Summary
Her præsenterer vi en Golgi-Cox-protokol i omfattende detaljer. Denne pålidelige vævsbestemmelsesmetode giver mulighed for en højkvalitetsvurdering af cytoarkitekturen i hippocampus og i hele hjernen, med minimal fejlfinding.
Abstract
Dendritiske spines er fremspringene fra de neuronale dendritiske aksler, der indeholder excitatoriske synapser. De morfologiske og forgreningsvariationer af de neuronale dendritter inden for hippocampus er impliceret i kognition og hukommelsesdannelse. Der er flere tilgange til Golgi-farvning, som alle har været nyttige til bestemmelse af de morfologiske egenskaber ved dendritiske arbors og frembringer en klar baggrund. Den nuværende Golgi-Cox-metode (en lille variation af protokollen, der er forsynet med et kommercielt Golgi-farvningssæt), blev designet til at vurdere, hvordan en relativt lav dosis af det kemoterapeutiske lægemiddel 5-flurouracil (5-Fu) ville påvirke dendritisk morfologi , Antallet af rygsøjler og kompleksiteten af arborisering inden for hippocampus. 5-Fu modulerede signifikant den dendritiske kompleksitet og nedsatte rygtætheden i hele hippocampus på en regionspecifik måde. De viste data viser, at Golgi-farvemetoden efFektively farvede de modne neuroner i CA1, CA3 og dentale gyrus (DG) i hippocampus. Denne protokol rapporterer detaljerne for hvert trin, så andre forskere pålideligt kan plette væv i hele hjernen med resultater af høj kvalitet og minimal fejlfinding.
Introduction
Dendritter er den største del af neuroner, der modtager og behandler presynaptisk input 1 . Deres dendritiske processer har en kompleks geometri, hvor de proximale grene har en større diameter end de distale grene. Som dendrit udvikler, danner de flere forbindelser med andre neuroner i en proces, der kaldes dendritisk arborisering. Omfanget og mønsteret af denne forgrening bestemmer mængden af synaptiske input, som en dendrit kan behandle tilstrækkeligt 2 .
Dendritisk arborisering er en nødvendig proces for aktivitetsafhængig plasticitet og korrekt udvikling af neuronalkredsløb. Forlængelse, tilbagetrækning, forgrening og synaptogenese er indviklede processer, der indbefatter indre genetiske programmer og påvirkninger fra ekstrinsiske faktorer. De morfologiske og forgreningsvariationer af de neuronale dendritter i hippocampus er impliceret i kognition og hukommelsesdannelseF "> 3 , 4. Ændringer i dendritisk kompleksitet er forbundet med patofysiologiske og adfærdsmæssige ændringer 5. Abnormaliteter er relateret til flere sygdomstilstande, herunder Fragile X Syndrome og Down Syndrome 6 .
Dendritiske spines er de specialiserede subcellulære rum af de dendritiske arbors, der modtager excitatorisk indgang i centralnervesystemet. Der er tre morfologiske klasser af dendritiske rygsøjler med navnet på hver klasse baseret på deres størrelse og form: 1) svampespidser, som har komplekse postsynaptiske densiteter med flere glutamatreceptorer end andre rygsøjler 7 ; 2) Stumpede rygsøjler, der mangler en stamme; Og 3) tynde rygsøjler, der består af en langstrakt smal stamme og et kugleformet hoved 8 . Dendritisk rygsøjlevolumen anvendes til dels til at definere dem, med tynde rygsøjler generelt mindre (0,01 μm 3 3 ) 9 , 10 . Spinesne stabiliseres med modning. For eksempel trækkes de tynde rygsøjler enten tilbage efter nogle få dage eller udvikler sig til svampespidser. Alternativt er svampespidserne relativt stabile og kan overleve i en længere periode. Styrken af de neuronale forbindelser antages at være baseret på antallet af rygsøjler og / eller deres volumen 11 , 12 , 13 .
Den klassiske Golgi-farvningsmetode og dens mere moderne variationer har alle været nyttige til undersøgelse af dendritisk ryggradsmorfologi og densitet. Et unikt aspekt ved Golgi-farvningen er, at det tilfældigt pletter omkring 5% af de samlede neuroner, hvilket muliggør sporing af individuelle neuroner 14 , 15 . Selvom den præcise mekanisme, hvori Golgi methOd pletter individuelle neuroner er stadig ukendt, princippet for metoden er baseret på krystallisation af sølvkromat (Ag 2 CrO 4 ) 16 , 17 . Der er tre hovedtyper af Golgi-metoden: den hurtige Golgi, Golgi-Cox og Golgi-Kopsch 18 , 19 . Alle tre metoder starter med en indledende inkubationsfase i chromsalte i flere dage til måneder, men der er visse vigtige forskelle mellem dem. Den hurtige Golgi bruger osmiumtetroxid i første trin, mens Golgi-Kopsch indbefatter paraformaldehyd. Farvningen i både den hurtige Golgi og Golgi-Kopsch efterfølges af en inkubation i en 1-2% sølvnitratopløsning i ca. 7 dage. Golgi-Cox-metoden anvender mercuricchlorid og kaliumdichromat i stedet for sølvnitrat og har en imprægneringstid på 2-4 uger. Vævene er derefter snittet og hurtigt anbragt i en fortyndet ammoniakOpløsning efterfulgt af en fotografisk fixer til fjernelse af salte. Af de tre typer anses Golgi-Cox-metoden at være den bedste til farvning af de dendritiske arbors uden meget baggrundsinterferens, dels fordi krystalgenstande ikke forekommer på vævens overflade (i modsætning til i den hurtige Golgi-metode) 17 , 20 , 21 .
