Summary
여기서 우리는 Golgi-Cox 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 이 신뢰할 수있는 조직 얼룩 방법은 최소한의 문제 해결과 함께 해마 및 전체 뇌에 걸쳐 cytoarchitecture의 높은 품질 평가를 허용합니다.
Abstract
수상 돌기는 흥분성 시냅스를 포함하는 신경 돌기 샤프트의 돌기입니다. 해마 내의 신경성 수상 돌기의 형태 및 분지 변이는인지 및 기억 형성에 관여한다. Golgi 염색에 대한 몇 가지 접근법이 있으며, 모두 수지상 세포의 형태 학적 특성을 결정하고 명확한 배경을 생성하는데 유용합니다. 현재 Golgi-Cox 방법 (상업적 골지 염색 키트와 함께 제공되는 프로토콜의 약간의 변형)은 비교적 낮은 용량의 화학 요법 약물 인 5- 플루오로 우라실 (5-Fu)이 수지상 형태에 어떻게 영향을 미치는지 평가하기 위해 고안되었다 , 척추의 수 및 해마 안의 정강이 형성의 복잡성과 관련이 있습니다. 5-Fu는 수지상 복합체를 상당히 변조 시켰고, 해마 전역에서 척추 밀도를 영역 특이 적 방식으로 감소시켰다. 제시된 데이터는 Golgi 염색 방법이CA1, CA3 및 해마의 치아 이랑 (dentate gyrus)에서 성숙한 뉴런을 fectively 염색했다. 이 프로토콜은 각 단계의 세부 사항을보고하여 다른 연구자가 뇌 전체에 걸쳐 조직을 안정적으로 얼룩지게하고 고품질의 결과와 최소한의 문제 해결을 가능하게합니다.
Introduction
Dendrites는 presynaptic 입력을 받아 처리하는 뉴런의 가장 큰 부분입니다 1 . 그들의 수지상 프로세스는 복잡한 기하학을 가지고 있는데, 근위부 가지가 원위부 가지보다 더 큰 직경을 가지고 있습니다. 수상 돌기가 발달함에 따라 돌기 arborization이라고하는 과정에서 다른 뉴런과 여러 연결을 형성합니다. 이 분기의 범위와 패턴은 수상 돌기가 적절하게 처리 할 수있는 시냅스 입력의 양을 결정합니다 2 .
수상 돌기 arborization은 활동 의존성 소성과 연결 회로의 적절한 개발을 위해 필요한 과정입니다. 확장, 후퇴, 분지 및 시냅스 생성은 내인성 유전 프로그램 및 외인성 요인으로부터의 영향을 포함하는 복잡한 과정이다. 해마 내의 신경성 수상 돌기의 형태 및 분지 변화는인지 및 기억 형성에 관련되어있다돌기 복잡성의 변화는 병리 생리학 및 행동 변화와 관련이있다 5. 이상은 X- 증후군 및 다운 증후군을 포함한 여러 질병 상태와 관련이있다.
수상 돌기 (dendritic spines)는 중추 신경계 내에서 흥분성 입력을받는 돌기 아버의 특화된 세포 내 구획입니다. 각 계통의 크기와 모양에 따라 3 가지 형태의 계통 분류가 있습니다. 1) 버섯 계통은 다른 계통보다 글루타메이트 수용체가 많은 복잡한 계피 밀도를 가지고 있습니다. 2) 줄기가없는 멍한 등뼈; 3) 길고 좁은 줄기와 구상 머리로 구성된 얇은 등뼈 8 . 돌기 척추 부피는 부분적으로 사용되어 얇은 척추가 일반적으로 더 작습니다 (0.01 μm 3 3 )와 비교 9,10 . 등뼈는 성숙과 함께 안정됩니다. 예를 들어, 얇은 등뼈는 며칠 후에 수축되거나 버섯 등뼈로 발전합니다. 양자 택일로, 버섯 등뼈는 상대적으로 안정하고 오랜 기간 생존 할 수 있습니다. 연결 연결의 강도는 등뼈 및 / 또는 그들의 볼륨 11,12,13의 수를 기반으로 생각됩니다.
고전적인 Golgi 염색 방법과 그보다 현대적인 변형 모두 돌기의 척추 형태와 밀도를 검사하는데 유용합니다. Golgi 염색의 한 가지 독특한 측면은 무작위로 총 뉴런의 약 5 %를 얼룩이 지므로 개별 뉴런의 추적이 가능합니다 14 , 15 . 골지기의 정확한 메카니즘얼룩 개별 뉴런은 여전히 알려져 있지 않습니다, 방법의 원리는은 크로메이트 (Ag 2 CrO 4 ) 16 , 17 의 결정화를 기반으로합니다. Golgi 방법에는 세 가지 주요 유형이 있습니다 : 빠른 골지, Golgi-Cox 및 Golgi-Kopsch 18 , 19 . 세 가지 방법 모두 몇 일에서 몇 달 동안 크롬 염에서 초기 인큐베이션 단계로 시작하지만 몇 가지 주요 차이점이 있습니다. 빠른 Golgi는 첫 번째 단계에서 오스뮴 tetroxide를 사용하는 반면, Golgi-Kopsch는 paraformaldehyde를 포함합니다. rapid-Golgi와 Golgi-Kopsch에서의 염색은 약 7 일 동안 1 ~ 2 % 질산은 용액에서 배양한다. Golgi-Cox 방법은 질산은 대신에 염화 수은과 중크롬산 칼륨을 사용하며 2 ~ 4 주간의 함침 시간이 있습니다. 그 다음 조직을 절편 화하고 희석 된 암모니아염료를 제거하기위한 사진 용 정착액이 뒤 따른다. 세 가지 유형 중에서 골지 - 콕스 (Golgi-Cox) 방법은 배경 간섭이없는 돌기 아버를 염색하는 데 가장 좋은 것으로 여겨지는데 부분적으로는 크리스탈 아티팩트가 조직 표면에 발생하지 않기 때문에 (빠른 골지 방법과 달리) 17 , 20 , 21 .
