Summary
Здесь мы подробно представляем протокол Golgi-Cox. Этот надежный метод окрашивания тканей позволяет получить качественную оценку цитоархитектуры в гиппокампе и во всем мозге с минимальным устранением неполадок.
Abstract
Дендритные шипы - это выступы из нервных дендритных валов, которые содержат возбуждающие синапсы. Морфологические и ветвящиеся вариации нейронных дендритов внутри гиппокампа связаны с образованием и памятью. Существует несколько подходов к окрашиванию Гольджи, которые были полезны для определения морфологических характеристик дендритных беседок и получения четкого фона. Настоящий метод Гольджи-Кокса (небольшой вариант протокола, который снабжен коммерческим набором для окраски Гольджи) был разработан для оценки того, как относительно низкая доза химиотерапевтического препарата 5-flurouracil (5-Fu) повлияет на дендритную морфологию , Число шипов и сложность арборизации в гиппокампе. 5-Фу значительно модулировал дендритную сложность и уменьшал плотность позвоночника по всему гиппокампу в зависимости от региона. Представленные данные показывают, что метод окрашивания Гольджи efПодвергшихся эффекту окрашивания зрелых нейронов в CA1, CA3 и зубчатой извилине (DG) гиппокампа. В этом протоколе сообщается информация для каждого шага, чтобы другие исследователи могли надежно окрашивать ткань по всему мозгу с высоким качеством результатов и минимальным устранением неполадок.
Introduction
Дендриты являются самой большой частью нейронов, которые принимают и обрабатывают пресинаптический ввод 1 . Их дендритные процессы имеют сложную геометрию, где проксимальные ветви имеют больший диаметр, чем дистальные ветви. По мере развития дендритов они образуют несколько связей с другими нейронами в процессе, называемом дендритной арбонизацией. Степень и структура этого ветвления определяют количество синаптических входов, которые дендрит может адекватно обработать 2 .
Дендритная арборизация - необходимый процесс пластичности, зависящей от активности, и правильного развития нейронных цепей. Расширение, ретракция, ветвление и синаптогенез представляют собой сложные процессы, которые включают внутренние генетические программы и влияния внешних факторов. Морфологические и ветвящиеся вариации нейронных дендритов в гиппокампе участвуют в формировании познания и памятиF "> 3 , 4. Изменения в дендритной сложности связаны с патофизиологическими и поведенческими изменениями 5. Аномалии связаны с несколькими болезненными состояниями, включая синдром Fragile X и синдром Дауна 6 .
Дендритные шипы являются специализированными субклеточными отделениями дендритных беседок, которые получают возбуждающий вход в центральной нервной системе. Существуют три морфологических класса дендритных шипов с названием каждого класса по их размеру и форме: 1) грибные шипы, которые имеют сложные постсинаптические плотности с более глутаматными рецепторами, чем другие шипы 7 ; 2) колючие шипы, у которых нет стебля; И 3) тонкие шипы, которые состоят из затянувшегося узкого стебля и шаровидной головки 8 . Дендритный объем позвоночника частично используется для их определения, при этом тонкие шипы обычно меньше (0,01 мкм 3 3 ) 9 , 10 . Шипы стабилизируются созреванием. Например, тонкие шипы либо втягиваются через несколько дней, либо развиваются в грибные шипы. Альтернативно, грибные шипы относительно стабильны и могут выживать в течение длительного периода. Сила нейронных соединений, как полагают, основана на числе шипов и / или их объемах 11 , 12 , 13 .
Классический метод окрашивания Гольджи и его более современные вариации были полезны для изучения морфологии и плотности дендритных позвонков. Одним из уникальных аспектов окраски Гольджи является то, что он случайно окрашивает около 5% всех нейронов, что позволяет отслеживать отдельные нейроны 14 , 15 . Хотя точный механизм, в котором метод ГольджиOd, отдельные нейроны до сих пор неизвестны, принцип метода основан на кристаллизации хромата серебра (Ag 2 CrO 4 ) 16 , 17 . Существует три основных типа метода Гольджи: быстрый Гольджи, Гольджи-Кокс и Гольджи-Копш 18 , 19 . Все три метода начинаются с начальной фазы инкубации в солях хрома в течение от нескольких дней до нескольких месяцев, но между ними существуют определенные ключевые различия. Быстрое Гольджи использует четырехокись осмия на первом этапе, тогда как Гольджи-Копш включает параформальдегид. Окрашивание как в быстром Гольджи, так и в Гольджи-Копше сопровождается инкубацией в 1-2% растворе нитрата серебра в течение примерно 7 дней. Метод Гольджи-Кокса использует хлорид ртути и дихромат калия вместо нитрата серебра и имеет время пропитки 2-4 недель. Затем ткани секционируют и быстро помещают в разбавленный аммиакРаствор, затем фотографический фиксатор для удаления солей. Из трех типов метод Гольджи-Кокса считается лучшим при окрашивании дендритных беседок без значительных фоновых помех, отчасти потому, что кристаллические артефакты не встречаются на поверхности ткани (в отличие от быстрого метода Гольджи) 17 , 20 , 21 .
