Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול Golgi-Cox בפירוט רב. זו שיטה אמינה רקמת כתם מאפשר הערכה איכותית גבוהה של cytoarchitecture בהיפוקמפוס, ובכל רחבי המוח כולו, עם פתרון מינימלי.
Abstract
קוצים דנדריטים הם הבולטים של פירים דנדריטים נוירונים המכילים סינפסות מעוררות. ההבדלים המורפולוגיים וההסתעפויות של הדנדריטים העצביים בתוך ההיפוקמפוס מעורבים בהבנה קוגניטיבית וזיכרון. ישנן מספר גישות מכתים Golgi, אשר כולם היו שימושיים לקביעת המאפיינים המורפולוגיים של דנדריטים סוכות לייצר רקע ברור. השיטה הנוכחית Golgi-Cox, (וריאציה קלה של הפרוטוקול מסופק עם ערכת מכתים Golgi מסחרי), נועד להעריך כיצד מינון נמוך יחסית של התרופה chemotherapeutic 5-flurouracil (5-Fu) ישפיע על המורפולוגיה הדנדריטים , את מספר הקוצים, ואת המורכבות של arborization בתוך ההיפוקמפוס. 5-Fu מאופיינת באופן משמעותי את המורכבות הדנדריטים והורידה את צפיפות עמוד השדרה לאורך ההיפוקמפוס באופן ספציפי לאזור. הנתונים המוצגים מראים כי שיטת מכתים Golgi efמוכתמים בצורה נוקשה את הנוירונים הבוגרים ב- CA1, CA3, ואת gyrus משוננת (DG) של ההיפוקמפוס. פרוטוקול זה מדווח על הפרטים עבור כל צעד, כך שחוקרים אחרים יכולים לרקום כתם אמין ברחבי המוח עם תוצאות באיכות גבוהה ופתרון בעיות מינימלי.
Introduction
הדנדריטים הם החלק הגדול ביותר של נוירונים המקבלים ומעבדים קלט presynaptic 1 . לתהליכים הדנדריטים שלהם יש גיאומטריה מורכבת, שבה לענפים הפרוקסימליים יש קוטר גדול יותר מאשר הענפים הדיסטליים. כמו דנדריטים לפתח, הם יוצרים מספר קשרים עם נוירונים אחרים בתהליך המכונה arborization דנדריטים. היקף ודפוס של הסתעפות זו קובעת את כמות התשומות הסינפטי כי דנדריט יכול לעבד כראוי 2 .
דבורריזם arborization הוא תהליך הכרחי עבור פעילות גמישות הפלסטיות ופיתוח תקין של מעגלים נוירונים. הארכה, חזרה, הסתעפות וסינפוגנזה הם תהליכים מורכבים הכוללים תוכניות גנטיות פנימיות והשפעות מגורמים חיצוניים. ההבדלים המורפולוגיים וההסתעפויות של הדנדריטים העצביים בתוך ההיפוקמפוס מעורבים בהבנה קוגניטיבית וזיכרוןF "> 3 , 4. השינויים במורכבות הדנדריטים קשורים לשינויים פתופיזיולוגיים והתנהגותיים 5. הפרעות קשורות למספר מצבי מחלה, כולל תסמונת X שבירה ותסמונת דאון 6 .
הקוצים הדנדריטים הם תאים תת תאיים מיוחדים של דבורות arbors לקבל קלט מעורר בתוך מערכת העצבים המרכזית. ישנם שלושה סוגים מורפולוגיים של קוצים דנדריטים, עם שם של כל שיעור על פי גודלם וצורתם: 1) קוצים פטריות, אשר יש צפיפויות מורכבות postsynaptic עם קולטני גלוטמט יותר מאשר קוצים אחרים 7 ; 2) קוצים קטנטנים, שאין להם גזע; ו 3) קוצים דקים, המורכבת גזע מתמשך, צר ראש גלובלית 8 . נפח עמוד השדרה הדנדריטי משמש בחלקו להגדרתם, עם קוצים דקים בדרך כלל קטנים יותר (0.01 מיקרומטר 3 3 ) 9 , 10 . הקוצים מתייצבים עם ההתבגרות. לדוגמה, קוצים דקים או נסוג לאחר כמה ימים או להתפתח פטיש spines. לחלופין, קוצים הפטרייה יציבים יחסית יכול לשרוד במשך תקופה ארוכה.החוזק של קשרים נוירונים הוא חשב להיות מבוסס על מספר הקוצים ו / או נפח שלהם 11 , 12 , 13 .
שיטת הקולי הקלסית הקלאסית והווריאציות המודרניות יותר שלה היו מועילות לבחינת המורפולוגיה והצפיפות של עמוד השדרה הדנדריטים. היבט ייחודי אחד של מכתים Golgi היא כי כתמי אקראי על 5% מכלל הנוירונים, המאפשר מעקב אחר נוירונים בודדים 14 , 15 . אמנם את המנגנון המדויק שבו Golgi מתכתמי אוד נוירונים בודדים עדיין לא ידוע, העיקרון של השיטה מבוססת על התגבשות של כרומט כסף (Ag 2 CrO 4 ) 16 , 17 . ישנם שלושה סוגים עיקריים של שיטת Golgi: Golgi מהירה, Golgi-Cox, ואת Golgi-Kopsch 18 , 19 . כל שלוש שיטות להתחיל עם שלב הדגירה הראשונית של מלחי כרום במשך מספר ימים עד חודשים, אבל יש הבדלים מפתח מסוימים ביניהם. Golgi מהירה משתמשת tetroxide אוסמיום בשלב הראשון, ואילו Golgi-Kopsch כולל paraformaldehyde. מכתים הן מהיר Golgi ו Golgi-Kopsch ואחריו הדגירה של פתרון חנקתי 1-2% כסף במשך כ -7 ימים. שיטת Golgi-Cox משתמשת כלוריד כספית אשלגן dichromate במקום חנקתי כסף יש זמן הספגה של 2-4 שבועות. הרקמות נחתכות וממוקמות במהירות באמוניה מדוללתפתרון, ואחריו מסדר צילום כדי להסיר מלחים. מבין שלושת הסוגים, שיטת Golgy-Cox נחשבת הטובה ביותר להכתים את הנמלים הדנדריטים ללא הפרעות רקע רבות, בין היתר, משום שמוצרי הבדולח אינם מופיעים על פני הרקמה (בניגוד לשיטת Golgi המהירה) 17 , 20 , 21 .