Den foreliggende metode er en lille variation af protokollen forsynet med et kommercielt Golgi-farvningskit og blev designet til at vurdere, hvordan en relativt lav dosis af 5-Fu ville påvirke de dendritiske morfologiske egenskaber og rygsøjletætheden. Enhver indhentet data kunne give yderligere indsigt i, hvordan kemoterapeutisk behandling påvirker neuronalkredsløbet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eksperimenter blev udført i overensstemmelse med de etiske standarder godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved UAMS.
1. Dyr og 5-Fu Injection Paradigm
- Køb 6-måneders gamle C57Bl6 / J-muse-mus og hus dem under en konstant 12 h lys / mørk cyklus, indtil de er 1 år gamle.
- Fortynd 5-Fu i 0,9% steril saltvand. Brug 60 mg / kg som den krævede dosis pr. Mus.
- Giv de intraperitoneale injektioner af 5-Fu (en gang om ugen i tre uger).
- Giv de intraperitoneale injektioner omkring samme tid hver dag. For eksempel mellem 0900-1200 h.
- Euthanize dyrene og trække hjernen 30 dage efter den endelige injektion.
2. Eutanasi Proceduren og Brain Extraction
- Hold gnaveret tilbage og tag halen i bunden. Med den anden side skal du placere tommelfingeren eller fingerfingeren på denE basen af gnaverens hals. Hurtigt lægge pres på gnaverens hals og skubbe fremad, mens den anden hånd holder halen trukket baglæns.
- Hold gnaveret med den ene hånd og de store kirurgiske saks med den anden. Placer gnaverens hals mellem de to blade og hurtigt halshugge hovedet.
- Tag det afskårne museshoved, og brug den fine saks til at trimme pelsen over kraniet, op til øjnene. Sæt derefter saksens spidser i hver øjet og luk saksene med en lille kraft.
- Brug fjedersaks til at skære kraniet til venstre og højre for cerebellum.
- Brug pincet til at løfte den del af kraniet, der omgiver cerebellum direkte op og ned.
- Brug kilens saks til at skære langs den midsagittale linje af kraniet.
- Brug tangen til at løfte den resterende del af kraniet ud af hjernen.
- Brug en spatel og en sonde til at skubbe hjernen ud i den ønskede beholder. Brug af en rustfri sTeelblad, skære hver hjerne langs midsagittalplanet. Udfør følgende Golgi-Cox metode på højre halvkugle.
3. Golgi-farvning og vævsforberedelse
- Dyp de friskhøstede halvhjerner ind i 5 ml kviksølvbaseret opløsning (opløsning A fra sættet) i et 10 ml konisk rør. Mercuricchloridopløsningen er lysfølsom; Dække røret med folie. Opbevar prøven i mørke ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Løsning A findes i det kit, der er angivet i materialetabellen. Advarsel!!!! Opløsning A (også kaldet mercuricchloridopløsning) indeholder giftige reagenser, såsom kaliumdichromat, mercuricchlorid og kaliumchromat. Brug beskyttelseshandsker og arbejde i en dampplade. - Efter 1 dag dekanteres opløsningen langsomt i en midlertidig beholder (som en stor vejebåd) og bortskaffes i en binær affaldsbeholder. Sænk hjernen (stadig i de oprindelige 10 ml koniske rør) med 5 mlMercuricchloridopløsningen og returnere prøven til mørket ved stuetemperatur i yderligere 13 dage.
- Tilsæt 30 g efter imprægneringspuffer til 90 ml destilleret eller deioniseret vand (dH 2 O). Fyld hver brønd af en 6-brønds plade med 6,5 ml af postimpregneringsbufferen, en brønd pr. Hjerne
BEMÆRK: Efterimprægneringspufferen leveres i det kit, der er angivet i materialetabellen.- Efter 14 dage (i alt) i kviksølvchloridopløsningen skylles vævet med dH20 og derefter overføres dem til 6-brønds plader med postimpregneringsbuffer. Dæk pladerne med folie og opbevar dem ved stuetemperatur i mørket.