Настоящий способ представляет собой небольшое изменение протокола, снабженного коммерческим набором для окрашивания Гольджи, и был разработан для оценки того, как относительно низкая доза 5-фу будет влиять на дендритные морфологические характеристики и плотность позвоночника. Любые полученные данные могут дать дальнейшее представление о том, как химиотерапевтическое лечение влияет на схему нейронов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эксперименты проводились в соответствии с этическими стандартами, одобренными Комитетом по охране и использованию животных в УАМС.
1. Животные и парадигма инъекции 5-фу
- Приобретите 6-месячных мышей C57Bl6 / J дикого типа и разместите их под постоянным 12-часовым светом / темным циклом до достижения ими 1 года.
- Разбавьте 5-фу в стерильном физиологическом растворе 0,9%. Используйте 60 мг / кг в качестве необходимой дозы на мышь.
- Дайте внутрибрюшинные инъекции 5-фу (один раз в неделю в течение трех недель).
- Дайте внутрибрюшинные инъекции примерно в одно и то же время в каждый день. Например, между 0900-1200 ч.
- Усыплять животных и извлекать мозг через 30 дней после окончательной инъекции.
2. Процедура эвтаназии и экстракция мозга
- Сдерживайте грызуна и хватайте основание хвоста. С другой стороны, поместите большой палец или первый палец на thЕ основание грызуна. Быстро надавите на шею грызуна и нажмите вперед, а другая рука держит хвост, тянет назад.
- Держите грызуна одной рукой, а крупные хирургические ножницы - с другой. Поместите шею грызуна между двумя лезвиями и быстро обезглавьте голову.
- Возьмите отрубленную головку мыши и используйте тонкие ножницы, чтобы обрезать мех над черепом, вплоть до глаз. Затем поместите кончики ножниц в каждое гнездо для глаз и слегка задвиньте ножницы.
- Используйте пружинные ножницы, чтобы разрезать череп слева и справа от мозжечка.
- Используйте щипцы, чтобы поднять часть черепа вокруг мозжечка прямо вверх и вниз.
- Используйте пружинные ножницы, чтобы разрезать вдоль линии майдагиттала черепа.
- Используйте щипцы, чтобы снять оставшуюся часть черепа с мозга.
- Используйте шпатель и зонд, чтобы выкопать мозг в желаемый контейнер. Использование нержавеющей сталиЛезвие тила, разрезают каждый мозг вдоль плоскости среднего сечения. Выполните следующий метод Гольджи-Кокса в правом полушарии.
3. Golgi окрашивание и подготовка тканей
- Погрузите свежесобранные полумодины в 5 мл раствора на основе хлорида ртути (раствор А из набора) в 10 мл коническую трубку. Раствор хлорида ртути является светочувствительным; Закройте трубу фольгой. Храните образец в темноте при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ. Решение A предоставляется в комплекте, который указан в таблице материалов. Внимание! Раствор А (также называемый раствором хлорида ртути) содержит токсичные реагенты, такие как дихромат калия, хлорид ртути и хромат калия. Носите защитные перчатки и работайте в вытяжном шкафу. - Через 1 день медленно декантируйте раствор во временном контейнере (например, большой лодке для взвешивания) и утилизируйте его в контейнере для отходов биологической опасности. Погрузите мозг (все еще в исходные 10 мл конические пробирки) с 5 млРаствор хлорида ртути и возвращают образец в темное место при комнатной температуре в течение еще 13 дней.
- Добавить 30 г буфера после пропитки до 90 мл дистиллированной или деионизированной воды (dH 2 O). Заполните каждую лунку 6-луночного планшета 6,5 мл буфера после пропитки, одну лунку на один мозг
ПРИМЕЧАНИЕ. Буфер после пропитки предоставляется в комплекте, который указан в таблице материалов.- Через 14 дней (в общем) в растворе хлорида ртути промойте ткань dH 2 O, затем перенесите их в 6-луночные планшеты с буфером после пропитки. Накройте пластины фольгой и храните их при комнатной температуре в темноте.