השיטה הנוכחית היא וריאציה קלה של הפרוטוקול שסופק עם ערכת מכתים Golgi מסחרי, והוא נועד להעריך כיצד מינון נמוך יחסית של 5-פו ישפיע על המאפיינים המורפולוגיים הדנדריטים וצפיפות עמוד השדרה. כל הנתונים שנרכשו יכולים לספק תובנה נוספת כיצד טיפול כימותרפי משפיע על המעגל העצבית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הניסויים נערכו בהתאם לסטנדרטים האתיים שאושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש הוועדה ב UAMS.
1. בעלי חיים 5-Fu הזרקת פרדיגמה
- רכישה 6 חודשים בן זכר C57Bl6 / J wild-type עכברים הבית אותם תחת מחזור קבוע 12 שעות אור / כהה עד שהם מגיעים 1 שנה.
- לדלל את 5-Fu ב -0.9% מלח סטרילית. השתמש 60 מ"ג / ק"ג כמו המינון הנדרש לכל עכבר.
- לתת זריקות intraperitoneal של 5-Fu (פעם בשבוע במשך שלושה שבועות).
- תן זריקות intraperitoneal סביב באותו זמן על כל יום. לדוגמה, בין 0900-1200 ח '.
- להרדים את החיות ולחלץ את המוח 30 יום לאחר ההזרקה הסופית.
2. המתת חסד והפקת המוח
- לרסן את המכרסם לתפוס את הבסיס של הזנב. ביד השנייה, הניחו את האגודל או את האצבע הראשונהבסיס צווארו של המכרסם. לחץ במהירות על הצוואר של המכרסם ודחוף קדימה בעוד היד השנייה מחזיקת את הזנב מושך לאחור.
- החזק את מכרסם ביד אחת ואת מספריים כירורגי גדול עם השני. מניחים את הצוואר של המכרז בין שני להבי במהירות לערוף את הראש.
- קח את ראש העכבר כרות, ולהשתמש במספריים בסדר לקצץ את הפרווה מעל הגולגולת, עד העיניים. לאחר מכן, מניחים את הקצות של המספריים לתוך כל שקע העין ולסגור את המספריים עם כוח קל.
- השתמש מספריים האביב לחתוך את הגולגולת משמאל לימין של המוח הקטן.
- השתמש במלקחיים כדי להרים את החלק של הגולגולת המקיפה את המוח הקטן ישירות מעלה ומטה.
- השתמש במספריים האביב לחתוך לאורך קו midsagittal של הגולגולת.
- השתמש במלקחיים כדי להרים את החלק הנותר של הגולגולת את המוח.
- השתמש מרית בדיקה כדי לגרוף את המוח לתוך המיכל הרצוי. באמצעות נירוסטה sלהב הלהב, לחתוך כל המוח לאורך המטוס בינוני. בצע את שיטת Golgi-Cox הבאה על ההמיספרות הימנית.
3. Golgi מכתים הכנת רקמות
- לטבול את המחצית שנקצרה טרי המוח לתוך פתרון 5 מ"ל כלוריד mercuric מבוסס (פתרון א מן הערכה) בצינור 10 חרוטי מ"ל. הפתרון כלוריד כספית הוא רגיש לאור; לכסות את הצינור עם רדיד. חנות המדגם בחושך בטמפרטורת החדר.
הערה: הפתרון A מסופק בערכה הרשומה בטבלת החומרים. זְהִירוּת! פתרון א '(המכונה גם פתרון כלוריד mercuric) מכיל ריאגנטים רעילים כגון dichromate אשלגן, כלוריד כספית, אשלגן כרומטי. ללבוש כפפות מגן ולעבוד ברדס קטר. - לאחר יום אחד, לאט לאט decant הפתרון לתוך מיכל זמני (כגון סירה שוקל גדול), ולהשליך אותו במיכל פסולת biohazard. לטבול את המוח (עדיין בצינורות 10 מ"ל המקורי חרוטי) עם 5 מ"ל שלאת הפתרון כלוריד כספית, ולהחזיר את המדגם לחושך בטמפרטורת החדר במשך 13 ימים נוספים.
- הוסף 30 גרם חיץ שלאחר הספגה ל 90 מ"ל מים מזוקקים או deionized (dH 2 O). ממלאים היטב כל צלחת 6-היטב עם 6.5 מ"ל של חיץ שלאחר הספגה, אחד לכל מוח
הערה: חיץ לאחר הספגה מסופק בערכה המפורטת בטבלת החומרים.- לאחר 14 ימים (בסך הכל) בפתרון כלוריד mercuric, לשטוף את הרקמה עם dH 2 O, ואז להעביר אותם לתוך 6 צלחות היטב עם חיץ שלאחר הספגה. מכסים את הצלחות בנייר כסף ומאחסנים אותם בטמפרטורת החדר בחושך.
