cloruro di mercurio e il cromato di potassio. Indossare guanti protettivi e lavorare in un cappuccio.
  2. Dopo 1 giorno, decanta lentamente la soluzione in un contenitore temporaneo (ad esempio una grande imbarcazione pesata) e smaltire in un contenitore di rifiuti a rischio biologico. Immergere i cervelli (ancora nei tubi conici originali da 10 mL) con 5 ml diLa soluzione di cloruro di mercurio e restituisce il campione al buio a temperatura ambiente per altri 13 giorni.
  3. Aggiungere 30 g di tampone post-impregnazione a 90 mL di acqua distillata o deionizzata (dH 2 O). Riempire ogni pozzetto di una piastra a 6 pozzetti con 6,5 ml del tampone post-impregnazione, un pozzetto per cervello
    NOTA: Il buffer di post impregnazione è fornito nel kit elencato nella tabella dei materiali.
    1. Dopo 14 giorni (in totale) nella soluzione di cloruro di mercurio, sciacquare il tessuto con dH 2 O, quindi trasferirli in piatti a 6 pozzetti con tampone post-impregnazione. Coprire le lastre con la pellicola e conservarle a temperatura ambiente al buio.
  4. Pipettare il tampone post-impregnazione dopo 1 giorno di immersione e rinnovare con il tampone di impregnazione fresco; Memorizzare per 1 giorno al buio a temperatura ambiente. Se necessario, conservare questo a 4 ° C per un massimo di 1 mese 22 .

4. Sezione

  1. Etichettare i piatti a 12 pozzetti sui loro coperchi con i numeri in ordine crescente da sinistra a destra e verso l'alto.
  2. Preparare due o tre piatti da 12 pozzetti per cervello se si taglia l'intero cervello.
    1. Etichettare la parte superiore di ogni coperchio della piastra a 12 pozzetti con il numero di identificazione del cervello tagliato.
    2. Pipettare 2 ml di 1x PBS in ogni pozzetto di ogni piastra.
  3. Impostare il palco e accendere il vibratome; Assicurarsi che nel contenitore sia sufficiente 1x PBS per coprire il tessuto.
    1. Tagliare due pezzi di paraffina in plastica e piegarli per due volte. Posizionarli sopra i fori per le manopole del supporto del campione per impedire che 1x PBS cada sul contatore.
    2. Mettere il nastro giù sul blocco di tessuto del supporto del campione e quindi mettere su di esso la colla adesiva di cianoacrilato (vedere tabella dei materiali).
  4. Rimuovere il cervello dalla piastra a 6 pozzetti e metterlo su un piatto di plastica o vetro. Usare l'inossidabileLama in acciaio a doppio taglio per tagliare circa la metà del cervelletto.
    1. Tagliare il cervelletto caudalmente. Assicurarsi che la porzione del cervelletto rimanente sia pari.
  5. Immediatamente collocare la superficie piana del cervelletto rimanente sulla colla.
    NOTA: La parte dorsale del tessuto (la corteccia cerebrale) deve essere rivolta a sinistra oa destra rispetto alla lama. L'estremità rostrale che precedentemente conteneva la lampadina olfattiva attaccata doveva essere rivolta verso l'alto.
    1. Attendere almeno alcuni minuti per assicurarsi che la colla asciughi completamente.
  6. Mentre la colla che tiene il cervello in posizione sta essendo asciugata, versare 1x PBS nel bagno di campione. Dopo che la colla è asciutta, posizionare il supporto del campione con il tessuto nel bagno del campione.
    1. Se il campione di tessuto non è completamente coperto, versare più 1x PBS nella vasca del campione.
  7. Fissare la lama sul supporto della lama del vibratome e lentamente lTirare la lama nella vasca del campione finché non sia completamente sommersa in 1x PBS. Continuare a abbassare la lama fino a leggermente sotto la parte superiore del tessuto.
  8. Impostare la velocità del vibratore a 7, l'ampiezza a 6 e l'angolo di taglio a 12 ° (vedere tabella dei materiali per il modello vibratome). Avviare la vibrazione e tagliare le sezioni da 200 μm 23 .
    1. Utilizzare un grande pennello per spostare le sezioni del tessuto dalla vasca del campione in ciascun pozzo designato delle piastre a 12 pozzetti.
  9. Continuare a tagliare il tessuto fino a raggiungere il numero desiderato di sezioni del tessuto.