- Пипеткой после пропитки буфера после 1 дня погружения и возобновить со свежим буфером после пропитки; Хранить в течение 1 дня в темноте при комнатной температуре. При необходимости храните его при температуре 4 ° C в течение 1 месяца 22 .
4. Разделение
- Наклейте 12-луночные планшеты на их крышки с номерами в порядке возрастания слева направо и вверх-вниз.
- При отделении всего мозга подготовьте две или три 12-луночных планшета на один мозг.
- Обозначьте верхнюю часть каждой крышки из 12 ячеек с идентификационным номером разделенного мозга.
- Пипетируйте 2 мл 1x PBS в каждую лунку каждой тарелки.
- Настройте сцену и включите вибрацию; Убедитесь, что в контейнере достаточно 1x PBS для покрытия ткани.
- Вырежьте два куска пластиковой парафиновой пленки и сложите их дважды. Поместите их поверх отверстий для ручек держателя образца, чтобы предотвратить прохождение 1x PBS на счетчик.
- Положите ленту на тканевой блок держателя образца, а затем нанесите на нее цианоакрилатный клей (см. Таблицу материалов).
- Удалите мозг из 6-луночного планшета и поместите его на пластиковую или стеклянную посуду. Использовать нержавеющую стальСтальной обоюдоострый клинок, чтобы обрезать около половины мозжечка.
- Вытрите мозжечок каудально. Убедитесь, что остальная часть мозжечка остается ровной.
- Немедленно поместите плоскую поверхность оставшегося мозжечка на клей.
ПРИМЕЧАНИЕ. Дорсальная часть ткани (коры головного мозга) должна быть направлена влево или вправо относительно лезвия. Ростральный конец, который ранее содержал обонятельную луковицу, должен быть направлен вверх.- Подождите, по крайней мере, несколько минут, чтобы убедиться, что клей полностью высохнет.
- В то время как клей, который держит мозг на месте, сушит, залить 1x PBS в ванну для образцов. После того, как клей высохнет, поместите держатель образца в ткань в ванну с образцом.
- Если образец ткани не полностью покрыт, залейте более 1x PBS в ванну для образцов.
- Прикрепите лезвие к держателю лезвия вибратома и медленно lЗалейте лезвие в ванну с образцом до полного погружения в 1x PBS. Продолжайте опускать лезвие, пока оно немного под верхушкой ткани.
- Установите скорость вибрации на 7, амплитуду 6 и угол резания на 12 ° (см. Таблицу материалов для модели вибратома). Запустите вибрацию и отрежьте секции 200 мкм 23 .
- Используйте большую кисть для перемещения участков ткани из ванны для образцов в каждую указанную лунку 12-луночных планшетов.
- Продолжайте резать ткань до тех пор, пока не будет достигнуто желаемое количество участков ткани.
5. После окрашивания
- Для каждого из следующих этапов окрашивания и полосканий используйте 2 мл указанного раствора на лунку. Используйте моторный наполнитель для пипеток (см. Таблицу материалов) для переноса растворов в скважины. Используйте переносную пипетку (см. Таблицу материалов) для переноса растворов из колодцев и в надлежащие отходыконтейнеры.
- Промойте секции в течение 30 минут промывки 0,01 М PBS-T (добавьте 3,0 мл моющего средства (см. Таблицу материалов) до 1000 мл 0,01 М PBS).
- Разбавьте раствор гидроксида аммония (осторожно) 3: 5 по объему с dH 2 O непосредственно перед использованием. Процедите участки в разбавленном растворе гидроксида аммония в течение 19-21 мин.
- Защитите светочувствительный раствор гидроксида аммония с фольгой.
ПРИМЕЧАНИЕ. Гидроксид аммония в растворе имеет концентрацию ~ 10% и классифицируется как «опасный». Раствор гидроксида аммония может вызвать ожоги, если он контактирует с кожей. Это может вызвать раздражение дыхательных путей при вдыхании. Носите защитные перчатки и работайте в вытяжном шкафу.
- Защитите светочувствительный раствор гидроксида аммония с фольгой.
- Процедите участки в буфере после окрашивания (добавьте 90 г реагента D в 500 мл dH 2 O) в течение 19-21 мин. Буфер после окрашивания является светочувствительным; Защитить его фольгой 22 .
- Промойте секции в три, 5-10 мин промывки 0,01 М PBS-T.
6. Монтаж, чистка и покрытие
- Установите секции на 1% покрытых желатином слайдов большой кистью. Дайте им высохнуть в течение 20-30 мин при комнатной температуре, а затем помещайте их в банку Coplin на ночь.