- Pipetter ud efter imprægneringspufferen efter 1 dages nedsænkning og forny med frisk efterimprægneringspuffer; Opbevares i 1 dag i mørke ved stuetemperatur. Gem det her ved 4 ° C i op til 1 måned 22 .
4. Sektionering
- Mærk 12-brøndspladerne på deres låg med tal i stigende rækkefølge fra venstre til højre og op-ned.
- Klargør to eller tre 12-brøndsplader pr. Hjerne, hvis der tværs hele hjernen.
- Mærk toppen af hvert 12-brønds lågplade med identifikationsnummeret på hjernen.
- Pipetter 2 ml 1x PBS i hver brønd på hver plade.
- Opsæt scenen og tænd vibratomet; Sørg for at der er nok 1x PBS i beholderen til at dække vævet.
- Skær to stykker plastparafinfilm og fold dem over to gange. Placer dem over hullerne til prøveholderens knapper for at forhindre 1x PBS i at lække på tælleren.
- Sæt båndet ned på vævsblokken i prøveholderen, og læg derefter cyanacrylatklæbemiddellim (se tabel over materialer) på den.
- Fjern hjernen fra 6-brøndspladen og læg den på en plast- eller glasskål. Brug rustfritStål dobbeltkantet blad til at skære omkring halvdelen af cerebellum.
- Kut cerebellumet caudalt. Sørg for, at den resterende del af cerebellum er lige.
- Anbring straks den flade overflade af det resterende cerebellum på limen.
BEMÆRK: Den dorsale del af vævet (hjernebarken) skal vender mod venstre eller højre i forhold til bladet. Den rostral ende, der tidligere indeholdt den lygtepære, der var vedhæftet, skulle vende opad.- Vent mindst et par minutter for at sikre, at limen tørrer helt.
- Mens limen, der holder hjernen på plads, tørrer, hæld 1x PBS i prøvebadet. Når limen er tør, placer prøveholderen med vævet i prøvebadet.
- Hvis vævsprøven ikke er helt dækket, hæld mere 1x PBS i prøvebadet.
- Fastgør bladet til vibratomens bladholder og langsomt lSkub bladet ind i prøvebadet, indtil det er helt nedsænket i 1x PBS. Fortsæt sænkning af bladet, indtil det ligger lidt under toppen af vævet.
- Indstil vibratomhastigheden til 7, amplituden til 6 og skæringsvinklen til 12 ° (se tabel over materialer til vibratomodellen). Start vibrationen og skær 200 μm sektioner 23 .
- Brug en stor pensel til at flytte vævssektionerne fra prøvebadet til hver udpeget brønd i 12-brøndspladerne.
- Fortsæt med at skære vævet, indtil det ønskede antal vævssektioner er nået.
5. Efterfarvning
- For hver af de følgende farvningstrin og skylninger skal du bruge 2 ml af den angivne opløsning pr. Brønd. Brug et motoriseret pipetterfyldstof (se materialebord) for at overføre opløsningerne til brøndene. Brug en overførselspipette (se tabel over materialer) til at overføre løsninger ud af brøndene og ind i det rigtige affaldbeholdere.
- Skyl sektionerne i en 30 minutters vask af 0,01 M PBS-T (tilsæt 3,0 ml vaskemiddel (se tabel over materialer) til 1.000 ml 0,01 M PBS).
- Fortynd ammoniumhydroxidopløsning (Forsigtig) 3: 5 i volumen med dH 2 O umiddelbart inden brug. Sæt sektionerne i den fortyndede ammoniumhydroxidopløsning i 19-21 min.
- Beskyt den lysfølsomme ammoniumhydroxidopløsning med folie.
BEMÆRK: Ammoniumhydroxid i opløsning har en koncentration på ~ 10% og er klassificeret som "farlig". Ammoniumhydroxidopløsning kan forårsage forbrændinger, hvis det kommer i kontakt med huden. Det kan forårsage irritation af luftvejene ved indånding. Brug beskyttelseshandsker og arbejde i en dampplade.
- Beskyt den lysfølsomme ammoniumhydroxidopløsning med folie.
- Sæt sektionerne i efterfarvningsbufferen (tilsæt 90 g reagens D i 500 ml dH20) i 19-21 min. Post-farvningsbufferen er lysfølsom; Beskyt det med folie 22 .
- Skyl sektionerne i tre, 5-10 minutter vasker af 0,01 M PBS-T.
6. Montering, rengøring og dækning
- Monter sektionerne på 1% gelatinebelagte dias med den store pensel. Lad dem tørre i 20-30 minutter ved stuetemperatur, og læg dem derefter i en Coplin-krukke natten over.