현재의 방법은 상업적 골지 염색 키트와 함께 제공되는 프로토콜의 약간의 변형이며 5-Fu의 비교적 적은 양이 수지상 형태 학적 특성 및 척추 밀도에 어떻게 영향을 미치는지 평가하기 위해 고안되었다. 획득 된 모든 데이터는 화학 요법 치료가 어떻게 신경 회로에 영향을 미치는지에 대한 더 많은 통찰력을 제공 할 수 있습니다.
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Protocol
실험은 UAMS 기관 동물 관리 및 사용위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee)가 승인 한 윤리적 기준에 따라 수행되었습니다.
1. 동물과 5-Fu 주사 패러다임
- 6 개월 된 수컷 C57Bl6 / J 야생형 마우스를 구입하여 1 살이 될 때까지 일정한 12 시간의 명암주기하에 보관하십시오.
- 0.9 % 살균 식염수로 5 푸를 희석하십시오. 마우스 당 필요한 용량으로 60 mg / kg을 사용하십시오.
- 5-Fu의 복강 내 주사를 주십시오 (3 주 동안 1 주일에 한 번).
- 매일 같은 시간에 복강 내 주사를합니다. 예를 들어, 0900-1200 시간.
- 동물을 안락사시키고 마지막 주입 후 30 일 동안 두뇌를 추출하십시오.
2. 안락사 절차 및 뇌 추출
- 설치류를 억제하고 꼬리의 바닥을 잡아. 다른 한편으로, 엄지 또는 첫 번째 손가락을 th설치류 목의 바닥. 설치류의 목에 신속하게 압력을 가하고 꼬리를 잡고있는 다른 손이 뒤로 당기는 동안 앞으로 밉니다.
- 한 손으로 설치류를 잡고 다른 한 손으로 대형 수술 가위를 잡으십시오. 두 블레이드 사이에 설치류의 목을 놓고 신속하게 머리를 참견하십시오.
- 절단 된 마우스 헤드를 가져 와서 눈 위까지 두개골 위의 털을 다듬을 때 미세 가위를 사용하십시오. 그런 다음 가위 끝을 각 아이 소켓에 넣고 약간의 힘으로 가위를 닫으십시오.
- 소용돌이를 사용하여 두개골을 소뇌의 좌우로 자른다.
- 포셉을 사용하여 소뇌를 둘러싼 두개골 부분을 직접 들어 올리거나 떼어냅니다.
- 두개골의 midsagittal 라인을 따라 잘라 봄 가위를 사용하십시오.
- 포셉을 사용하여 두개골의 나머지 부분을 두뇌에서 들어 올리십시오.
- 주걱과 프로브를 사용하여 두뇌를 원하는 용기에 넣으십시오. 스테인리스 사용teel 블레이드, midsagittal 비행기를 따라 각 뇌를 잘라. 오른쪽 반구에 다음 Golgi-Cox 방법을 수행합니다.
3. Golgi 염색 및 조직 준비
- 갓 수확 한 반뇌를 10 mL 원뿔 튜브에 5 mL 염화 수은 기반 용액 (키트의 용액 A)에 담그십시오. 염화 수은 용액은 빛에 민감합니다. 호일로 튜브를 덮으십시오. 샘플을 실온에서 어둡게 보관하십시오.
참고 : 솔루션 A는 표에 나와있는 키트로 제공됩니다. 주의! 용액 A (염화 수은 용액이라고도 함)에는 중크롬산 칼륨, 염화 수은 및 크롬산 칼륨과 같은 독성 시약이 포함되어 있습니다. 보호 장갑을 착용하고 흄 후드에서 작업하십시오. - 1 일 후, 용액을 일시적인 용기 (예 : 대형 계량 보트)에 천천히 방울을 옮겨 생물학적 유해 폐기물 용기에 버리십시오. 두뇌 (원래 10 ML 원뿔 튜브에 여전히) 5 ML과염화 수은 용액에 넣고 샘플을 실온에서 13 일 더 어두운 곳으로 되돌립니다.
- 증류수 또는 탈 이온수 (dH 2 O) 90 mL에 30 g의 함침 완충액을 넣는다. 6 잘 접시의 각 우물은 6.5 ML의 게시물 주입 버퍼, 하나의 우물 당 두뇌를 채우십시오
참고 : 사후 주입 버퍼는 표에 나와있는 키트에 들어 있습니다.- 염화 수은 용액에서 (총) 14 일 후 dH 2 O로 조직을 헹구십시오. 그런 다음 post-impregnation buffer가있는 6-well plates로 옮깁니다. 호일로 판을 덮고 어두운 곳에서 실온에서 보관하십시오.