- פיפטה את המאגר שלאחר הספגה לאחר יום אחד של טבילה ולחדש עם חיץ טרי שלאחר הספגה; לאחסן במשך יום אחד בחושך בטמפרטורת החדר. אם נדרש, לאחסן את זה ב 4 מעלות צלזיוס עד 1 חודש 22 .
4. חתך
- תווית 12 צלחות היטב על המכסים שלהם עם מספרים בסדר עולה משמאל לימין למעלה ולמטה.
- הכינו שתיים או שלוש צלחות 12 גם למוח אם חתך את המוח כולו.
- תווית את החלק העליון של כל 12-גם מכסה צלחת עם מספר הזיהוי של המוח מחולק.
- פיפטה 2 מ"ל של 1x PBS לתוך כל היטב של כל צלחת.
- הגדר את הבמה ולהפעיל את vibratome; להבטיח כי יש מספיק 1x PBS במיכל כדי לכסות את הרקמה.
- חותכים שתי חתיכות של סרט פלסטיק פרפין ולקפל אותם פעמיים. מניחים אותם על החורים של הדגימות מחזיק הדגימה כדי למנוע 1x PBS מ דולף על הדלפק.
- שים את הקלטת על בלוק רקמות של בעל הדגימה ולאחר מכן לשים דבק דבק cyanoacrylate (ראה טבלה של חומרים) על זה.
- הסר את המוח מהצלחת 6-היטב ומניחים אותו על צלחת פלסטיק או זכוכית. השתמש נירוסטהפלדה כפול קצוות להב לחתוך בערך מחצית המוח הקטן.
- חותכים את המוח הקטן caudally. ודא כי החלק של המוח הקטן שנותר הוא אפילו.
- מיד למקם את השטח השטוח של המוח הקטן שנותר על הדבק.
הערה: החלק האחורי של הרקמה (קליפת המוח) צריך להיות פונה שמאלה או ימינה יחסית להב. סוף מקורי כי בעבר הכילה את הנורה חוש הריח המצורפת צריך הפנים כלפי מעלה.- חכה לפחות כמה דקות כדי לוודא כי דבק מלא מתייבש.
- בעוד הדבק כי הוא מחזיק את המוח במקום ייבוש, לשפוך 1x PBS לתוך אמבט הדגימה. לאחר הדבק יבש, במקום בעל הדגימה עם הרקמה לתוך אמבט הדגימה.
- אם המדגם רקמה לא מכוסה באופן מלא, לשפוך 1x PBS יותר לתוך אמבט הדגימה.
- צרף את הלהב אל בעל הלהב של vibratome ולאט לאטOwer להב לתוך אמבט הדגימה עד שהוא שקוע לחלוטין 1x PBS. המשך להנמיך את הלהב עד שהוא מעט מתחת לראש הרקמה.
- הגדר את מהירות vibratome ל 7, משרעת ל 6, ואת זווית חיתוך עד 12 ° (ראה טבלה של חומרים מודל vibratome). הפעל את הרטט לחתוך 200 קטעים מיקרומטר 23 .
- השתמש במכחול גדול כדי להזיז את קטעי הרקמה מן האמבטיה הדגימה לתוך כל מיועד גם של 12 צלחות היטב.
- המשך לחתוך את הרקמה עד המספר הרצוי של קטעי רקמות הוא הגיע.
5. פוסט מכתים
- עבור כל אחד מהצעדים הבאים מכתים שטיפות, להשתמש 2 מ"ל של הפתרון המצוין היטב. השתמש מילוי פיפטה ממונע (ראה טבלה של חומרים) כדי להעביר את הפתרונות לתוך הבארות. השתמש פיפטה העברה (ראה טבלה של חומרים) כדי להעביר פתרונות מתוך הבארות לתוך הפסולת הנכונהמכולות.
- שוטפים את החלקים 30 דקות לשטוף של 0.01 M PBS-T (להוסיף 3.0 מ"ל של חומר ניקוי (ראה טבלה של חומרים) ל 1000 מ"ל 0.01 M PBS).
- הדלל פתרון הידרוקסיד אמוניום (זהירות) 3: 5 על ידי נפח עם dH 2 O מיד לפני השימוש. הכתם את הסעיפים הפתרון hydroxide אמוניום מדולל עבור 19-21 דקות.
- הגן על תמיסת הידרוקסיד אמוניום רגיש לאור עם רדיד.
הערה: אמוניום הידרוקסיד בתוך הפתרון יש ריכוז של ~ 10% והוא מסווג "מסוכנים". פתרון אמוניום הידרוקסיד עשוי לייצר כוויות אם הוא יוצר קשר עם העור. זה עלול לגרום לגירוי בדרכי הנשימה אם בשאיפה. ללבוש כפפות מגן ולעבוד ברדס קטר.
- הגן על תמיסת הידרוקסיד אמוניום רגיש לאור עם רדיד.
- הכתם את הסעיפים במאגר שלאחר מכתים (להוסיף 90 גרם של D מגיב ב 500 מ"ל DH 2 O) במשך 19-21 דקות. המאגר שלאחר הכתמה הוא רגיש לאור; להגן עליו עם נייר 22 .