- Fjern gliderne med handskede hænder fra Coplin-krukken og læg dem i en plasthylde (se materialebordet). Placer plastikstativet i farveskålen (se tabel over materialer), der indeholder 100% ethanol. Dehydrere dem med tre 5 min vasker.
- Vask diasene to gange i 5 minutter hver i 99% xylen. Placer diasene i et glasstativ og sænk stativet i en glasfarveplade med xylen med et metalhåndtag (se materialebordet).
BEMÆRK: Forsigtig Xylen er skadeligt ved indånding og forårsager irritation, hvis det berører huden. Det er meget brandfarligt i flydende og damptilstande. Brug beskyttelseshandsker og arbejde i en dampplade. - Fjern gliderne fra xylenEne ad gangen og hurtigt dække vævet med ~ 0,25 ml monteringsmedier (se Materiel). Tag derefter dækslet og læg dem over medierne.
- Skub eventuelle fangede luftbobler under glidebåndene til kanten med en stump genstand, såsom en pensels ende.
- Placer diasene i et område væk fra sollys og lad dem tørre i 2-3 dage.
- Fortsæt med at erhverve billeder ved hjælp af et mikroskop og analysere med den relevante software.
7. Acquire Image Stack
- Åbn billeddannelsesprogrammet (se Materialebord ). Placer diaset på mikroskopets stadium. Klik på "Acquisition" i menuen øverst i programmet, og klik derefter på "Live Image."
- Sæt mikroskopet til 10X. Identificer præferensens neuron, og tag så markøren, som fremstår som en rød X, på midten af soma. Venstre klik for at indstille referencepunktet.
- Indstil mikroskopet til 40X. Klik på "Flyt" i menuen øverst i programmet, og klik derefter på "Til referencepunkt".
- Begynd at oprette billedstakken ved at rulle manuelt med det fine mål over vævet, indtil det er lidt ude af fokus.
- Klik på "Set Top" i nederste højre hjørne af programmet under overskriften "Image Acquisition."
- Rul lidt under vævet, indtil det er lidt ude af fokus, og klik derefter på "Set Bottom" under "Image Acquisition." Klik derefter på "Acquire Image Stack."
- Når billedstakken er erhvervet, skal du indtaste det ønskede navn for billedfilen i det vindue, der vises. Gem som "MBF Ascii-fil."
- Når du bliver bedt om det, skal du vælge filtypen som "MBF JPEG2000 stack-fil" og derefter klikke på "Gem".
8. Neuronal Sporing
- I værktøjslinjenKlik under ruden under "Kontour Name" under menuen. Vælg "Soma" fra rullemenuen.
- Manuelt spore soma. Højreklik derefter på og vælg "Afslut Cell Body", når sporing er afsluttet.
- Vælg "AutoNeuron" for at hente en anden fane med titlen "AutoNeuron Workflow."
- Under "Konfigurationstype" skal du vælge "Ny". Indstil parametrene, og klik derefter på "Næste trin" for at hente under "Soma Detection" underposition.
- For at indstille parametrene, vælg "Brightfield". Klik derefter på "Startmåling" under "Max procesdiameter". Brug markøren til at gå til bunden af dendritet og indstil diameteren manuelt.
- Klik på "Ja" i vinduet, der beder brugeren om at spore hele billedet. Manuelt spore soma. Unclick og klik derefter på "Next step" for at hente "Seed Placement" underposition.
- Klik på "Bekræft frøS ", og klik derefter på" Næste trin "for at hente underordnet" Neuron Reconstruction ".
- Under "Neuron" skal du klikke på "Interaktiv". Udfør interaktive sporing ved at følge retningen fra dendriternes program og højreklikke for at fuldføre det fremhævede område sporet af programmet. Efter at have sporet alle dendritterne, skal du klikke på "Næste trin".
- Når et nyt vindue vises, skal du gemme den nye konfiguration med en ønsket titel. Klik på "Gem".
9. Analyse
- Åbn analyseprogrammet (se materialebordet).
- Klik på "File" fra topmenuen og klik derefter på "Åbn datafil". Vælg filen af interesse.
- Under analysens underposition skal du vælge "Sholl Analysis."
- I vinduet "Sholl Analysis" indstilles startradius til 10 μm. Under "Analyse" skal du klikke på boksene "Dendrites" og "Branch Orders".
- Højre klIck de nyåbnede vinduer og klik på "Excel Export." Klik på "Gem".
- Under analysen skal du klikke på "Branched Structure Analyses." Vælg "Alle mulige analyser".