- 침지 1 일 후 사후 침투 완충액을 피펫 팅하고 신선한 사후 침투 완충액으로 갱신한다. 실온에서 어두운 곳에서 1 일 동안 보관하십시오. 필요한 경우 4 ° C에서 최대 1 개월 22 동안 보관하십시오.
4. 섹션
- 뚜껑의 12- 웰 플레이트에 왼쪽에서 오른쪽으로 그리고 위에서 아래로 숫자가 오름차순으로 레이블을 붙입니다.
- 전체 뇌를 절단하는 경우 뇌 당 2 ~ 3 개의 12- 웰 플레이트를 준비하십시오.
- 각 12 웰 플레이트 뚜껑의 상단에 분류 번호가 매겨진 뇌를 표시하십시오.
- 각 플레이트의 각 우물에 1X PBS 2 ML 피펫.
- 스테이지를 설정하고 vibratome을 켜십시오. 조직에 충분한 1x PBS가 있는지 확인하십시오.
- 플라스틱 파라핀 필름 두 장을 자르고 두 번 접습니다. 시편 홀더 손잡이의 구멍에 올려 놓고 1x PBS가 카운터에 새어 나오지 않도록하십시오.
- 시편 홀더의 티슈 블록에 테이프를 붙이고 시아 노 아크릴 레이트 접착제 접착제 (재료 표 참조)를 올려 놓으십시오.
- 6 - 웰 플레이트에서 두뇌를 제거하고 플라스틱이나 유리 접시에 놓습니다. 스테인리스 사용소뇌의 약 절반을 자르는 강철 양날 칼날.
- 소뇌를 꼬리로 자른다. 남아있는 소뇌 부분이 균일한지 확인하십시오.
- 즉시 접착제에 남은 소뇌의 평평한 표면을 놓으십시오.
참고 : 조직 (대뇌 피질)의 지느러미 부분은 블레이드에 대해 왼쪽이나 오른쪽을 향해야합니다. 이전에 부착 된 후각 구를 포함하고 있던 주둥이 끝은 위쪽을 향해야합니다.- 접착제가 완전히 마르도록 적어도 몇 분 정도 기다리십시오.
- 두뇌를 고정시키고있는 접착제가 건조되는 동안 1x PBS를 시험편 배스에 붓습니다. 접착제가 마른 후에, 표본 홀더를 조직과 함께 시험편 배스에 넣으십시오.
- 조직 샘플이 완전히 덮여 있지 않으면 표본 욕조에 1x PBS를 더 붓습니다.
- vibratome의 블레이드 홀더에 날을 장착하고 천천히 l블레이드가 1x PBS에 완전히 잠길 때까지 블레이드를 시험편 배스에 넣으십시오. 조직 상단보다 약간 아래쪽에 올 때까지 블레이드를 계속 낮 춥니 다.
- vibratome 속도를 7, 진폭을 6, 절단 각도를 12 °로 설정하십시오 (vibratome 모델의 재료 표 참조). 진동을 시작하고 200 μm 구간을 자릅니다 23 .
- 큰 그림 붓을 사용하여 조직 섹션을 표본 욕조에서 12 개의 웰 플레이트의 지정된 각 웰로 이동하십시오.
- 원하는 수의 조직 절편에 도달 할 때까지 조직 절개를 계속하십시오.
5. 포스트 염색법
- 다음의 각 염색 단계 및 헹굼물마다 웰당 지시 된 용액 2 mL를 사용한다. 전동 피펫 필러 (물질 표 참조)를 사용하여 용액을 우물로 옮긴다. 용액을 적당한 곳으로 옮기고 적절한 쓰레기로 옮기려면 전송 피펫 (재료 표 참조)을 사용하십시오컨테이너.
- 0.01M PBS-T로 30 분간 1 회 씻으십시오 (0.01 M PBS 1,000 mL에 세제 3.0 mL를 넣으십시오).
- 사용 직전에 dH 2 O로 수산화 암모늄 용액 (주의) 3 : 5를 희석하십시오. 희석 된 수산화 암모늄 용액에서 19-21 분 동안 부분을 염색합니다.
- 감광성 수산화 암모늄 용액을 호일로 보호하십시오.
참고 : 용액 내의 수산화 암모늄은 ~ 10 % 농도이며 "위험한"것으로 분류됩니다. 수산화 암모늄 용액은 피부에 접촉하면 화상을 입을 수 있습니다. 흡입하면 호흡기도 자극을 유발할 수 있습니다. 보호 장갑을 착용하고 흄 후드에서 작업하십시오.
- 감광성 수산화 암모늄 용액을 호일로 보호하십시오.
- 포스트 얼룩 버퍼 (500 ML dH 2 O에 시약 D 90g을 추가)에 섹션을 19 ~ 21 분 동안 얼룩. 포스트 염색 완충액은 빛에 민감합니다. 호일로 보호하십시오 22 .
- 세 부분을 헹구십시오.0.01 M PBS-T를 5 ~ 10 분 세척 하였다.