- שוטפים את החלקים בשלושה, 5-10 דקות שוטף של 0.01 M PBS-T.
6. הרכבה, ניקוי וכיסוי
- הרכוב את החלקים על שקופיות מצופה ג'לטין 1% עם מכחול גדול. אפשר להם להתייבש במשך 20-30 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן למקם אותם צנצנת Coplin לילה.
- הסר את השקופיות עם הידיים כפפות מן הצנצנת Coplin ומניחים אותם במעמד פלסטיק (ראה טבלה של חומרים). מניחים את המדף פלסטיק צלחת מכתים (ראה טבלה של חומרים) המכיל אתנול 100%. מייבשים אותם עם שלושה 5 דקות שוטף.
- לשטוף את השקופיות פעמיים עבור 5 דקות כל 99% xylene. מניחים את השקופיות במעמד זכוכית להוריד את המדף לתוך צלחת מכתים זכוכית המכילים קסילן עם ידית מתכת (ראה טבלה של חומרים).
הערה: זהירות, קסילן מזיק אם בשאיפה וגורם לגירוי אם הוא נוגע בעור. הוא דליק מאוד במצבי נוזלים ואדים. ללבוש כפפות מגן ולעבוד ברדס קטר. - הסר את השקופיות מן xylEne אחד בכל פעם במהירות לכסות את הרקמה עם ~ 0.25 מ"ל של התקשורת הרכבה (ראה טבלה חומר). לאחר מכן, קח את כיסוי השקופיות והנח אותם על חומרי ההדפסה.
- דחוף את כל בועות האוויר הלכודות מתחת לכיסוי השקופית לקצה עם חפץ קהה, כגון קצה מכחול.
- מניחים את השקופיות באזור הרחק מאור השמש ולאפשר להם להתייבש במשך 2-3 ימים.
- המשך לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ וניתוח עם התוכנה המתאימה.
7. לרכוש מחסנית תמונה
- פתח את תוכנית ההדמיה (ראה טבלת חומרים ). מניחים את השקופית על הבמה של המיקרוסקופ. בתפריט שבראש התוכנית, לחץ על "רכישה" ולאחר מכן לחץ על "תמונה חיה".
- הגדר את המיקרוסקופ ל 10X. לזהות את הנוירון של העדפה ולאחר מכן להביא את הסמן, שנראה כמו X אדום, על מרכז סומה. לחץ שמאלה כדי להגדיר את נקודת ההתייחסות.
- הגדר את המיקרוסקופ ל 40X. לחץ על "העבר" מהתפריט בחלק העליון של התוכנית ולאחר מכן לחץ על "כדי נקודת התייחסות".
- להתחיל ליצור את ערימת התמונה על ידי גלילה ידנית עם המטרה בסדר מעל הרקמה עד שזה קצת מחוץ להתמקד.
- לחץ על "הגדר למעלה" בפינה הימנית התחתונה של התוכנית תחת הכותרת "רכישת תמונה".
- גלול מעט מתחת לרקמה עד שהוא קצת מחוץ להתמקד ולאחר מכן לחץ על "הגדר תחתית" תחת "רכישת תמונה". לאחר מכן, לחץ על "רכש מחסנית תמונה".
- לאחר רכישת ערימת התמונות, הקלד את השם הרצוי עבור קובץ התמונה בחלון שיופיע. שמור בשם "קובץ ASFII MBF."
- כאשר תתבקש, בחר את סוג הקובץ כ- "קובץ ערימת MBF JPEG2000" ולאחר מכן לחץ על "שמור".
8. מעקב נוירונים
- ב toolbaR מתחת לתפריט, לחץ על התיבה שכותרתה "שם קונטור". בחר "סומה" מהתפריט הנפתח.
- באופן ידני להתחקות אחר סומה. לאחר מכן לחץ לחיצה ימנית ובחר "סיום תא גוף" בעת מעקב הוא הושלם.
- בחר "AutoNeuron" להביא עוד לשונית שכותרתה "AutoNeuron זרימת עבודה."
- תחת "סוג תצורה", בחר "חדש". הגדר את הפרמטרים ולאחר מכן לחץ על "השלב הבא" כדי להעלות את הכותרת "Soma Detection".
- כדי להגדיר את הפרמטרים, בחר "Brightfield". הבא, תחת "מקס תהליך קוטר", לחץ על "התחל מדידה". באמצעות הסמן, עבור לבסיס של דנדריט להגדיר באופן ידני את הקוטר.
- לחץ על "כן" בחלון המבקש מהמשתמש לעקוב אחר כל התמונה. באופן ידני להתחקות אחר סומה. בטל את ההקלטה ולאחר מכן לחץ על "השלב הבא" כדי להעלות את הכותרת "מיקום זרע".
- לחץ על "Validate Seed"S "ולאחר מכן לחץ על" השלב הבא "כדי להעלות את" Neuron שחזור "משנה.
- תחת "Neuron", לחץ על "אינטראקטיבית". בצע מעקב אינטראקטיבי על ידי ביצוע הכיוון מהתוכנית של הדנדריטים ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להשלים את האזור המודגש שמקורו בתוכנית. לאחר מעקב אחר כל הדנדריטים, לחץ על "השלב הבא".
- לאחר הופעת חלון חדש, שמור את התצורה החדשה עם הכותרת הרצויה. לחץ על "שמור".
9. ניתוח
- פתח את תוכנית הניתוח (ראה טבלה של חומרים).