- Højreklik på det nyåbnede vindue og klik på "Excel Export" 24 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Virkningerne af 5-Fu behandling på den dendritiske arborisering og kompleksitet i hippocampus af Golgi-farvede hjerneafsnit blev kvantificeret og sporet ved anvendelse af en kommercielt tilgængelig billeddannelsessoftware. Efter sporing blev den dendritiske arborisering, rygsøjletætheden og rygmarvologien analyseret ved anvendelse af Sholl-analyse og det dendritiske kompleksitetsindeks (DCI). Sholl analyse er en kvantitativ analytisk metode, som kan bruges til at bestemme dendritisk arbor morfologi 25 . Fra og med summen overlapper cirkler 10 μm fra hinanden de dendritiske sporinger. Dendritternes længde bestemmes af antallet af cirkler, som dendritterne krydser. Branchepunktsanalysen, en metode til at fastslå kompleksiteten af en dendritisk arbor, er baseret på det samlede antal og rækkefølge af grenpunkter.
Et grenpunkt defineres som når aGren opdeles i to underafdelinger. Branchordren er et mål for kompleksiteten baseret på hvor mange gange grenene deler sig. For eksempel vil et førsteordens grenpunkt være den oprindelige dendrit, der strækker sig fra soma, mens et andet ordens grenpunkt vil være det punkt, hvor filialen opdeles i to underafdelinger. Ved at undersøge både grenspunkterne og grenbestillingen er kompleksiteten af den dendritiske arbor (baseret på antallet af grenpunkter) og på hvilke punkter forgreningen forekommer (en mindre grenrække er tættere på summen, mens en større grenorden er Længere fra soma) kan bestemmes. Disse parametre blev anvendt til DCI. CA1 og CA3 blev opdelt i apikale og basale portioner og analyseret uafhængigt 26 , 27 .
Dendritterne af CA1- og CA3-pyramidale neuroner og granule-neuroner i generaldirektoratet blev analyseret. Alle neuroner udvalgt foR hver eksperimentelle gruppe opfyldte følgende kriterier: 1) dendritterne havde mørke og konsistente Golgi farvninger på tværs af hele deres længde, 2) dendritterne var synligt inaktive og 3) hver neuron havde tilstrækkelig plads mellem dem for at forhindre interferens under analysen 28 . Figur 1 viser en neuron, der opfylder ovennævnte kriterier. Data blev udtrykt som middel ± SEM. For at bestemme de statistiske forskelle mellem sham og 5-Fu-grupperne blev der anvendt en parret to-tailed t- test. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af analytisk software (se tabel over materialer), og p <0,5 blev betragtet som signifikant. En blandingsfaktoranalyse af varians (ANOVA) blev brugt til at evaluere virkningerne af 5-Fu-behandlingen og Sholl-radiusen. Fisher LSD post-hoc test blev anvendt efter ANOVA, når det er passende 29 .
I begge CA 1 ( t = 7,68, p <0,01, figur 2A) og CA3 ( t = 7,54, p <0,01; figur 3A) apikale pyramidale dendritter var der en signifikant samlet reduktion i rygsøjler efter 5-Fu behandling. Mens 5-Fu-behandlingen ikke signifikant påvirker den basale rygtæthed af CA1 ( t = 1,79, p = 0,15, Figur 2B ), mindskede den signifikant CA3-basale pyramidale dendritiske rygsøjler ( t = 5,57, p <0,05; Figur 3 B ). Endvidere viste Fisher LSD post-hoc-testene et fald i den dendritiske arborisering af CA1-apikale pyramidale dendritter ved 40-100 μm (Fisher's LSD, p <0,001, Figur 2C ) og 130-160 μm (Fisher's LSD, p < 0,05;Ig "> Figur 2 C ) væk fra summen sammenlignet med de saltbehandlede kontroller. Et lignende fænomen blev set i CA1 basale apikale dendritter ved 30-60 μm (Fisher's LSD, p <0,001, Figur 2D ) og 70-110 Μm (Fisher's LSD, p <0,05; Figur 2 D ) væk fra soma 29 .
Med hensyn til CA3-apikale pyramidale dendritter var der ikke en signifikant forskel i den segmentale dendritiske længde efter 5-Fu-behandlingen sammenlignet med de saltbehandlede kontroller ( F (28,87) = 0,91; p = 0,59; Figur 3C ). For de CA3 basale pyramidale dendritter var der imidlertid en signifikant forskel mellem 5-Fu behandling og de saltbehandlede kontroller i den segmentale dendritiske længde ( F (25, 78) =1,85; P <0,05; Figur 3 D ). Fisher's LSD afslørede, at 5-Fu behandling reducerede den dendritiske arborisering ved 90-100 μm ( p <0,01, Figur 3D ), 70-80 μm og 110-120 μm (Fisher's LSD, p <0,05; Figur 3D ) Væk fra soma 29 .