6. 설치, 청소 및 덮음
- 큰 붓으로 1 % 젤라틴 코팅 슬라이드에 섹션을 마운트하십시오. 실온에서 20-30 분 건조시키고 밤새 코플린 병에 넣으십시오.
- Coplin 항아리에서 장갑을 낀 손으로 슬라이드를 꺼내 플라스틱 랙에 넣으십시오 (재료 표 참조). 플라스틱 랙을 100 % 에탄올이 들어있는 얼룩 접시 (재료 표 참조)에 넣습니다. 5 분 세 번 씻어서 탈수하십시오.
- 99 % 크실렌으로 5 분씩 두 번 씻으십시오. 슬라이드를 유리 선반에 놓고 랙을 금속 손잡이가있는 크실렌이 들어있는 유리 얼룩이 진 접시에 내려 놓으십시오 (재료 표 참조).
참고 : 크실렌은 흡입하면 유해하며 피부에 닿으면 자극을 유발합니다. 그것은 액체 및 증기 상태에서 매우 가연성입니다. 보호 장갑을 착용하고 흄 후드에서 작업하십시오. - 슬라이드를 xyl에서 꺼냅니다.한 번에 하나씩 주입하고 약 0.25 mL의 장착 매체로 조직을 신속하게 덮습니다 (재료 표 참조). 그런 다음 슬라이드 커버를 잡고 미디어 위에 올려 놓습니다.
- 슬라이드 덮개 아래의 갇힌 기포를 페인트 브러시의 끝과 같이 뾰족한 물체로 가장자리로 밀어 넣으십시오.
- 햇빛이 비치지 않는 곳에 슬라이드를 놓고 2 ~ 3 일 동안 말리십시오.
- 현미경을 사용하여 이미지를 수집하고 적절한 소프트웨어로 분석하십시오.
7. 이미지 스택 획득
- 이미징 프로그램을 엽니 다 ( 재료 표 참조). 슬라이드를 현미경 스테이지에 올려 놓습니다. 프로그램 상단의 메뉴에서 '수집'을 클릭 한 다음 '라이브 이미지'를 클릭하십시오.
- 현미경을 10X로 설정합니다. 특혜의 뉴런을 확인하고 빨간색 X처럼 나타나는 커서를 soma의 중심으로 가져옵니다. 참조 점을 설정하려면 왼쪽 버튼을 클릭하십시오.
- 현미경을 40X로 설정하십시오. 프로그램 상단의 메뉴에서 '이동'을 클릭 한 다음 '참조 점'을 클릭하십시오.
- 초점이 약간 벗어날 때까지 조직 위의 미세한 대상을 수동으로 스크롤하여 이미지 스택을 만듭니다.
- "Image Acquisition"제목 아래에서 프로그램의 오른쪽 하단에있는 "Set Top"을 클릭하십시오.
- 약간 초점이 맞을 때까지 조직 아래로 살짝 스크롤 한 다음 "Image Acquisition"아래의 "Set Bottom"을 클릭하십시오. 그런 다음 "이미지 스택 가져 오기"를 클릭하십시오.
- 이미지 스택을 얻은 후에 나타나는 창에 원하는 이미지 파일 이름을 입력하십시오. "MBF Ascii 파일"로 저장하십시오.
- 메시지가 나타나면 파일 형식을 "MBF JPEG2000 stack file"로 선택한 다음 "저장"을 클릭하십시오.
8. 신경 추적
- 툴바에서r 메뉴 아래의 "Contour Name"상자를 클릭하십시오. 드롭 다운 메뉴에서 "Soma"를 선택하십시오.
- soma를 수동으로 추적하십시오. 그런 다음 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 추적이 완료되면 "셀 본문 완료"를 선택하십시오.
- "AutoNeuron"을 선택하여 "AutoNeuron Workflow"라는 다른 탭을 불러옵니다.
- "구성 유형"에서 "새로 만들기"를 선택하십시오. 매개 변수를 설정하고 "다음 단계"를 클릭하여 "Soma Detection"소제목을 불러옵니다.
- 매개 변수를 설정하려면 "Brightfield"를 선택하십시오. 다음으로, "Max Process Diameter"에서 "Start Measuring"을 클릭하십시오. 커서를 사용하여 수상 돌기의 바닥으로 가서 수동으로 직경을 설정하십시오.
- 사용자가 전체 이미지를 추적하도록 요청하는 창에서 "예"를 클릭하십시오. soma를 수동으로 추적하십시오. 클릭 한 다음 "다음 단계"를 클릭하여 "시드 배치"소제목을 불러옵니다.
- "Validate Seed"를 클릭하십시오."다음"을 클릭하여 "Neuron Reconstruction"소제목을 불러옵니다.
- "Neuron"에서 "Interactive"를 클릭하십시오. 수상 돌기의 프로그램 방향을 따라 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 프로그램에서 추적 한 강조 표시된 영역을 완료함으로써 대화식 추적을 수행하십시오. 모든 수상 돌기를 추적 한 후 "다음 단계"를 클릭하십시오.
- 새 창이 나타나면 원하는 제목으로 새 구성을 저장하십시오. '저장'을 클릭하십시오.
9. 분석
- 분석 프로그램을 엽니 다 (재료 표 참조).