5. Post-colorazione

  1. Per ciascuna delle seguenti fasi di verniciatura e risciacqui, utilizzare 2 ml della soluzione indicata per pozzetto. Utilizzare un riempitivo a pipetta motorizzato (vedere tabella dei materiali) per trasferire le soluzioni nei pozzetti. Utilizzare una pipetta di trasferimento (vedere tabella dei materiali) per trasferire soluzioni dai pozzetti e nei rifiuti appropriaticontenitori.
  2. Sciacquare le sezioni in un lavaggio di 30 minuti di 0.01 M PBS-T (aggiungere 3,0 ml di detergente (vedere tabella dei materiali) a 1000 ml di PBS da 0,01 M).
  3. Diluire la soluzione di idrossido di ammonio (Caution) 3: 5 in volume con dH 2 O immediatamente prima dell'uso. Macchiare le sezioni nella soluzione diluita di idrossido di ammonio per 19-21 min.
    1. Proteggere la soluzione idrossido di ammonio sensibile alla luce con la pellicola.
      NOTA: L'idrossido di ammonio all'interno della soluzione ha una concentrazione di ~ 10% ed è classificato come "pericoloso". La soluzione di idrossido di ammonio può produrre ustioni se contatto con la pelle. Può causare irritazione delle vie respiratorie se inalato. Indossare guanti protettivi e lavorare in un cappuccio.
  4. Macchiare le sezioni nel tampone post-colorazione (aggiungere 90 g di reagente D in 500 mL dH 2 O) per 19-21 min. Il tampone post-colorazione è sensibile alla luce; Proteggerlo con la lamina 22 .
  5. Sciacquare le sezioni in tre, Lavaggi da 5-10 min di 0.01 M PBS-T.

6. Montaggio, pulizia e copertura

  1. Montare le sezioni su slitte rivestite con gelatina al 1% con il grande pennello. Lasciare asciugare per 20-30 minuti a temperatura ambiente e poi metterli in un vaso di Coplin durante la notte.
  2. Rimuovere le diapositive con le mani guantate dal vaso Coplin e posizionarle in un rack di plastica (vedere tabella dei materiali). Posizionare il rack di plastica nel piatto di colorazione (vedere tabella dei materiali) contenente 100% etanolo. Deidirli con tre lavaggi da 5 minuti.
  3. Lavare le diapositive due volte per 5 min ciascuna nel 99% di xilene. Posizionare le diapositive in un rack di vetro e abbassare il rack in un piatto di vernice di vetro contenente xilene con una maniglia in metallo (vedere tabella dei materiali).
    NOTA: Attenzione, Xylene è dannoso se inalato e provoca irritazione se tocca la pelle. È altamente infiammabile negli stati liquidi e vapori. Indossare guanti protettivi e lavorare in un cappuccio.
  4. Rimuovere le diapositive dal xilUno alla volta e coprire rapidamente il tessuto con ~ 0,25 ml di supporti di montaggio (vedi tabella dei materiali). Quindi, prendete le copertine e posate sui supporti.
    1. Spingere le bolle d'aria intrappolate sotto le coperture dello scivolo sul bordo con un oggetto sfocato, come la fine di un pennello.
  5. Posizionare le diapositive in un'area lontana dalla luce del sole e lasciarle asciugare per 2-3 giorni.
  6. Procedere all'acquisizione di immagini usando un microscopio e analizzando con il software appropriato.

7. Acquisire Image Stack

  1. Aprire il programma di imaging (vedere Tabella materiali ). Posizionare la diapositiva sullo stadio del microscopio. Nel menu nella parte superiore del programma, fai clic su "Acquisizione" e fai clic su "Immagine in diretta".
  2. Impostare il microscopio a 10 volte. Individuare il neurone di preferenza e portare il cursore, che appare come un X rosso, sul centro del soma. Fare clic con il tasto sinistro per impostare il punto di riferimento.
  3. Impostare il microscopio a 40X. Fai clic su "Sposta" dal menu nella parte superiore del programma e fai clic su "A punto di riferimento".
  4. Inizia la creazione dello stack di immagini scorrendo manualmente con il fine obiettivo sopra il tessuto finché non è leggermente fuori fuoco.
    1. Fai clic su "Set Top" nell'angolo in basso a destra del programma sotto la voce "Acquisizione immagine".
    2. Scorrere leggermente sotto il tessuto finché non è leggermente fuori fuoco e quindi fare clic su "Set Bottom" in "Acquisizione immagine". Avanti, fai clic su "Acquisisci Stack di immagini".
  5. Dopo aver acquisito lo stack di immagini, digitare il nome desiderato per il file immagine nella finestra visualizzata. Salva come "file MBF Ascii".
    1. Quando richiesto, selezionare il tipo di file come "file stack MBF JPEG2000" e quindi fare clic su "Salva".