For at bestemme den dendritiske kompleksitet blev en grenordreanalyse brugt til at sammenligne de 5-Fu-behandlede og saltvandbehandlede kontrolgrupper. Inden for generaldirektoratet viste grenordreanalysen en signifikant forskel mellem hver behandlings- og grenordre ( F (8, 36) = 25,61, p <0,001; Figur 4 ). Dette blev yderligere analyseret ved anvendelse af Fisher's LSD, hvilket viste, at der var en reduceret længde ved 4. og 6. årRækkefølge efter 5-Fu behandling ( p <0,001; figur 4 ) 29 .
Figur 1 : Golgi-farvet neuron, der repræsenterer kriterierne for billeddannelse og yderligere analyse. Alle tre rygsøjler kan let ses efter Golgi-farvningen. Farvning er ensartet over hele længden af dendriten, og dendriten er isoleret fra andre neuroner. Skalestang, 5 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2 : Golgi farvet n Euroner viste signifikante forskelle i rygsøjletæthed mellem de 5-Fu behandlede og de saltvandsbehandlede grupper i den apikale CA1, men ikke den basale CA1. Der var en signifikant forskel i ryggradslængden mellem 5-Fu behandlede og saltvandsbehandlede grupper i både apikal og basal CA1. ( A ) I CA1-apikale pyramidale dendritter reducerede 5-Fu signifikant rygtæthed. ( B ) I de basale dendritter var der ingen signifikante ændringer i den samlede tæthed af rygsøjler. ( C ) Sholl analyse viste, at 5-Fu behandling signifikant nedsatte dendritisk arborisering ved 40-100 μm og 130-160 μm væk fra soma i CA1-apikale pyramidale dendritter. ( D ) I basal dendrit reducerede 5-Fu behandling den dendritiske arborisering ved 30-60 μm og 70-110 μm væk fra soma. Gennemsnit ± SEM (n = 6). * P <0,05; ** p <0,01, ANOVA 29 .= "Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55696/55696fig2large.jpg" target = "_ blank"> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3 : Golgi-farvede neuroner viste signifikante forskelle i rygsøjletæthed mellem 5-Fu-behandlede og saltbehandlede grupper i både apikal og basal CA3. Der var en signifikant forskel i ryglængde mellem 5-Fu-behandlede og saltvandsbehandlede grupper i apical CA3, men ikke basal CA3. ( A ) I CA3-apikale pyramidale dendritter reducerede 5-Fu signifikant rygtæthed. ( B ) I basal dendrit reducerede 5-Fu signifikant den samlede tæthed af rygsøjler. ( C ) Der var ingen signifikant virkning af 5-Fu behandling i CA 3 apikale område. ( D ) I de basale dendritter, 5-Fu treaTment nedsat dendritisk arborization 70-120 μm væk fra soma. Gennemsnit ± SEM (n = 6). *, P <0,05; **, p <0,01, ANOVA 29 . Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4 : Golgi-farvede neuroner i generaldirektoratet viste nedsat længde ved den 4. og 6. rækkefølge efter 5-Fu-behandling sammenlignet med den saltbehandlede gruppe. Længde pr. Grenordre i pyramidale neuroner i CA1 hippocampale regionen. Gennemsnit ± SEM (n = 6). * P <0,05; ** p <0,01, ANOVA 29 . anbringendeSe klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sammenlignet med mere moderne teknikker har Golgi-Cox-metoden flere fordele, der gør den til den foretrukne metode til undersøgelse af rygmorfologi: 1) Farvningen kan anvendes til i det væsentlige ethvert væv, 2) Et grundlæggende lysmikroskopopsætning er alt, hvad der er nødvendigt for at Erhverve Golgi-baserede billeder, 3) Golgi-Cox-billeddannelsen er hurtigere end konfokal billeddannelse, og 4) Golgi-farvede sektioner er levedygtige i flere måneder til år længere end prøver, der er fluorescensmærkede. Selv med disse fordele har Golgi-Cox-metoden stadig visse begrænsninger. For det første er hele processen meget tidskrævende, hvilket kræver flere ugers farvning efterfulgt af analyse af billederne. Som det ses med denne protokol, tager det 14 dage i opløsning A og 1 dag i opløsning B, før sektionen kan begynde. Derudover vil udførelse af snitning, efter-farvning og montering tage 2-3 timer per hjerne. Hvert lysbillede skal tørre i 1 dag før rengøring og dækker dem. Hvorefter mængden af tidDet vil tage til billede og analysere sektionerne vil afhænge af den enkelte. For det andet kan der være problemer med sammenhæng mellem data fra analytikere på grund af forskelle i kategorisering af spines 30 . Af denne grund anbefales det, at en person udfører billeddannelses- og analysedelen af hvert eksperiment, hvilket yderligere forlænger mængden af tid til gennemførelse af projektet.