- לחץ על "קובץ" מהתפריט העליון ולאחר מכן לחץ על "פתח קובץ נתונים". בחר את קובץ הריבית.
- תחת כותרת המשנה ניתוח, בחר "ניתוח Sholl."
- בחלון "Sholl Analysis", הגדר את רדיוס המוצא ל 10 מיקרומטר. תחת "ניתוח", לחץ על תיבות "דנדריטים" ו "סניף סניפים".
- מימיןIck חלונות שנפתחו לאחרונה ולחץ על "ייצוא Excel." לחץ על "שמור".
- תחת הניתוח, לחץ על "ניתוח מבנה מסועף". בחר באפשרות 'כל הניתוחים האפשריים'.
- לחץ לחיצה ימנית על החלון שנפתח לאחרונה ולחץ על "ייצוא Excel" 24 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ההשפעות של טיפול 5-Fu על arborization המורכבות הדנדריטים ואת ההיפוקמפוס של קטעי מוח מוכתמים Golgi היו לכמת ו traced באמצעות תוכנת הדמיה זמין מסחרית. לאחר המעקב, ניתחו את ההסתגלות הדנדריטית, את צפיפות עמוד השדרה ואת מורפולוגיה עמוד השדרה באמצעות ניתוח Sholl ומדד המורכבות הדנדריטים (DCI). ניתוח Sholl היא שיטה כמותית אנליטית שניתן להשתמש בהם כדי לקבוע את מורפולוגיה דנדריטים arbor 25 . החל מן soma, מעגלים 10 מיקרומטר מלבד אחד את השני לכסות את tracings דנדריטים. אורך הדנדריטים נקבע על ידי מספר מעגלים כי הדנדריטים לחצות. ניתוח נקודת הסניף, שיטה כדי לקבוע את המורכבות של דנדריטים ארבור, מבוססת על המספר הכולל ואת הסדר של נקודות הסניף.
נקודת סניף מוגדרת כ- aהסניף מתחלק לשני תת-ענפים. סדר הענף הוא מדד למורכבות המבוססת על כמה פעמים הענפים מתחלקים. לדוגמה, נקודת סניף מסדר ראשון תהיה דנדריט המקורי המשתרע מן הסומה, ואילו נקודת סניף מסדר שני תהיה הנקודה שבה הסניף מתחלק לשני ענפי משנה. על ידי בחינת נקודות הענף וסדר הענף, המורכבות של החנות הדנדריטית (על סמך מספר נקודות הסניף) ובאיזה נקודות מתרחש הסניף (סדר סניף קטן יותר קרוב לסומה, בעוד שסדר ענפי גדול יותר הוא עוד מן soma) ניתן לקבוע. פרמטרים אלה יושמו על DCI. CA1 ו CA3 חולקו מנות apical והבסיס ונותחו באופן עצמאי 26 , 27 .
הדנדריטים של CA1 ו CA3 נוירונים פירמידליים נוירונים גרגר ב DG נותחו. כל הנוירונים שנבחרו עבורR כל קבוצה ניסיונית מילא את הקריטריונים הבאים: 1) הדנדריטים היו כהים ועקביים מכתים Golgi לאורך כל אורכם, 2) הדנדריטים היו בבירור טקט, ו 3) כל נוירון היה מספיק מקום ביניהם כדי למנוע הפרעות במהלך הניתוח 28 . איור 1 מראה נוירון שממלא את הקריטריונים לעיל. הנתונים התבטאו כ- SEM ממוצע. כדי לקבוע את ההבדלים הסטטיסטיים בין הזבל לבין קבוצות ה- 5-Fu, נעשה שימוש בשני מבחני זנב דו-זוגיים. כל הניתוחים הסטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנה אנליטית (ראה טבלת חומרים), p <0.5 נחשב משמעותי. ניתוח גורמים מעורבים (ANOVA) שימש כדי להעריך את ההשפעות של הטיפול 5-Fu ואת רדיוס Sholl. פישר בדיקות LSD פוסט-הוק שימשו לאחר ANOVA כאשר מתאים 29 .
בשני CA 1 ( t = 7.68, p <0.01, איור 2 א ' ) ו CA3 ( t = 7.54, p <0.01, איור 3 א ) דנדריטים פירמידליים אפיאליים, הייתה ירידה משמעותית משמעותית בעמוד השדרה בעקבות הטיפול 5-Fu. בעוד שהטיפול ב- 5-Fu לא השפיע באופן משמעותי על צפיפות עמוד השדרה הבסיסית של CA1 ( t = 1.79, p = 0.15, איור 2 ב ' ), היא הפחיתה באופן משמעותי את הקוצים הפדרליים של הדנדריטים הבסיסיים CA3 ( t = 5.57, p <0.05; ב ). יתר על כן, בדיקות פישר LSD פוסט הוק הראו ירידה של arborization הדנדריטים של הדנריטים CA1 peirramidal apical ב 40-100 מיקרומטר (LSD של פישר, p <0.001, איור 2 ג ) ו 130-160 מיקרומטר (LSD של פישר, p < 0.05;איור 2 C ) הרחק מן סומה לעומת בקרות מלוחים מטופלים.התופעה דומה נצפתה הדנדריטים apical הבסיסית CA1 ב 30-60 מיקרומטר (LSD של פישר, p <0.001, איור 2 D ) ו 70-110 Μm (LSD של פישר, p <0.05; איור 2 D ) הרחק מן soma 29 .