- Снимите слайды с перчатками из банки Coplin и поместите их в пластиковую стойку (см. Таблицу материалов). Поместите пластиковую стойку в окрашивающую тарелку (см. Таблицу материалов), содержащую 100% этанол. Обезвоживают их тремя 5-минутными моющими средствами.
- Вымойте слайды дважды в течение 5 минут каждый в 99% ксилоле. Поместите слайды в стеклянную стойку и опустите стойку в стакан для окрашивания, содержащий ксилол с металлической ручкой (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ. Осторожно, ксилол вреден при вдыхании и вызывает раздражение, если он касается кожи. Он легко воспламеняется в жидком и парообразном состоянии. Носите защитные перчатки и работайте в вытяжном шкафу. - Удалите слайды из ксилаИ постепенно покрывают ткань с помощью ~ 0,25 мл монтажной среды (см. Таблицу материалов). Затем возьмите ползунки и положите их на носитель.
- Нажимайте любые запертые пузырьки воздуха под ползунками к краю тупым предметом, таким как конец кисти.
- Поместите слайды в область, удаленную от солнечного света, и дайте им высохнуть в течение 2-3 дней.
- Приступайте к приобретению изображений с помощью микроскопа и анализу с помощью соответствующего программного обеспечения.
7. Приобретите стек изображений
- Откройте программу обработки изображений (см. Таблицу материалов ). Поместите слайд на ступень микроскопа. В меню в верхней части программы нажмите «Приобретение», а затем нажмите «Живое изображение».
- Установите микроскоп на 10X. Определите нейрон предпочтительности, а затем верните курсор, который выглядит как красный X, в центр сомы. Щелкните левой кнопкой мыши, чтобы установить контрольную точку.
- Установите микроскоп на 40X. Нажмите «Переместить» в меню в верхней части программы, а затем нажмите «К контрольной точке».
- Начните создавать стек изображений вручную, прокручивая с тонкой целью над тканью, пока она не окажется в фокусе.
- Нажмите «Установить верх» в нижнем правом углу программы под заголовком «Приобретение изображения».
- Прокрутите немного под ткань до тех пор, пока она немного не в фокусе, а затем нажмите «Установить снизу» в разделе «Приобретение изображения». Затем нажмите «Получить стек изображений».
- После того, как стек изображения будет получен, введите нужное имя файла изображения в появившемся окне. Сохранить как «файл MBF Ascii».
- При появлении запроса выберите тип файла как «файл стека MBF JPEG2000», а затем нажмите «Сохранить».
8. Отслеживание нейронов
- В инструментеR под меню, щелкните поле «Название контура». Выберите «Soma» в раскрывающемся меню.
- Вручную проследите за сомой. Затем щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Finish Cell Body», когда трассировка завершена.
- Выберите «AutoNeuron», чтобы открыть еще одну вкладку «AutoNeuron Workflow».
- В разделе «Тип конфигурации» выберите «Создать». Задайте параметры и нажмите «Следующий шаг», чтобы открыть подзаголовок «Soma Detection».
- Чтобы установить параметры, выберите «Brightfield». Затем в разделе «Max Process Diameter» нажмите «Начать измерение». Используя курсор, перейдите к основанию дендрита и вручную установите диаметр.
- Нажмите «Да» в окне, которое попросит пользователя проследить все изображение. Вручную проследите за сомой. Unclick и затем нажмите «Следующий шаг», чтобы открыть подзаголовок «Размещение семян».
- Нажмите «Подтвердить семя»S ", а затем нажмите« Следующий шаг », чтобы подвести подзаголовок« Реконструкция нейрона ».
- В разделе «Нейрон» нажмите «Интерактивный». Выполните интерактивную трассировку, следуя направлению от программы дендритов и щелкнув правой кнопкой мыши, чтобы завершить выделенную область, прослеженную программой. После отслеживания всех дендритов нажмите «Следующий шаг».
- После появления нового окна сохраните новую конфигурацию с нужным названием. Нажмите «Сохранить».
9. Анализ
- Откройте программу анализа (см. Таблицу материалов).
- Нажмите «Файл» в верхнем меню, а затем нажмите «Открыть файл данных». Выберите интересующий файл.
- В подзаголовке анализа выберите «Sholl Analysis».
- В окне «Sholl Analysis» установите радиус запуска до 10 мкм. В разделе «Анализ» щелкните по ячейкам «Дендриты» и «Филиалы».
- Правый clIck только что открытые окна и нажмите «Экспорт Excel». Нажмите «Сохранить».
- В рамках анализа нажмите «Анализ разветвленной структуры». Выберите «Все возможные анализы».