Der er flere kritiske trin i Golgi-Cox-metoden, der kræver præcis timing og opmærksomhed. Ved farvning af sektionerne med ammoniumhydroxidopløsningen er det afgørende, at sektionerne forbliver i opløsningen i mindst 19 minutter, men ikke over 21 minutter. Hvis sektionerne ikke er i ammoniumhydroxidopløsningen i tilstrækkelig tid, bliver de ikke ordentligt farvede, hvilket betyder, at neuronerne vil se mindre defineret ved billedbehandling, hvilket gør det sværere at analysere dem. Hvis sektionerne er i ammoniumhydroxidopløsningen i over 21 minutter, kan de blive ovEr-farvet, hvilket gør det vanskeligt at identificere de enkelte neuroner. Derfor skal forskeren, når man udskifter løsninger, flytte hurtigt. Et andet vigtigt skridt er overførslen af sektionerne på dias. Før du flytter sektionerne med den store pensel, er det bedst at først tilføje en lille mængde af PBS-T på diaset. Dette gør det muligt for sektionerne let at blive anbragt på glideren og manøvreret uden at kunne brydes fra hinanden. Et mere kritisk trin er tørringstrinnet efter at sektionerne er placeret på et dias. Hvis gliderne ikke tørrer i mindst 20 minutter ved stuetemperatur, vil de fleste dele sandsynligvis falde i løbet af dehydreringstrinene. Hvis gliderne tørre i længere tid end 30 minutter, vil de højst sandsynligt blive sprøde og opdele hinanden under dehydreringstrinnene.
Når du udfører denne procedure, er der visse trin, der kan være besværlige. For eksempel, hvis hele cerebellum er afskåret, før du placerer hjernen på specImen-holder og snitning, kan hjernen knække fra hinanden, inden generaldirektoratet er fuldt sektioneret, hvilket gør det ikke muligt at anvende yderligere sektioner. Derfor er det vigtigt kun at skære caudalt gennem ca. halvdelen af cerebellum. Et andet trin, som kan påvirke sektionerne negativt, er vibratomhastigheden og amplitude. Mens de anbefalede indstillinger er henholdsvis 7 og 6, kan det efter afskæring være muligt at nedbryde visse sektioner i PBS eller virke ujævn. For at rette op på dette skal du finjustere enten vibratomhastigheden eller amplituden, en ad gangen, indtil sektionerne er in-takt og jævnt mellem indstillingerne 6-8.
Selvom kommercielle kits til Golgi-farvning er tilgængelige, mangler de ofte nøjagtige detaljer for hvert enkelt trin. Med denne protokol rapporterer vi i detaljer alle de trin, der blev brugt til at tillade andre laboratorier at pålideligt plette væv af høj kvalitet med minimal fejlfinding. De anvendte materialer er tilgængelige for de fleste neurovidenskabslaboratorier. Aberrations i dendrit morpHologi og ændringer i antallet af dendritiske rygsøjler er relateret til en lang række neurologiske lidelser 31 . Desuden kan disse forstyrrelser af den dendritiske arborisering udgøre et væsentligt morfologisk kendetegn for den kemoterapiinducerede skade i hjernen 32 . I fremtiden vil vi undersøge, hvordan de strukturelle ændringer induceret af 5-Fu kan relateres til adfærds-, cellulære og molekylære ændringer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af et pilotstipendium under NIH P20 GM109005 (ARA) og af Center for Oversættelses Neurovidenskab IDeA-programprisen P30 GM110702.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| superGolgi Kit | Bioenno Lifesciences | 30100 | Contains hazardous materials. |
| PBS 10x powder concentrate | Fisher | BP665-1 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| Permount | Fisher | SP 15-100 | |
| Slide cover | Fisher | 12-546-14 | |
| 7 mL Transfer pipette | Globe Scientific | 135030 | |
| 10 mL Falcon tubes | BD Biosciences | 352099 | |
| Foil | Fisher | 01-213-105 | |
| 12-well plate | BD Biosciences | 353043 | |
| 200 proof Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Xylene | Acros Organics | 1330-20-7 | Hazardous. |
| Permabond 200 | Permabond LLC | GF2492 | |
| 25 mL serological pipette | Sigma | SIAL1489 | |
| Parafilm | Midsci | HS234526C | |
| Vibratome | World Precision Instruments | NVSLM1 | |
| C57Bl/6 Male Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Axio Imager 2 | ZEISS | Multiple components, see website for details. | |
| AxioCam MRc Camera | ZEISS | 426508-9902-000 | |
| Staining Dish , Green | Tissue-Tek | 62541-12 | |
| Staining Dish Set | Electron Microscopy Sciences | 70312-20 | |
| Motorized Pipet Filler | Fisher | 03-692-168 | |
| Neurolucida | mbf Bioscience | ||
| Neurolucida Explorer | mbf Bioscience | ||
| Prism | GraphPad |
References
- Stuart, G. J., Spruston, N. Dendritic integration: 60 years of progress. Nat Neurosci. 18 (12), 1713-1721 (2015).