לגבי הדנדריטים הפירמידליים של CA3, לא היה הבדל משמעותי באורך הדנדריטי של המגזר בעקבות הטיפול ב- 5-Fu בהשוואה לקבוצת הביקורת המלוחה ( F (28,87) = 0.91, p = 0.59, איור 3 ג ). עם זאת, עבור הדנדריטים הפירמידליים CA3 הבסיסי, היה הבדל משמעותי בין טיפול 5-Fu ו פקקי טיפול מלוחים באורך הדנדריטי קטע ( F (25, 78) =1.85; P <0.05; איור 3 ד ). פישר של LSD גילה כי הטיפול 5-Fu ירד את arborization הדנדריטים ב 90-100 מיקרומטר ( p <0.01, איור 3 D ), 70-80 מיקרומטר ו 110-120 מיקרומטר (LSD של פישר, p <0.05, איור 3 D ) הרחק ממ som.
כדי לקבוע את המורכבות הדנדריטית, נעשה שימוש בניתוח סדר הענף כדי להשוות בין 5-Fu שטופלו לבין קבוצות בקרת הטיפול המלוחות. בתוך המינוח, ניתוח סדר הענף הראה הבדל משמעותי בין כל טיפול לסדר הענף ( F , 8, 36) = 25.61, p <0.001, איור 4 ). זה עוד נותח באמצעות LSD של פישר, אשר ציין כי היה אורך ירד ב 4 ו - 6לאחר טיפול 5-Fu ( p <0.001, איור 4 ) 29 .
איור 1 : נוירון מוכתמים Golgi המייצג את הקריטריונים הדמיה וניתוח נוסף. כל שלושת סוגי עמוד השדרה ניתן לראות בקלות בעקבות מכתים Golgi. מכתים הוא עקבי לאורך כל אורך דנדריט ואת דנדריט מבודד נוירונים אחרים. סולם בר, 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2 : גולגי מוכתם הורמונים הראו הבדלים משמעותיים בצפיפות עמוד השדרה בין 5-Fu שטופלו לבין קבוצות טיפול מלוחים ב CA1 apical, אבל לא CA1 הבסיסי. היה הבדל משמעותי אורך עמוד השדרה בין 5-Fu מטופלים ו מלוחים קבוצות טיפוליות הן apical והן basal CA1. ( א ) ב CA1 apical pyramidal dendrites, 5-Fu ירידה משמעותית צפיפות עמוד השדרה. ( ב ) בדנדריטים הבסיסיים, לא היו שינויים משמעותיים בצפיפות הכוללת של הקוצים. ( ג ) ניתוח Sholl גילה כי טיפול 5-Fu הפחית באופן משמעותי arborization דנדריטי ב 40-100 מיקרומטר ו 130-160 מיקרומטר הרחק soma ב CA1 דנדריטים פירמידליים apical. ( ד ) בדנדריטים הבסיסיים, הטיפול 5-Fu ירד את arborization הדנדריטים ב 30-60 מיקרומטר ו 70-110 מיקרומטר הרחק סומה. ממוצע ± SEM (n = 6). * P <0.05; ** p <0.01, ANOVA 29 .= "Http://csource.jove.com/files/ftp_upload/55696/55696fig2large.jpg" target = "_ blank"> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3 : נוירונים מוכתמים Golgi הראו הבדלים משמעותיים בצפיפות עמוד השדרה בין 5-Fu מטופלים ומלוחים קבוצות טיפוליות הן CA3 apical ו basal. היה הבדל משמעותי לאורך עמוד השדרה בין 5-Fu מטופלים ומלוחים קבוצות טיפול ב CA3 apical, אבל לא CA3 בסיסי. ( א ) ב CA3 apical pyramidal dendrites, 5-Fu ירידה משמעותית צפיפות עמוד השדרה. ( ב ) בדנדריטים הבסיסיים, 5-Fu הפחית באופן משמעותי את הצפיפות הכוללת של הקוצים. ( ג ) לא הייתה השפעה משמעותית של טיפול 5-Fu באזור CA 3 apical. ( ד ) בדנדריטים הבסיסיים, 5-Fu TreaTment ירד dborritic arborization 70-120 מיקרומטר הרחק soma. ממוצע ± SEM (n = 6). *, P <0.05; **, p <0.01, ANOVA 29 . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4 : נוירונים מוכתמים Golgi בתוך DG הראו אורך ירידה ב 4 ו - 6 צו לאחר טיפול 5-Fu לעומת הקבוצה שטופלו מלוחים. אורך לסדר סדר נוירונים פירמידליים של אזור ההיפוקמפוס CA1. ממוצע ± SEM (n = 6). * P <0.05; ** p <0.01, ANOVA 29 . טַעֲנָהלחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
לעומת טכניקות מודרניות יותר, שיטת Golgi-Cox יש כמה יתרונות שהופכים אותו לשיטה המועדפת לבדיקת מורפולוגיה עמוד השדרה: 1) מכתים ניתן להשתמש עבור כל רקמה, 2) אור בסיסי מיקרוסקופ ההתקנה היא כל מה שצריך לרכוש תמונות מבוסס Golgi, 3) ההדמיה Golgi-Cox הוא מהיר יותר מאשר הדמיה confocal, ו 4) חלקים מוכתמים Golgi הם קיימא במשך מספר חודשים עד שנים יותר מאשר דגימות כי הם fluorescently שכותרתו. גם עם יתרונות אלה, שיטת Golgi-Cox עדיין יש מגבלות מסוימות. ראשית, התהליך כולו הוא זמן רב מאוד, הדורש כמה שבועות של מכתים ואחריו ניתוח התמונות. כפי שנראה עם פרוטוקול זה, זה לוקח 14 ימים בפתרון A ו 1 יום בפתרון ב 'לפני החתך יכול להתחיל. בנוסף, ביצוע חתך, שלאחר מכתים, הרכבה ייקח 2-3 שעות לכל מוח. כל שקופית חייבת להתייבש למשך יום אחד לפני הניקוי וכיסוים. לאחר מכן, את כמות הזמןזה ייקח תמונה ולנתח את הסעיפים יהיה תלוי הפרט. שנית, ייתכנו בעיות של עקביות בין הנתונים של האנליסטים בשל הבדלים בקטגוריות קוצים 30 . מסיבה זו, מומלץ כי אדם אחד מבצע את החלק הדמיה ניתוח של כל ניסוי, אשר מרחיב עוד את משך הזמן להשלמת הפרויקט.