- Щелкните правой кнопкой мыши только что открытое окно и нажмите «Экспорт Excel» 24 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Влияние обработки 5-фу на дендритную арбонизацию и сложность гиппокампа окрашенных в Гольджи разделов мозга определяли количественно и отслеживали с использованием коммерчески доступного программного обеспечения для обработки изображений. После трассировки дендритная арборизация, плотность позвоночника и морфология позвоночника были проанализированы с использованием анализа Шолла и индекса дендритной сложности (DCI). Анализ Sholl представляет собой количественный аналитический метод, который может быть использован для определения морфологии дендритных беседок 25 . Начиная с сомы, круги на расстоянии 10 мкм друг от друга перекрывают дендритные следы. Длина дендритов определяется числом окружностей, пересекающихся дендритами. Анализ точки ветвления, метод определения сложности древовидной беседки, основан на общем числе и порядке точек ветвления.
Точка ветвления определяется как когдаВетвь разбивается на две ветви. Порядок ветвления является мерой сложности, основанной на том, сколько раз разветвляются ветви. Например, точкой ветвления первого порядка будет исходный дендрит, простирающийся от сомы, тогда как точка ветвления второго порядка будет точкой, в которой ветвь делит на две подверии. Изучая как точки ветвления, так и порядок ветвления, сложность дендритной беседки (в зависимости от количества точек ветвления) и в каких точках происходит ветвление (меньший порядок ветвления ближе к соме, а более крупный порядок ветвления - Далее от сомы). Эти параметры были применены к DCI. CA1 и CA3 были разделены на апикальные и базальные части и анализировались независимо 26 , 27 .
Проанализированы дендриты пирамидальных нейронов CA1 и CA3 и нейронов гранул в DG. Все нейроны, выбранные дляКаждая экспериментальная группа выполняла следующие критерии: 1) дендриты имели темную и непротиворечивую окраску Гольджи по всей их длине; 2) дендриты были заметно в тактике; 3) у каждого нейрона было достаточно места между ними для предотвращения помех во время анализа 28 . На рисунке 1 показан нейрон, который соответствует указанным выше критериям. Данные были выражены как среднее ± SEM. Для определения статистических различий между фиктивными и 5-фу-группами использовали парный двухсторонний t- критерий. Все статистические анализы проводились с использованием аналитического программного обеспечения (см. Таблицу материалов), а р <0,5 считалось значительным. Для оценки влияния обработки 5-Фу и радиуса Шолла использовался дисперсионный анализ дисперсии (ANOVA). Последовательные тесты Fisher LSD использовались после ANOVA, когда это было целесообразно 29 .
В обоих CA 1 ( t = 7,68, p <0,01, Рисунок 2 A ) и CA3 ( t = 7,54, p <0,01; Рисунок 3 A ) апикальные пирамидальные дендриты, произошло значительное сокращение шипов после лечения 5-фу. В то время как лечение 5-Фу не оказало существенного влияния на базальную плотность позвоночника CA1 ( t = 1,79, p = 0,15, Рисунок 2 B ), это значительно уменьшало базальные пирамидальные дендритные шипы CA3 ( t = 5,57, p <0,05; B ). Кроме того, послеоперационные тесты Fisher LSD выявили уменьшение дендритной арборизации апикальных пирамидальных дендритов CA1 при 40-100 мкм (ЛСД Фишера, p <0,001; Рисунок 2 C ) и 130-160 мкм (ЛСД Фишера, p < 0,05;Ig "> Рисунок 2 C ) вдали от сомы по сравнению с контролируемыми физиологическим раствором. Аналогичное явление наблюдалось в базальных апикальных дендритах CA1 при 30-60 мкм (ЛСД Фишера, p <0,001, Рисунок 2 D ) и 70-110 Μm (ЛСД Фишера, p <0,05; Рисунок 2 D ) от сомы 29 .
Что касается апикальных пирамидальных дендритов CA3, то значительная разница в сегментной дендритной длине после обработки 5-футом по сравнению с контролируемыми физиологическим раствором контролем ( F (28,87) = 0,91; p = 0,59; Однако для базальных пирамидальных дендритов CA3 наблюдалось существенное различие между обработкой 5-Фу и контролируемыми физиологическим раствором контролем в сегментной дендритной длине ( F (25, 78) =1,85; P <0,05; Рисунок 3 D ). ЛСД Фишера показало, что обработка 5-Фу уменьшала дендритную арбонизацию при 90-100 мкм ( р <0,01, Рисунок 3 D ), 70-80 мкм и 110-120 мкм (ЛСД Фишера, р <0,05, Рисунок 3 D ) От сомы 29 .