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
- Kulkarni, V. A., Firestein, B. L. The dendritic tree and brain disorders. Mol Cell Neurosci. 50 (1), 10-20 (2012).
- Kasai, H. Structural Dynamics of Dendritic Spines in Memory and Cognition. Trends Neurosci. 33 (3), 121-129 (2010).
- von Bohlen Und Halbach, O. Structure and function of dendritic spines within the hippocampus. Ann Anat. 191 (6), 518-531 (2009).
- Wayman, G. A., et al. Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2. Neuron. 50 (6), 897-909 (2006).
- Bourne, J. N., Harris, K. M. Balancing structure and function at hippocampal dendritic spines. Ann Rev Neurosci. 31, 47-67 (2008).
- Lai, K. O., Ip, N. Y. Structural plasticity of dendritic spines: the underlying mechanisms and its dysregulation in brain disorders. Biochim Biophys Acta. 1832 (12), 2257-2263 (2013).
- Harris, K. M. Structure, development, and plasticity of dendritic spines. Current Op Neurobiol. 9 (3), 343-348 (1999).
- Harris, K. M., Kater, S. B. Dendritic spines: cellular specializations imparting both stability and flexibility to synaptic function. Ann Rev Neurosci. 17, 341-371 (1994).
- Leuner, B., Shors, T. J. Stress, anxiety, and dendritic spines: what are the connections. Neuroscience. 251, 108-119 (2013).
- Harris, K. M., Fiala, J. C., Ostroff, L. Structural changes at dendritic spine synapses during long-term potentiation. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 358 (1432), 745-748 (2003).
- Kasai, H., Matsuzaki, M., Noguchi, J., Yasumatsu, N., Nakahara, H. Structure-stability-function relationships of dendritic spines. Trends Neurosci. 26 (7), 360-368 (2003).
- Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. The Golgi-Cox method. Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).
- Koyama, Y. The unending fascination with the Golgi method. OA Anat. 1 (3), 24 (2013).
- Pasternak, J. F., Woolsey, T. A. On the "selectivity" of the Golgi-Cox method. J Comp Neurol. 160 (3), 307-312 (1975).
- Friedland, D. R., Los, J. G., Ryugo, D. K. A modified Golgi staining protocol for use in the human brain stem and cerebellum. J Neurosci Methods. 150 (1), 90-95 (2006).
- Rosoklija, G., et al. Optimization of Golgi methods for impregnation of brain tissue from humans and monkeys. J Neurosci Methods. 131 (1-2), 1-7 (2003).
- de Castro, F., Lopez-Mascaraque, L., De Carlos, J. A.
- Gabbott, P. L., Somogyi, J. The "single" section Golgi-impregnation procedure: methodological description. J Neurosci Methods. 11 (4), 221-230 (1984).
- Zaqout, S., Kaindl, A. M. Golgi-Cox staining step by step. Front Neuroanat. 10 (38), (2016).
- superGolgi Kit. , Available from: http://www.ihcworld.com/products/ssdatasheets/superGolgi%20Kit%20Datasheet%20Protocol.pdf (2017).
- Vibroslice NVSL & Vibroslice NVSLM123. , Available from: https://www.wpiinc.com/clientuploads/pdf/NVSL_NVSLM1_IM.pdf (2000).
- Neurolucida 11.03. , MBF Bioscience. Williston, VT USA. (2017).
- Sholl, D. A. Dendritic organization in the neurons of the visual and motor cortices of the cat. J Anat. 87 (4), 387-406 (1953).
- Pillai, A. G., et al. Dendritic morphology of hippocampal and amygdalar neurons in adolescent mice is resilient to genetic differences in stress reactivity. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
- Morley, B. J., Mervis, R. F. Dendritic spine alterations in the hippocampus and parietal cortex of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor knockout mice. Neuroscience. 233, 54-63 (2013).
- Titus, A. D., et al. Hypobaric hypoxia-induced dendritic atrophy of hippocampal neurons is associated with cognitive impairment in adult rats. Neuroscience. 145 (1), 265-278 (2007).
- Groves, T. R., et al. 5-Fluorouracil chemotherapy upregulates cytokines and alters hippocampal dendritic complexity in aged mice. Behavioral Brain Research. 316, 215-224 (2017).
- Risher, W. C., Ustunkaya, T., Singh Alvarado, J., Eroglu, C. Rapid Golgi analysis method for efficient and unbiased classification of dendritic spines. PloS One. 9 (9), (2014).
- Kaufmann, W. E., Moser, H. W. Dendritic anomalies in disorders associated with mental retardation. Cerebral cortex. 10 (10), 981-991 (2000).
- Kulkarni, V. A., Firestein, B. L. The dendritic tree and brain disorders. Mol Cell Neurosci. 50 (1), 10-20 (2012).