ישנם מספר צעדים קריטיים של שיטת Golgi-Cox הדורשים תזמון מדויק ותשומת לב. כאשר מכתים את הסעיפים עם הפתרון hydroxide אמוניום, זה הכרחי כי הסעיפים נשארים הפתרון לפחות 19 דקות, אבל לא מעל 21 דקות. אם הסעיפים אינם פתרון אמוניום הידרוקסיד מספיק זמן, הם לא יהיו מוכתמים כראוי, כלומר הנוירונים ייראה פחות מוגדר כאשר הדמיה, ובכך מקשה לנתח אותם. אם הסעיפים נמצאים פתרון אמוניום הידרוקסיד במשך 21 דקות, הם עשויים להפוך OVמוכתמים, ובכך מקשה על זיהוי נוירונים בודדים. לכן, כאשר מחליפים את הפתרונות, על החוקר לנוע במהירות. צעד חשוב נוסף הוא העברת החלקים לשקופיות. לפני העברת חלקים עם מכחול גדול, עדיף קודם להוסיף כמות קטנה של PBS-T על השקופית. זה מאפשר את הסעיפים בקלות להיות ממוקם על השקופית תמרון ללא פוטנציאל להתפרק. צעד קריטי נוסף הוא שלב הייבוש לאחר שהקטעים ממוקמים בשקופית. אם השקופיות לא יבש במשך לפחות 20 דקות בטמפרטורת החדר, ואז חלקים מסוימים סביר להניח ליפול במהלך שלבי התייבשות. אם השקופיות יבש במשך יותר מ 30 דקות, הם יהיו כנראה להיות שביר להתפרק במהלך התייבשות השלבים.
בעת ביצוע הליך זה, ישנם צעדים מסוימים שעשויים להיות בעייתי. לדוגמה, אם המוח הקטן כולו נחתך לפני הנחת המוח על המפרטאימן מחזיק וחתך, המוח עלול לפצח בנפרד לפני DG הוא חתך במלואו, עיבוד כל קטעי נוספים שמיש. לכן, חשוב רק לחתוך caudally דרך כמחצית המוח הקטן. צעד נוסף שעלול להשפיע לרעה על הסעיפים הוא מהירות vibratome ואת משרעת. כאשר ההגדרות המומלצות הן עבור 7 ו -6 בהתאמה, בעת חיתוך, חלקים מסוימים עלולים להתפורר ב- PBS או להיראות לא אחידים. כדי לתקן זאת, להתאים היטב את מהירות vibratome או משרעת, אחד בכל פעם עד הסעיפים הם ב-טקט ואפילו, בין הגדרות של 6-8.
למרות ערכות מסחריות עבור מכתים Golgi זמינים, הם לעתים קרובות חוסר פרטים מדויקים עבור כל צעד הפרט. עם פרוטוקול זה, אנו מדווחים בפירוט את כל השלבים שהיו בשימוש כדי לאפשר מעבדות אחרות לרקמה כתם אמין באיכות גבוהה עם פתרון בעיות מינימלי. החומרים המשמשים זמינים ברוב המעבדות של מדעי המוח. סטיות במורפורי דנדריטHolog ושינויים במספר הקוצים הדנדריטים קשורים למספר רב של הפרעות נוירולוגיות 31 . יתר על כן, הפרעות אלה של arborization הדנדריטים עשוי לייצג סימן ההיכר המורפולוגי משמעותי של כימותרפיה המושרה פגיעה במוח 32 . בעתיד, נבחן כיצד השינויים המבניים הנגרמים על ידי 5-Fu עשויים להתייחס לשינויים התנהגותיים, תאיים ומולקולריים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק פיילוט תחת NIH P20 GM109005 (ARA) ועל ידי המרכז לתרגום Neuroscience IDeA תוכנית הפרס P30 GM110702.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| superGolgi Kit | Bioenno Lifesciences | 30100 | Contains hazardous materials. |
| PBS 10x powder concentrate | Fisher | BP665-1 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| Permount | Fisher | SP 15-100 | |
| Slide cover | Fisher | 12-546-14 | |
| 7 mL Transfer pipette | Globe Scientific | 135030 | |
| 10 mL Falcon tubes | BD Biosciences | 352099 | |
| Foil | Fisher | 01-213-105 | |
| 12-well plate | BD Biosciences | 353043 | |
| 200 proof Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Xylene | Acros Organics | 1330-20-7 | Hazardous. |
| Permabond 200 | Permabond LLC | GF2492 | |
| 25 mL serological pipette | Sigma | SIAL1489 | |
| Parafilm | Midsci | HS234526C | |
| Vibratome | World Precision Instruments | NVSLM1 | |
| C57Bl/6 Male Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Axio Imager 2 | ZEISS | Multiple components, see website for details. | |
| AxioCam MRc Camera | ZEISS | 426508-9902-000 | |
| Staining Dish , Green | Tissue-Tek | 62541-12 | |
| Staining Dish Set | Electron Microscopy Sciences | 70312-20 | |
| Motorized Pipet Filler | Fisher | 03-692-168 | |
| Neurolucida | mbf Bioscience | ||
| Neurolucida Explorer | mbf Bioscience | ||
| Prism | GraphPad |
References
- Stuart, G. J., Spruston, N. Dendritic integration: 60 years of progress. Nat Neurosci. 18 (12), 1713-1721 (2015).