Для определения дендритной сложности для сравнения обработанных 5-футом и контрольных групп, обработанных физиологическим раствором, использовали анализ последовательности ветвей. Внутри DG анализ порядка ветвей показал значительную разницу между каждой обработкой и порядком ветвления ( F (8, 36) = 25,61, p <0,001; Рисунок 4 ). Это было дополнительно проанализировано с использованием ЛСД Фишера, что указывает на уменьшение длины на 4- м и 6- мПорядок после обработки 5-фу ( p <0,001; рисунок 4 ) 29 .
Рисунок 1 : нейроны, окрашенные Гольджи, которые представляют критерии для визуализации и дальнейшего анализа. Все три типа позвоночника можно легко увидеть после окрашивания Гольджи. Окрашивание согласовано по всей длине дендрита, а дендрит изолирован от других нейронов. Шкала шкалы, 5 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2 : Golgi окрашен n Эвроны продемонстрировали значительные различия в плотности позвоночника между обработанными 5-Фу и группами, обработанными физиологическим раствором, в апикальном СА1, но не базальным СА1. Существенное различие в длине позвоночника между обработанными 5-футом и физиологически обработанными группами как в апикальном, так и в базальном СА1. ( A ) В апикальных пирамидальных дендритах CA1 5-Fu значительно уменьшало плотность позвоночника. ( Б ) В базальных дендритах существенных изменений общей плотности шипов не произошло. ( C ) Анализ Sholl показал, что обработка 5-футом значительно уменьшала дендритную арбонизацию при 40-100 мкм и 130-160 мкм от сомы в апикальных пирамидальных дендритах CA1. ( D ) В базальных дендритах обработка 5-Фу уменьшала дендритную арбонизацию при 30-60 мкм и 70-110 мкм от сомы. Среднее ± SEM (n = 6). * P <0,05; ** p <0,01, ANOVA 29 .= "Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55696/55696fig2large.jpg" target = "_ blank"> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3 : Гольджи окрашенные нейроны продемонстрировали значительные различия в плотности позвоночника между обработанными 5-футом и физиологически обработанными группами как в апикальном, так и в базальном СА3. Существенное различие в длине позвоночника между обработанными 5-футом и физиологически обработанными группами в апикальном СА3, но не базальным СА3. (A) В апикальных пирамидальных дендритах CA3 5-Fu значительно уменьшало плотность позвоночника. ( Б ) В базальных дендритах 5-Фу значительно уменьшило общую плотность шипов. ( C ) Существенного влияния 5-фу лечения в апикальной области СА 3 не было. ( D ) В базальных дендритах 5-фу treaУменьшала дендритную арбонизацию на 70-120 мкм от сомы. Среднее ± SEM (n = 6). *, Р <0,05; **, p <0,01, ANOVA 29 . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4 : Гольджи окрашенные нейроны в DG показали уменьшенную длину на 4- м и 6- м порядках после 5-фу лечения по сравнению с обработанной физиологическим раствором группой. Длина на порядок ветвления в пирамидальных нейронах области гиппокампа CA1. Среднее ± SEM (n = 6). * P <0,05; ** p <0,01, ANOVA 29 . мольбаНажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
По сравнению с более современными методами метод Гольджи-Кокса имеет ряд преимуществ, которые делают его предпочтительным методом для изучения морфологии позвоночника: 1) окрашивание может использоваться практически для любой ткани; 2) базовая установка светового микроскопа - это все, что необходимо для Приобретать изображения на основе Гольджи, 3) изображение Гольджи-Кокса быстрее, чем конфокальная визуализация, и 4) окрашенные участки Гольджи жизнеспособны в течение нескольких месяцев до нескольких лет, чем образцы, которые флуоресцентно маркируются. Даже с этими преимуществами метод Гольджи-Кокса все еще имеет определенные ограничения. Во-первых, весь процесс занимает много времени, требуя нескольких недель окрашивания, после чего анализируются изображения. Как видно из этого протокола, в растворе A и в течение дня в растворе B требуется 14 дней, прежде чем начнется секционирование. Кроме того, выполнение секционирования, после окрашивания и монтажа займет 2-3 часа на мозг. Каждый слайд должен высохнуть в течение 1 дня перед очисткой и закрытием. После этого количество времениЭто займет изображение, и анализ разделов будет зависеть от человека. Во-вторых, могут быть проблемы согласованности данных аналитиков из-за различий в классификации шипов 30 . По этой причине рекомендуется, чтобы один человек выполнял часть изображения и анализа каждого эксперимента, что еще больше увеличивает время завершения проекта.