- 상단 메뉴에서 "파일"을 클릭 한 다음 "데이터 파일 열기"를 클릭하십시오. 원하는 파일을 선택하십시오.
- 분석 소제목 아래에서 "Sholl Analysis"를 선택하십시오.
- "Sholl Analysis"창에서 시작 반경을 10 μm로 설정하십시오. "분석"에서 "수상 돌기"및 "지점 주문"상자를 클릭하십시오.
- 오른쪽 cl새로 열린 창을 클릭하고 "Excel 내보내기"를 클릭하십시오. '저장'을 클릭하십시오.
- 분석 아래에서 "Branched Structure Analysis"를 클릭하십시오. "가능한 모든 분석"을 선택하십시오.
- 새로 열린 창을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 "Excel 내보내기" 24를 클릭하십시오.
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Representative Results
수상 돌기 arborization에 5 -Fu 처리의 효력 및 Golgi 얼룩 두뇌 단면의 해마에있는 복합성은 상업적으로 이용 가능한 화상 진찰 소프트웨어를 사용하여 정량되고 추적되었다. 추적 후, 돌기 arborization, 척추 밀도 및 척추 형태학은 Sholl 분석 및 수지상 복합 지수 (DCI)를 사용하여 분석되었습니다. Sholl 분석은 수지상 세포 형태를 결정하는 데 사용할 수있는 정량 분석 방법입니다 25 . 소마 (soma)부터 시작해서, 서로 10μm 떨어져있는 원들은 돌기 추적을 오버레이합니다. 수상 돌기의 길이는 돌기가 교차하는 원의 수에 의해 결정됩니다. 돌기 아버의 복잡성을 확인하는 방법 인 분기점 분석은 분기점의 총 수와 순서를 기반으로합니다.
분기점은 다음과 같이 정의됩니다.브랜치는 두 개의 하위 브랜치로 나뉩니다. 분기 순서는 분기가 나누는 횟수에 따라 복잡성을 측정 한 것입니다. 예를 들어 1 차 분기점은 원래의 수상 돌기가 soma에서부터 확장되는 반면 2 차 분기점은 분기가 2 개의 하위 분기로 분할되는 지점이됩니다. 분기점과 분기 순서를 모두 검토하여 수지상 아버의 복잡성 (분기점 수에 따라 다름)과 분기가 발생하는 지점 (더 작은 분기 순서는 소마에 더 가깝지만 더 큰 분기 순서는 더 soma에서 더) 결정될 수있다. 이 매개 변수는 DCI에 적용되었습니다. CA1과 CA3는 정점 부분과 기초 부분으로 나누어 져 독립적으로 분석되었다.
DG에서 CA1 및 CA3 피라미드 뉴런 및 과립 뉴런의 수상 돌기가 분석되었다. 모든 뉴런은 fo각각의 실험 그룹은 다음과 같은 기준을 충족시켰다 : 1) 수상 돌기는 전체 길이에 걸쳐 진드기가 검고 일관성이 있고, 2) 수상 돌기가 눈에 띄게 보이며, 3) 각 신경 세포는 분석 중에 간섭을 방지하기에 충분한 공간을 가졌다. 28 . 그림 1 은 위의 기준을 충족하는 뉴런을 보여줍니다. 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내었다. sham과 5-Fu 그룹 사이의 통계적 차이를 결정하기 위해, 쌍으로 된 양측 t -test가 사용되었다. 모든 통계 분석은 분석 소프트웨어 (물질 표 참조)를 사용하여 수행되었으며, p <0.5는 유의 한 것으로 간주되었다. 5-Fu 치료와 Sholl 반경의 효과를 평가하기 위해 혼합 요인 분석 (ANOVA)이 사용되었습니다. Fisher LSD post-hoc 테스트는 적절한 경우 ANOVA 이후에 사용되었습니다.
두 CA apical pyramidal dendrites의 경우, 5-Fu 치료 후 척추에 전반적인 감소가 있었다 ( p <0.01, Fig 2 A ) 그리고 CA3 ( t = 7.54, p <0.01; 5-Fu 처리가 CA1의 기초 등뼈 밀도에 유의 한 영향을 미치지는 않았지만 ( t = 1.79, p = 0.15; 그림 2B ), CA3 기저 피라미드 돌기 쪽이 현저하게 감소했다 ( t = 5.57, p <0.05; B ). 또한, Fisher LSD post-hoc 테스트는 40-100 μm (피셔의 LSD, p <0.001; 그림 2 C ) 및 130-160 μm (피셔의 LSD, p <0.05)에서 CA1 근심 피라미드 dendrites의 돌기 arborization의 감소를 보여 주었다. 0.05;ig ">도 2에서 C ) 소염 처리 된 대조군과 비교하여 soma로부터 유사한 현상이 30-60㎛에서 CA1 기저 치상 돌기 (피셔의 LSD, p <0.001; 도 2d) 및 70-110 μm 2 (피셔의 LSD, p <0.05, 그림 2 D ) 소마에서 29 .