8. Tracciamento neuronale

  1. Nella toolbaR sotto il menu, fai clic sulla casella con il titolo "Contour Name". Seleziona "Soma" dal menu a discesa.
  2. Traccia manualmente il soma. Quindi fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare "Finish Cell Body" quando il tracciamento è completo.
  3. Selezionare "AutoNeuron" per visualizzare un'altra scheda intitolata "WorkNeuron Workflow".
  4. In "Tipo di configurazione", selezionare "Nuovo". Impostare i parametri e fare clic su "Next Step" per visualizzare la sottovoce "Soma Detection".
    1. Per impostare i parametri, selezionare "Brightfield". Quindi, sotto "Max Process Diameter", fai clic su "Start Measuring". Usando il cursore, andare alla base del dendrite e impostare manualmente il diametro.
  5. Fare clic su "Sì" nella finestra che richiede all'utente di tracciare l'intera immagine. Traccia manualmente il soma. Disattiva e fai clic su "Passo successivo" per visualizzare la sottovoce "Posizionamento semi".
  6. Fare clic su "Validate Seed"S "e quindi fare clic su" Next Step "per visualizzare la sottotitola" Neuron Reconstruction ".
  7. In "Neuron", fai clic su "Interattivo". Eseguire tracciamenti interattivi seguendo la direzione del programma dei dendriti e fare clic con il pulsante destro del mouse per completare l'area evidenziata tracciata dal programma. Dopo aver tracciato tutti i dendriti, fai clic su "Next Step".
  8. Dopo aver visualizzato una nuova finestra, salvare la nuova configurazione con un titolo desiderato. Fai clic su "Salva".

9. Analisi

  1. Aprire il programma di analisi (vedere la tabella dei materiali).
  2. Fai clic su "File" dal menu superiore e fai clic su "Apri file di dati". Seleziona il file di interesse.
  3. Sotto la sottovoce analisi, selezionare "Analisi Sholl".
  4. Nella finestra "Analisi Sholl", impostare il raggio di inizio a 10 μm. In "Analisi", fai clic sulle caselle "Dendrites" e "Ordini dei rami".
  5. Diritto clScattare le finestre aperte e fare clic su "Excel Export". Fai clic su "Salva".
  6. Nell'ambito dell'analisi, fare clic su "Analisi struttura strutturata". Selezionare "Tutte le analisi possibili".
  7. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla finestra di recente apertura e fare clic su "Esportazione di Excel" 24 .

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Representative Results

Gli effetti del trattamento 5-Fu sull'arborizzazione e la complessità dendritica nell'ippocampo delle sezioni cerebrali macchiate da Golgi sono state quantificate e tracciate utilizzando un software di imaging disponibile in commercio. Dopo la tracciatura, l'arborizzazione dendritica, la densità della colonna vertebrale e la morfologia della spina sono state analizzate usando l'analisi di Sholl e l'indice di complessità dendritica (DCI). L'analisi di Sholl è un metodo analitico quantitativo che può essere utilizzato per determinare la morfologia arbor dendritica 25 . A partire dalla soma, i cerchi 10 μm distano l'uno dall'altro sovrapponendo i tracciati dendritici. La lunghezza dei dendriti è determinata dal numero di cerchi che i dendriti attraversano. L'analisi del punto di filiale, un metodo per accertare la complessità di un arbor dendritico, si basa sul numero totale e sull'ordine dei punti di ramo.

Un punto di ramo è definito come quando aIl ramo si divide in due sottogruppi. L'ordine della filiera è una misura della complessità basata su quante volte le filiali si dividono. Ad esempio, un punto di degno di primo ordine sarebbe il dendrite originale che si estende dal soma, mentre un punto di filiale di secondo ordine sarebbe il punto in cui la ramo divide in due sotto-branch. Esaminando sia i punti di filiera che l'ordine di filiera, la complessità dell'albero dendritico (in base al numero di punti di ramo) e in quali punti si verifica la ramificazione (un ordine di filiera più piccolo è più vicino al soma, mentre un ordine di filiera più grande è Oltre il soma) può essere determinato. Questi parametri sono stati applicati al DCI. I CA1 e CA3 sono stati suddivisi in porzioni apicali e basali e analizzate in modo indipendente 26 , 27 .