Существует несколько критических шагов метода Гольджи-Кокса, которые требуют точного времени и внимания. При окрашивании секций раствором гидроксида аммония необходимо, чтобы секции оставались в растворе не менее 19 мин, но не более 21 мин. Если секции не находятся в растворе гидроксида аммония в течение достаточного времени, они не будут правильно окрашены, что означает, что нейроны будут выглядеть менее определенными при визуализации, что затрудняет их анализ. Если секции находятся в растворе гидроксида аммония в течение более 21 мин, они могут статьEr-stained, что затрудняет идентификацию отдельных нейронов. Поэтому при переключении решений исследователь должен быстро двигаться. Другим важным шагом является передача секций на слайды. Прежде чем перемещать секции с помощью большой кисти, лучше сначала добавить небольшое количество PBS-T на слайд. Это позволяет легко размещать секции на слайде и маневрировать без разрыва. Еще одним критическим шагом является этап сушки после того, как секции размещены на слайде. Если слайды не высушиваются в течение не менее 20 мин при комнатной температуре, то некоторые секции, скорее всего, отпадают во время этапов обезвоживания. Если слайды высохнут дольше 30 мин, они, скорее всего, станут хрупкими и разрываются во время этапов обезвоживания.
При выполнении этой процедуры есть определенные шаги, которые могут быть неприятными. Например, если весь мозжечок срезан, прежде чем помещать мозг в спецификациюImen держатель и секционирование, мозг может расколоться перед тем, как DG будет полностью разделен, что сделает любые другие секции непригодными для использования. Поэтому важно только каудально резать примерно половину мозжечка. Другим шагом, который может отрицательно повлиять на секции, является скорость вибрации и амплитуда. Хотя рекомендуемые настройки для 7 и 6 соответственно, при разрезании некоторые разделы могут распадаться в PBS или выглядят неравномерно. Чтобы исправить это, аккуратно отрегулируйте либо скорость вибрации, либо амплитуду, по одному, пока секции не находятся в тактике и даже между установками 6-8.
Несмотря на то, что доступны коммерческие наборы для окрашивания Гольджи, они часто не имеют точных деталей для каждого отдельного шага. В этом протоколе мы подробно расскажем о всех шагах, которые были использованы, чтобы позволить другим лабораториям надежно окрашивать ткань с высоким качеством с минимальным устранением неполадок. Используемые материалы доступны большинству нейронаучных лабораторий. Аберрации в дендрите morpHology и изменения в количестве дендритных шипов связаны с множеством неврологических расстройств 31 . Более того, эти возмущения дендритной арборизации могут представлять собой значительный морфологический признак индуцированной химиотерапией травмы в головном мозге 32 . В будущем мы рассмотрим, как структурные изменения, вызванные 5-фу, могут относиться к поведенческим, клеточным и молекулярным изменениям.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана пилотным грантом в соответствии с NIH P20 GM109005 (ARA) и наградой программы P30 GM110702 от программы трансляционной нейронауки.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| superGolgi Kit | Bioenno Lifesciences | 30100 | Contains hazardous materials. |
| PBS 10x powder concentrate | Fisher | BP665-1 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| Permount | Fisher | SP 15-100 | |
| Slide cover | Fisher | 12-546-14 | |
| 7 mL Transfer pipette | Globe Scientific | 135030 | |
| 10 mL Falcon tubes | BD Biosciences | 352099 | |
| Foil | Fisher | 01-213-105 | |
| 12-well plate | BD Biosciences | 353043 | |
| 200 proof Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Xylene | Acros Organics | 1330-20-7 | Hazardous. |
| Permabond 200 | Permabond LLC | GF2492 | |
| 25 mL serological pipette | Sigma | SIAL1489 | |
| Parafilm | Midsci | HS234526C | |
| Vibratome | World Precision Instruments | NVSLM1 | |
| C57Bl/6 Male Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Axio Imager 2 | ZEISS | Multiple components, see website for details. | |
| AxioCam MRc Camera | ZEISS | 426508-9902-000 | |
| Staining Dish , Green | Tissue-Tek | 62541-12 | |
| Staining Dish Set | Electron Microscopy Sciences | 70312-20 | |
| Motorized Pipet Filler | Fisher | 03-692-168 | |
| Neurolucida | mbf Bioscience | ||
| Neurolucida Explorer | mbf Bioscience | ||
| Prism | GraphPad |
References
- Stuart, G. J., Spruston, N. Dendritic integration: 60 years of progress. Nat Neurosci. 18 (12), 1713-1721 (2015).
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
- Kulkarni, V. A., Firestein, B. L. The dendritic tree and brain disorders. Mol Cell Neurosci. 50 (1), 10-20 (2012).