CA3 첨두 피라미드 수상 돌기에 대해서는 5-Fu 처리 후 세분화 된 돌기 길이가 식염수 처리 대조군에 비해 유의 한 차이가 없었다 ( F (28,87) = 0.91, p = 0.59, 그림 3 C ). 그러나 CA3 기초 피라미드 수상 돌기의 경우, 5-Fu 처리와 식염수 처리 대조군 사이의 분절 수지상 길이에서 유의 한 차이가 있었다 ( F (25, 78) =1.85; p <0.05; 그림 3 D ). 피셔의 LSD는 5-Fu 처리가 90-100 μm ( p <0.01; 그림 3 D ), 70-80 μm 및 110-120 μm (피셔의 LSD, p <0.05; 그림 3 D )에서 수상 돌기 수축을 감소시켰다. 멀리 soma에서 29 .
수상 돌기의 복잡성을 결정하기 위해 가지 순서 분석을 사용하여 5-Fu 처리 및 염분 처리 대조군을 비교 하였다. DG 내에서 가지 순서 분석은 각 처치와 가지 ( F (8, 36) = 25.61, p <0.001; 그림 4 ) 사이에 유의 한 차이를 보였다. 이것은 피셔의 LSD를 사용하여 더 분석되었는데, 이는 4 번째 와 6 번째에 길이가 감소했다는 것을 나타냈다.5-Fu 치료 후 ( p <0.001; 그림 4 ) 29 .
그림 1 : 이미징 및 추가 분석 기준을 나타내는 골지 스테인드 뉴런. Golgi 염색 후 세 가지 척추 유형 모두를 쉽게 볼 수 있습니다. 얼룩은 수상 돌기의 전체 길이에 걸쳐 일관되고 수상 돌기는 다른 뉴런과 격리되어 있습니다. 스케일 바, 5 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 골지 스 스테인드 n eurons은 근위부 CA1에서 5-Fu 처리 군과 식염수 처리 군 사이의 척추 밀도에서 유의 한 차이를 보였으 나, 기초 CA1에서는 유의하지 않았다. 근위부와 기저부 모두에서 5-Fu 처리 군과 생리 식염 군 사이의 척추 길이에는 유의 한 차이가 있었다. ( a ) CA1 근위 피라미드 수상 돌기에서 5-Fu는 척추 밀도를 유의하게 감소시켰다. ( b ) 기초 수상 돌기에서 척추의 전체 밀도에는 유의 한 변화가 없었다. ( c ) Sholl 분석은 5-Fu 처리가 CA1 근위 피라미드 수상 돌기에서 체 모세포로부터 40-100 ㎛ 및 130-160 ㎛에서 수상 돌기 수축을 유의하게 감소 시켰다는 것을 밝혀냈다. ( d ) 기저 수상 돌기에서, 5-Fu 처리는 30-60 μm에서 수지상 arborization과 soma로부터 70-110 μm 떨어져 감소시켰다. 평균 ± SEM (n = 6). * p <0.05; ** p <0.01, ANOVA 29 .= "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55696/55696fig2large.jpg"target = "_ blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : Golgi 염색 된 뉴런은 정맥 및 기저부 CA3에서 5-Fu 처리 군과 염수 처리 군 사이의 척추 밀도에서 유의 한 차이를 보였다. 근위부 CA3에서는 5-Fu 처리 군과 식염수 처리 군 사이에서 척추 길이에 유의 한 차이가 있었지만, 기초 CA3에서는 그렇지 않았다. ( a ) CA3 첨두 피라미드 수상 돌기에서, 5-Fu는 척추 밀도를 상당히 감소시켰다. ( b ) 기초 돌기에서 5-Fu는 척추의 전체 밀도를 현저하게 감소시켰다. ( c ) CA 3 정점 영역에서 5-Fu 치료의 유의 한 효과는 없었다. ( d ) 기초 수상 돌기에서, 5-Fu treatment는 dendritic arborization을 soma로부터 70-120 μm 떨어져 감소시켰다. 평균 ± SEM (n = 6). *, p <0.05; **, p <0.01, ANOVA 29 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : DG 내의 Golgi 염색 된 뉴런은 5-Fu 치료 후 4 차 및 6 차 순서에서 생리 식염수 치료 그룹과 비교하여 길이가 감소한 것을 보여줍니다. CA1 해마 영역의 피라미드 뉴런에서 분지 순서 당 길이. 평균 ± SEM (n = 6). * p <0.05; ** p <0.01, ANOVA 29 . 항변이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
보다 현대적인 기술에 비해 Golgi-Cox 방법은 척추 형태를 검사하는 데 선호되는 몇 가지 장점이 있습니다. 1) 염색은 본질적으로 모든 조직에 사용할 수 있습니다. 2) 기본적인 광학 현미경 설정만으로 모든 것이 가능합니다. 3) Golgi-Cox 이미징은 공 촛점 영상보다 빠르다. 4) Golgi 염색 된 절편은 형광 라벨이 부착 된 샘플보다 몇 개월에서 몇 년 더 오래 실행 가능하다. 이러한 장점을 가지고 있어도 Golgi-Cox 방법에는 여전히 한계가 있습니다. 첫째, 전체 프로세스가 매우 시간 소모적이어서 몇 주간의 얼룩이 필요하고 이미지를 분석해야합니다. 이 프로토콜에서 볼 수 있듯이, A 절에서 14 일, B 절에서 1 일이 소요되기 전에 절편을 시작할 수 있습니다. 또한 절단, 포스트 염색 및 마운팅 작업은 두뇌 당 2-3 시간이 소요됩니다. 각 슬라이드는 청소 및 덮기 전에 1 일 동안 건조해야합니다. 그 후 시간의 양그것이 섹션에 개인에 따라 달라집니다 이미지 및 분석 소요됩니다. 둘째, 척추 분류의 차이로 인해 애널리스트의 데이터간에 일관성 문제가있을 수 있습니다 30 . 이러한 이유로 한 사람이 각 실험의 이미징 및 분석 부분을 수행하여 프로젝트 완료 시간을 더 연장하는 것이 좋습니다.