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
- Kulkarni, V. A., Firestein, B. L. The dendritic tree and brain disorders. Mol Cell Neurosci. 50 (1), 10-20 (2012).
- Kasai, H. Structural Dynamics of Dendritic Spines in Memory and Cognition. Trends Neurosci. 33 (3), 121-129 (2010).
- von Bohlen Und Halbach, O. Structure and function of dendritic spines within the hippocampus. Ann Anat. 191 (6), 518-531 (2009).
- Wayman, G. A., et al. Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2. Neuron. 50 (6), 897-909 (2006).
- Bourne, J. N., Harris, K. M. Balancing structure and function at hippocampal dendritic spines. Ann Rev Neurosci. 31, 47-67 (2008).
- Lai, K. O., Ip, N. Y. Structural plasticity of dendritic spines: the underlying mechanisms and its dysregulation in brain disorders. Biochim Biophys Acta. 1832 (12), 2257-2263 (2013).
- Harris, K. M. Structure, development, and plasticity of dendritic spines. Current Op Neurobiol. 9 (3), 343-348 (1999).
- Harris, K. M., Kater, S. B. Dendritic spines: cellular specializations imparting both stability and flexibility to synaptic function. Ann Rev Neurosci. 17, 341-371 (1994).
- Leuner, B., Shors, T. J. Stress, anxiety, and dendritic spines: what are the connections. Neuroscience. 251, 108-119 (2013).
- Harris, K. M., Fiala, J. C., Ostroff, L. Structural changes at dendritic spine synapses during long-term potentiation. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 358 (1432), 745-748 (2003).
- Kasai, H., Matsuzaki, M., Noguchi, J., Yasumatsu, N., Nakahara, H. Structure-stability-function relationships of dendritic spines. Trends Neurosci. 26 (7), 360-368 (2003).
- Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. The Golgi-Cox method. Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).
- Koyama, Y. The unending fascination with the Golgi method. OA Anat. 1 (3), 24 (2013).
- Pasternak, J. F., Woolsey, T. A. On the "selectivity" of the Golgi-Cox method. J Comp Neurol. 160 (3), 307-312 (1975).
- Friedland, D. R., Los, J. G., Ryugo, D. K. A modified Golgi staining protocol for use in the human brain stem and cerebellum. J Neurosci Methods. 150 (1), 90-95 (2006).
- Rosoklija, G., et al. Optimization of Golgi methods for impregnation of brain tissue from humans and monkeys. J Neurosci Methods. 131 (1-2), 1-7 (2003).
- de Castro, F., Lopez-Mascaraque, L., De Carlos, J. A.
- Gabbott, P. L., Somogyi, J. The "single" section Golgi-impregnation procedure: methodological description. J Neurosci Methods. 11 (4), 221-230 (1984).
- Zaqout, S., Kaindl, A. M. Golgi-Cox staining step by step. Front Neuroanat. 10 (38), (2016).
- superGolgi Kit. , Available from: http://www.ihcworld.com/products/ssdatasheets/superGolgi%20Kit%20Datasheet%20Protocol.pdf (2017).
- Vibroslice NVSL & Vibroslice NVSLM123. , Available from: https://www.wpiinc.com/clientuploads/pdf/NVSL_NVSLM1_IM.pdf (2000).
- Neurolucida 11.03. , MBF Bioscience. Williston, VT USA. (2017).
- Sholl, D. A. Dendritic organization in the neurons of the visual and motor cortices of the cat. J Anat. 87 (4), 387-406 (1953).
- Pillai, A. G., et al. Dendritic morphology of hippocampal and amygdalar neurons in adolescent mice is resilient to genetic differences in stress reactivity. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
- Morley, B. J., Mervis, R. F. Dendritic spine alterations in the hippocampus and parietal cortex of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor knockout mice. Neuroscience. 233, 54-63 (2013).
- Titus, A. D., et al. Hypobaric hypoxia-induced dendritic atrophy of hippocampal neurons is associated with cognitive impairment in adult rats. Neuroscience. 145 (1), 265-278 (2007).
- Groves, T. R., et al. 5-Fluorouracil chemotherapy upregulates cytokines and alters hippocampal dendritic complexity in aged mice. Behavioral Brain Research. 316, 215-224 (2017).
- Risher, W. C., Ustunkaya, T., Singh Alvarado, J., Eroglu, C. Rapid Golgi analysis method for efficient and unbiased classification of dendritic spines. PloS One. 9 (9), (2014).
- Kaufmann, W. E., Moser, H. W. Dendritic anomalies in disorders associated with mental retardation. Cerebral cortex. 10 (10), 981-991 (2000).
- Kulkarni, V. A., Firestein, B. L. The dendritic tree and brain disorders. Mol Cell Neurosci. 50 (1), 10-20 (2012).