Sono stati analizzati i dendriti dei neuroni piramidali CA1 e CA3 e dei neuroni granulari nella DG. Tutti i neuroni selezionatiOgni gruppo sperimentale ha soddisfatto i seguenti criteri: 1) i dendriti avevano una colorazione scura e coerente di Golgi lungo tutta la loro lunghezza, 2) i dendriti erano visivamente in-tattici e 3) ciascun neurone aveva spazio sufficiente tra loro per prevenire interferenze durante l'analisi 28 . La figura 1 mostra un neurone che soddisfa i criteri di cui sopra. I dati sono stati espressi come media ± SEM. Per determinare le differenze statistiche tra il gruppo sham ei gruppi 5-Fu, è stata utilizzata una t -test a due bande. Tutte le analisi statistiche sono state condotte utilizzando software analitico (vedi tabella dei materiali) e p <0,5 è stato considerato significativo. Per valutare gli effetti del trattamento 5-Fu e del raggio di Sholl è stata utilizzata un'analisi mista di varianza dei fattori (ANOVA). I test post-hoc di Fisher LSD sono stati utilizzati seguendo ANOVA quando opportuno 29 .

In entrambi i CA 1 ( t = 7,68, p <0,01; Figura 2 A ) e CA3 ( t = 7,54, p <0,01; Figura 3 A ), si è osservata una significativa riduzione totale delle spine dopo il trattamento 5-Fu. Mentre il trattamento con 5-Fu non ha influenzato in modo significativo la densità spinale basale di CA1 ( t = 1,79, p = 0,15, Figura 2 B ), ha significativamente diminuito le spine dendritiche piramidali basali CA3 ( t = 5,57, p <0,05; B ). Inoltre, i test post-hoc di Fisher LSD hanno rivelato una diminuzione dell'arborizzazione dendritica dei dendriti piramidali apicali CA1 a 40-100 μm (Fisher's LSD, p <0.001; Figura 2 C ) e 130-160 μm (Fisher's LSD, p < 0,05;( Figura 2D ) e 70-110 (densitometria), mentre i dendriti apicali basici CA1 a 30-60 μm (LSD di Fisher, p <0.001, Figura 2D ) e 70-110 Μm (LSD di Fisher, p <0,05; Figura 2 D ) lontano dal soma 29 .

Per quanto riguarda i dendriti piramidali apicali CA3, non è stata rilevata una differenza significativa nella lunghezza dendritica segmentale dopo il trattamento a 5-fu rispetto ai controlli trattati con soluzione salina ( F (28,87) = 0,91, p = 0,59, Figura 3 C ). Tuttavia, per i dendriti piramidali basali CA3, vi era una differenza significativa tra il trattamento 5-Fu ei controlli trattati con soluzione salina nella lunghezza dendritica segmentale ( F (25, 78) =1,85; P <0,05; Figura 3 D ). Il LSD di Fisher ha rivelato che il trattamento con 5-Fu ha ridotto l'arborizzazione dendritica a 90-100 μm ( p <0.01; Figura 3 D ), 70-80 μm e 110-120 μm (Fisher's LSD, p <0.05, Figura 3 D ) Lontano dal soma 29 .

Per determinare la complessità dendritica, è stata utilizzata un'analisi di ordine dei rami per confrontare i gruppi trattati trattati con 5-Fu e quelli salini. All'interno della DG, l'analisi degli ordini di fili ha mostrato una differenza significativa tra ciascun trattamento e l'ordine di filiale ( F (8, 36) = 25.61, p <0.001; Figura 4 ). Questo è stato ulteriormente analizzato utilizzando l'LSD di Fisher, che ha indicato che c'era una diminuzione della lunghezza al 4 ° e 6 °Ordine dopo il trattamento 5-Fu ( p <0,001, figura 4 ) 29 .