정확한 타이밍과주의가 필요한 Golgi-Cox 방법에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 절편을 수산화 암모늄 용액으로 염색 할 때 절편이 적어도 19 분 동안 용액에 남아 있어야하지만 21 분을 초과해서는 안된다. 섹션이 충분한 시간 동안 수산화 암모늄 용액에 없으면 적절하게 염색되지 않아 뉴런의 이미지가 잘 보이지 않게되어 분석하기가 어려워집니다. 섹션이 21 분 이상 수산화 암모늄 용액에 있으면 ov가 될 수 있습니다er-stained되어 개별 뉴런을 식별하기가 어렵습니다. 따라서 솔루션을 전환 할 때 연구원은 신속하게 이동해야합니다. 또 다른 중요한 단계는 섹션을 슬라이드 위로 옮기는 것입니다. 대형 페인트 브러시로 섹션을 이동하기 전에 슬라이드에 소량의 PBS-T를 먼저 추가하는 것이 가장 좋습니다. 이렇게하면 섹션을 쉽게 슬라이드 위에 배치하고 잠재적으로 분리 할 필요없이 조작 할 수 있습니다. 한 가지 더 중요한 단계는 섹션을 슬라이드에 놓은 다음 건조 단계입니다. 슬라이드가 실온에서 최소 20 분 동안 건조하지 않으면 탈수 단계에서 특정 섹션이 떨어질 가능성이 큽니다. 슬라이드가 30 분 이상 건조되면 탈수 단계에서 부서지기 쉬워 질 것입니다.
이 절차를 수행 할 때 문제가 될 수있는 특정 단계가 있습니다. 예를 들어, 전체 소뇌가 절단되어 스펙에 두뇌가 놓여지면이젠 홀더 및 절편을 사용하면 뇌가 완전히 절단되기 전에 뇌가 갈라져서 더 이상 사용할 수없는 섹션을 사용할 수 없게됩니다. 따라서 소뇌의 약 절반을 꼬리 만 자르는 것이 중요합니다. 섹션에 부정적인 영향을 줄 수있는 또 다른 단계는 vibratome 속도와 진폭입니다. 권장 설정은 각각 7 및 6 용이지만 절단시 특정 부분이 PBS에서 분해되거나 고르지 않게 나타날 수 있습니다. 이것을 교정하기 위해서, 섹션이 inact 및 even, 6-8 사이의 설정이 될 때까지 한 번에 하나씩 vibratome 속도 또는 진폭을 미세하게 조정하십시오.
Golgi 염색을위한 상업용 키트가 있지만, 각 단계에 대한 정확한 세부 정보가 부족한 경우가 많습니다. 이 프로토콜을 사용하여 다른 실험실이 최소한의 문제 해결로 높은 품질로 조직을 확실하게 오염시킬 수 있도록하는 데 사용 된 모든 단계를 자세히보고합니다. 사용 된 재료는 대부분의 신경 과학 연구소에서 사용할 수 있습니다. 수상 돌기에서의 수차수지상 돌기 수의 변화와 변이는 수많은 신경 장애와 관련이 있습니다 31 . 또한, 수지상 수 arborization 이러한 섭동은 두뇌 32 화학 요법 부상의 중요한 형태학의 특징을 나타낼 수 있습니다 32 . 앞으로 우리는 5-Fu에 의해 유도 된 구조적 변화가 행동, 세포 및 분자 변화와 어떻게 관련이 있는지 조사 할 것입니다.
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Disclosures
저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 NIH P20 GM109005 (ARA) 및 Translational Neuroscience IDeA 프로그램 상 P30 GM110702 센터의 파일럿 보조금에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| superGolgi Kit | Bioenno Lifesciences | 30100 | Contains hazardous materials. |
| PBS 10x powder concentrate | Fisher | BP665-1 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| Permount | Fisher | SP 15-100 | |
| Slide cover | Fisher | 12-546-14 | |
| 7 mL Transfer pipette | Globe Scientific | 135030 | |
| 10 mL Falcon tubes | BD Biosciences | 352099 | |
| Foil | Fisher | 01-213-105 | |
| 12-well plate | BD Biosciences | 353043 | |
| 200 proof Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Xylene | Acros Organics | 1330-20-7 | Hazardous. |
| Permabond 200 | Permabond LLC | GF2492 | |
| 25 mL serological pipette | Sigma | SIAL1489 | |
| Parafilm | Midsci | HS234526C | |
| Vibratome | World Precision Instruments | NVSLM1 | |
| C57Bl/6 Male Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Axio Imager 2 | ZEISS | Multiple components, see website for details. | |
| AxioCam MRc Camera | ZEISS | 426508-9902-000 | |
| Staining Dish , Green | Tissue-Tek | 62541-12 | |
| Staining Dish Set | Electron Microscopy Sciences | 70312-20 | |
| Motorized Pipet Filler | Fisher | 03-692-168 | |
| Neurolucida | mbf Bioscience | ||
| Neurolucida Explorer | mbf Bioscience | ||
| Prism | GraphPad |
References
- Stuart, G. J., Spruston, N. Dendritic integration: 60 years of progress. Nat Neurosci. 18 (12), 1713-1721 (2015).