- Kasai, H. Structural Dynamics of Dendritic Spines in Memory and Cognition. Trends Neurosci. 33 (3), 121-129 (2010).
- von Bohlen Und Halbach, O. Structure and function of dendritic spines within the hippocampus. Ann Anat. 191 (6), 518-531 (2009).
- Wayman, G. A., et al. Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2. Neuron. 50 (6), 897-909 (2006).
- Bourne, J. N., Harris, K. M. Balancing structure and function at hippocampal dendritic spines. Ann Rev Neurosci. 31, 47-67 (2008).
- Lai, K. O., Ip, N. Y. Structural plasticity of dendritic spines: the underlying mechanisms and its dysregulation in brain disorders. Biochim Biophys Acta. 1832 (12), 2257-2263 (2013).
- Harris, K. M. Structure, development, and plasticity of dendritic spines. Current Op Neurobiol. 9 (3), 343-348 (1999).
- Harris, K. M., Kater, S. B. Dendritic spines: cellular specializations imparting both stability and flexibility to synaptic function. Ann Rev Neurosci. 17, 341-371 (1994).
- Leuner, B., Shors, T. J. Stress, anxiety, and dendritic spines: what are the connections. Neuroscience. 251, 108-119 (2013).
- Harris, K. M., Fiala, J. C., Ostroff, L. Structural changes at dendritic spine synapses during long-term potentiation. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 358 (1432), 745-748 (2003).
- Kasai, H., Matsuzaki, M., Noguchi, J., Yasumatsu, N., Nakahara, H. Structure-stability-function relationships of dendritic spines. Trends Neurosci. 26 (7), 360-368 (2003).
- Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. The Golgi-Cox method. Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).
- Koyama, Y. The unending fascination with the Golgi method. OA Anat. 1 (3), 24 (2013).
- Pasternak, J. F., Woolsey, T. A. On the "selectivity" of the Golgi-Cox method. J Comp Neurol. 160 (3), 307-312 (1975).
- Friedland, D. R., Los, J. G., Ryugo, D. K. A modified Golgi staining protocol for use in the human brain stem and cerebellum. J Neurosci Methods. 150 (1), 90-95 (2006).
- Rosoklija, G., et al. Optimization of Golgi methods for impregnation of brain tissue from humans and monkeys. J Neurosci Methods. 131 (1-2), 1-7 (2003).
- de Castro, F., Lopez-Mascaraque, L., De Carlos, J. A.
- Gabbott, P. L., Somogyi, J. The "single" section Golgi-impregnation procedure: methodological description. J Neurosci Methods. 11 (4), 221-230 (1984).
- Zaqout, S., Kaindl, A. M. Golgi-Cox staining step by step. Front Neuroanat. 10 (38), (2016).
- superGolgi Kit. , Available from: http://www.ihcworld.com/products/ssdatasheets/superGolgi%20Kit%20Datasheet%20Protocol.pdf (2017).
- Vibroslice NVSL & Vibroslice NVSLM123. , Available from: https://www.wpiinc.com/clientuploads/pdf/NVSL_NVSLM1_IM.pdf (2000).
- Neurolucida 11.03. , MBF Bioscience. Williston, VT USA. (2017).
- Sholl, D. A. Dendritic organization in the neurons of the visual and motor cortices of the cat. J Anat. 87 (4), 387-406 (1953).
- Pillai, A. G., et al. Dendritic morphology of hippocampal and amygdalar neurons in adolescent mice is resilient to genetic differences in stress reactivity. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
- Morley, B. J., Mervis, R. F. Dendritic spine alterations in the hippocampus and parietal cortex of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor knockout mice. Neuroscience. 233, 54-63 (2013).
- Titus, A. D., et al. Hypobaric hypoxia-induced dendritic atrophy of hippocampal neurons is associated with cognitive impairment in adult rats. Neuroscience. 145 (1), 265-278 (2007).
- Groves, T. R., et al. 5-Fluorouracil chemotherapy upregulates cytokines and alters hippocampal dendritic complexity in aged mice. Behavioral Brain Research. 316, 215-224 (2017).
- Risher, W. C., Ustunkaya, T., Singh Alvarado, J., Eroglu, C. Rapid Golgi analysis method for efficient and unbiased classification of dendritic spines. PloS One. 9 (9), (2014).
- Kaufmann, W. E., Moser, H. W. Dendritic anomalies in disorders associated with mental retardation. Cerebral cortex. 10 (10), 981-991 (2000).
- Kulkarni, V. A., Firestein, B. L. The dendritic tree and brain disorders. Mol Cell Neurosci. 50 (1), 10-20 (2012).