Figura 1
Figura 1 : Golgi macchiato neurone che rappresenta i criteri per l'imaging e l'ulteriore analisi. Tutti e tre i tipi di colonna vertebrale sono facilmente visibili dopo la colorazione Golgi. La colorazione è coerente per tutta la lunghezza del dendrite e il dendrite è isolato da altri neuroni. Barra di scala, 5 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2 : Golgi macchiato n Gli euroni hanno dimostrato differenze significative nella densità della colonna vertebrale tra i 5-Fu trattati ei gruppi trattati con salina nel CA1 apicale, ma non il CA1 basale. C'è stata una significativa differenza nella lunghezza della colonna vertebrale tra i gruppi trattati con 5-Fu e quelli trattati con salina in CA1 apicale e basale. (A) Nei dendriti piramidali apicali CA1, 5-Fu ha significativamente ridotto la densità della colonna vertebrale. ( B ) Nei dendriti basali, non vi sono stati significativi cambiamenti nella densità complessiva delle spine. ( C ) L'analisi di Sholl ha rivelato che il trattamento con 5-Fu ha significativamente ridotto l'arborizzazione dendritica a 40-100 μm e 130-160 μm dal soma nei dendriti apical piramidali CA1. ( D ) Nei dendriti basali, il trattamento 5-Fu ha ridotto l'arborizzazione dendritica a 30-60 μm e 70-110 μm dal soma. Media ± SEM (n = 6). P <0,05; ** p <0.01, ANOVA 29 .= "Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55696/55696fig2large.jpg" target = "_ blank"> Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3 : i neuroni macchiati Golgi hanno dimostrato differenze significative nella densità della colonna vertebrale tra i gruppi trattati con 5-Fu e quelli trattati con salina in CA3 apicale e basale. C'è stata una differenza significativa nella lunghezza della colonna tra i gruppi trattati con 5-Fu e quelli salinati trattati in CA3 apicale, ma non CA3 basale. (A) Nei dendriti piramidali apicali CA3, 5-Fu ha significativamente diminuito la densità della colonna vertebrale. ( B ) Nei dendriti basali, 5-Fu ha significativamente ridotto la densità complessiva delle spine. C ) Non esiste alcun effetto significativo del trattamento a 5-Fu nell'area apicale di CA 3. D ) Nei dendriti basali, 5-Fu treaHa diminuito l'arborizzazione dendritica 70-120 μm dal soma. Media ± SEM (n = 6). *, P <0,05; **, p <0.01, ANOVA 29 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4 : Neuroni macchiati Golgi all'interno della DG hanno mostrato una diminuzione della lunghezza al 4 ° e 6 ° ordine dopo trattamento a 5-Fu rispetto al gruppo trattato con soluzione salina. Lunghezza per ordine di fili nei neuroni piramidali della regione ippocampale CA1. Media ± SEM (n = 6). P <0,05; ** p <0.01, ANOVA 29 . richiestaSe clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Rispetto alle tecniche più moderne, il metodo Golgi-Cox presenta diversi vantaggi che lo rendono il metodo preferito per esaminare la morfologia della colonna vertebrale: 1) la colorazione può essere utilizzata per qualsiasi tessuto, 2) una messa a punto di microscopi di base è tutto ciò che serve a Acquisire immagini basate su Golgi, 3) l'imaging Golgi-Cox è più veloce di un'immagine confocale e 4) le sezioni macchiate di Golgi sono vitali per diversi mesi a anni più a lungo dei campioni che sono etichettati in fluorescenza. Anche con questi vantaggi, il metodo Golgi-Cox presenta ancora alcune limitazioni. In primo luogo, l'intero processo richiede molto tempo, richiedendo diverse settimane di colorazione seguito dall'analisi delle immagini. Come si vede con questo protocollo, ci vogliono 14 giorni nella soluzione A e 1 giorno nella soluzione B prima che la sezione possa iniziare. Inoltre, l'esecuzione di sezionamento, post-colorazione e montaggio richiederà 2-3 ore per cervello. Ogni diapositiva deve essere asciugata per 1 giorno prima di pulire e coprirle. Dopo di che, la quantità di tempoCi vorrà per l'immagine e l'analisi delle sezioni dipenderà dall'individuo. In secondo luogo, ci possono essere emissioni di coerenza tra i dati degli analisti a causa delle differenze nella categorizzazione delle spine 30 . Per questo motivo, è consigliabile che una persona svolga la parte di imaging e analisi di ciascun esperimento, che estende ulteriormente la quantità di tempo necessario per il completamento del progetto.