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
- Kulkarni, V. A., Firestein, B. L. The dendritic tree and brain disorders. Mol Cell Neurosci. 50 (1), 10-20 (2012).
- Kasai, H. Structural Dynamics of Dendritic Spines in Memory and Cognition. Trends Neurosci. 33 (3), 121-129 (2010).
- von Bohlen Und Halbach, O. Structure and function of dendritic spines within the hippocampus. Ann Anat. 191 (6), 518-531 (2009).
- Wayman, G. A., et al. Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2. Neuron. 50 (6), 897-909 (2006).
- Bourne, J. N., Harris, K. M. Balancing structure and function at hippocampal dendritic spines. Ann Rev Neurosci. 31, 47-67 (2008).
- Lai, K. O., Ip, N. Y. Structural plasticity of dendritic spines: the underlying mechanisms and its dysregulation in brain disorders. Biochim Biophys Acta. 1832 (12), 2257-2263 (2013).
- Harris, K. M. Structure, development, and plasticity of dendritic spines. Current Op Neurobiol. 9 (3), 343-348 (1999).
- Harris, K. M., Kater, S. B. Dendritic spines: cellular specializations imparting both stability and flexibility to synaptic function. Ann Rev Neurosci. 17, 341-371 (1994).
- Leuner, B., Shors, T. J. Stress, anxiety, and dendritic spines: what are the connections. Neuroscience. 251, 108-119 (2013).
- Harris, K. M., Fiala, J. C., Ostroff, L. Structural changes at dendritic spine synapses during long-term potentiation. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 358 (1432), 745-748 (2003).
- Kasai, H., Matsuzaki, M., Noguchi, J., Yasumatsu, N., Nakahara, H. Structure-stability-function relationships of dendritic spines. Trends Neurosci. 26 (7), 360-368 (2003).
- Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. The Golgi-Cox method. Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).
- Koyama, Y. The unending fascination with the Golgi method. OA Anat. 1 (3), 24 (2013).
- Pasternak, J. F., Woolsey, T. A. On the "selectivity" of the Golgi-Cox method. J Comp Neurol. 160 (3), 307-312 (1975).
- Friedland, D. R., Los, J. G., Ryugo, D. K. A modified Golgi staining protocol for use in the human brain stem and cerebellum. J Neurosci Methods. 150 (1), 90-95 (2006).
- Rosoklija, G., et al. Optimization of Golgi methods for impregnation of brain tissue from humans and monkeys. J Neurosci Methods. 131 (1-2), 1-7 (2003).
- de Castro, F., Lopez-Mascaraque, L., De Carlos, J. A.
- Gabbott, P. L., Somogyi, J. The "single" section Golgi-impregnation procedure: methodological description. J Neurosci Methods. 11 (4), 221-230 (1984).
- Zaqout, S., Kaindl, A. M. Golgi-Cox staining step by step. Front Neuroanat. 10 (38), (2016).
- superGolgi Kit. , Available from: http://www.ihcworld.com/products/ssdatasheets/superGolgi%20Kit%20Datasheet%20Protocol.pdf (2017).
- Vibroslice NVSL & Vibroslice NVSLM123. , Available from: https://www.wpiinc.com/clientuploads/pdf/NVSL_NVSLM1_IM.pdf (2000).
- Neurolucida 11.03. , MBF Bioscience. Williston, VT USA. (2017).
- Sholl, D. A. Dendritic organization in the neurons of the visual and motor cortices of the cat. J Anat. 87 (4), 387-406 (1953).
- Pillai, A. G., et al. Dendritic morphology of hippocampal and amygdalar neurons in adolescent mice is resilient to genetic differences in stress reactivity. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
- Morley, B. J., Mervis, R. F. Dendritic spine alterations in the hippocampus and parietal cortex of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor knockout mice. Neuroscience. 233, 54-63 (2013).
- Titus, A. D., et al. Hypobaric hypoxia-induced dendritic atrophy of hippocampal neurons is associated with cognitive impairment in adult rats. Neuroscience. 145 (1), 265-278 (2007).
- Groves, T. R., et al. 5-Fluorouracil chemotherapy upregulates cytokines and alters hippocampal dendritic complexity in aged mice. Behavioral Brain Research. 316, 215-224 (2017).
- Risher, W. C., Ustunkaya, T., Singh Alvarado, J., Eroglu, C. Rapid Golgi analysis method for efficient and unbiased classification of dendritic spines. PloS One. 9 (9), (2014).
- Kaufmann, W. E., Moser, H. W. Dendritic anomalies in disorders associated with mental retardation. Cerebral cortex. 10 (10), 981-991 (2000).
- Kulkarni, V. A., Firestein, B. L. The dendritic tree and brain disorders. Mol Cell Neurosci. 50 (1), 10-20 (2012).