Ci sono diversi passi critici del metodo Golgi-Cox che richiedono tempi e attenzione precisi. Quando si colorano le sezioni con la soluzione di idrossido di ammonio, è indispensabile che le sezioni restino nella soluzione per almeno 19 minuti, ma non oltre 21 minuti. Se le sezioni non sono nella soluzione di idrossido di ammonio per un tempo sufficiente, non saranno correttamente macchiate, il che significa che i neuroni appariranno meno definiti durante l'imaging, rendendo così difficile l'analisi. Se le sezioni sono nella soluzione di idrossido di ammonio per oltre 21 minuti, possono diventare ovTinto, rendendo difficile l'individuazione dei singoli neuroni. Pertanto, quando si spengono le soluzioni, il ricercatore deve muoversi rapidamente. Un altro passo importante è il trasferimento delle sezioni su diapositive. Prima di spostare le sezioni con il grande pennello, è meglio prima aggiungere una piccola quantità di PBS-T sulla diapositiva. Ciò consente di posizionare facilmente le sezioni sullo scorrimento e manovrare senza distruggere potenzialmente. Un passo più critico è il passo di essiccazione dopo che le sezioni sono poste su una diapositiva. Se le diapositive non si asciugano per almeno 20 minuti a temperatura ambiente, alcune sezioni probabilmente cadranno durante le fasi di disidratazione. Se le diapositive si asciugano per più di 30 minuti, molto probabilmente diventeranno fragili e si romperanno durante le fasi di disidratazione.

Quando si esegue questa procedura, ci sono determinati passaggi che possono essere fastidiosi. Ad esempio, se l'intero cervelletto viene tagliato prima di mettere il cervello sul specIl cervello può rompersi prima che la DG sia completamente tagliata, rendendo le sezioni successive inutilizzabili. Pertanto, è importante tagliare solo caudalmente per mezzo della metà del cervelletto. Un altro passo che può influenzare negativamente le sezioni è la velocità vibrativa e l'ampiezza. Mentre le impostazioni consigliate sono rispettivamente per 7 e 6, al momento del taglio, alcune sezioni possono disintegrarsi nel PBS o appaiono irregolari. Per correggere questo, regolare con precisione la velocità del vibratore o l'ampiezza, una alla volta fino a quando le sezioni sono in-tact e anche, tra le impostazioni di 6-8.

Anche se i kit commerciali per la colorazione Golgi sono disponibili, spesso non dispongono di dettagli esatti per ogni singolo passaggio. Con questo protocollo, riportiamo in dettaglio tutti i passaggi utilizzati per consentire ad altri laboratori di affidare in modo affidabile i tessuti ad alta qualità con una minima risoluzione dei problemi. I materiali utilizzati sono disponibili per la maggior parte dei laboratori di neuroscienze. Aberrazioni nel morposo dendriteL'alterazione del numero di spine dendritiche è correlata a una moltitudine di disturbi neurologici 31 . Inoltre, queste perturbazioni dell'arborizzazione dendritica potrebbero rappresentare un significativo segnale morfologico del danno indotto da chemioterapia nel cervello 32 . In futuro, esamineremo come le alterazioni strutturali indotte da 5-Fu possano riguardare i cambiamenti comportamentali, cellulari e molecolari.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione pilota sotto NIH P20 GM109005 (ARA) e dal Centro per il Premio Programma IDeA P30 GM110702 per il Trasferimento Neuroscienze.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
superGolgi Kit  Bioenno Lifesciences 30100  Contains hazardous materials. 
PBS 10x powder concentrate Fisher  BP665-1
Triton X-100 Sigma 9002-93-1
Permount  Fisher  SP 15-100
Slide cover  Fisher  12-546-14
7 mL Transfer pipette  Globe Scientific  135030
10 mL Falcon tubes  BD Biosciences  352099
Foil  Fisher  01-213-105
12-well plate  BD Biosciences  353043
200 proof Ethanol  Pharmco-AAPER 111000200
Xylene  Acros Organics  1330-20-7 Hazardous. 
Permabond 200 Permabond LLC GF2492
25 mL serological pipette Sigma SIAL1489
Parafilm Midsci HS234526C 
Vibratome  World Precision Instruments  NVSLM1
C57Bl/6 Male Mice  The Jackson Laboratory  000664
Axio Imager 2 ZEISS Multiple components, see website for details. 
AxioCam MRc Camera ZEISS 426508-9902-000
Staining Dish , Green Tissue-Tek 62541-12
Staining Dish Set  Electron Microscopy Sciences  70312-20
Motorized Pipet Filler  Fisher  03-692-168
Neurolucida  mbf Bioscience 
Neurolucida Explorer  mbf Bioscience 
Prism  GraphPad

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References

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Neuroscienze Edizione 124 Golgi ippocampo spine dendritiche morfologia dendritica complessità arborizzazione
Valutazione della complessità dendritica ippocampale nei topi invecchiati utilizzando il metodo Golgi-Cox
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Groves, T. R., Wang, J., Boerma, M., … More

Groves, T. R., Wang, J., Boerma, M., Allen, A. R. Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method. J. Vis. Exp. (124), e55696, doi:10.3791/55696 (2017).

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