Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

خلية كاملة التصحيح المشبك تسجيلات من الخلايا الظهارية الأولية المعزولة من البربخ

doi: 10.3791/55700 Published: August 3, 2017

Summary

نقدم بروتوكول يجمع بين العزلة الخلية وكل خلية التصحيح المشبك تسجيل لقياس الخصائص الكهربائية للخلايا الظهارية فصلها الابتدائي من البربخ الذيل الفئران. هذا البروتوكول يسمح للتحقيق في الخصائص الوظيفية للخلايا الظهارية البربخ الابتدائي لمواصلة توضيح الدور الفسيولوجي للبربخ.

Abstract

البربخ هو جهاز أساسي لنضج الحيوانات المنوية والصحة الإنجابية. يتكون ظهارة البربخ من أنواع الخلايا المرتبطة بشكل متشابك التي تتميز ليس فقط في الخصائص الجزيئية والمورفولوجية ولكن أيضا في الخصائص الفسيولوجية. هذه الاختلافات تعكس وظائفها المتنوعة، والتي معا إنشاء المكروية اللازمة لتطوير الحيوانات المنوية ما بعد الخصية في التجويف البربخ. فهم الخصائص الفيزيائية الحيوية للخلايا الظهارية البربخية أمر بالغ الأهمية للكشف عن وظائفها في الحيوانات المنوية والصحة الإنجابية، في ظل كل من الفسيولوجية والظروف المرضية المرضية. في حين أن خصائصها الوظيفية لم يتم توضيحها بشكل كامل، يمكن دراسة الخلايا الظهارية البربخية باستخدام تقنية التصحيح المشبك، وهي أداة لقياس الأحداث الخلوية وخصائص الغشاء للخلايا المفردة. هنا، نحن تصف أساليب عزل الخلية و خلية كاملة التصحيح المشبك تسجيل إلى مييتأكد من الخصائص الكهربائية للخلايا الظهارية فصلها الابتدائي من البربخ ذيل الفئران.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

البربخ في الجهاز التناسلي للذكور هو جهاز اصطف مع طبقة من الخلايا الظهارية الفسيفساء. كما هو الحال في الأنسجة الظهارية الأخرى، وأنواع الخلايا المختلفة من ظهارة البربخ، بما في ذلك الخلايا الرئيسية والخلايا واضحة والخلايا القاعدية والخلايا من النظم المناعية واللمفاوية، والعمل بطريقة منسقة لتكون بمثابة الحاجز في خط أنابيب نبيب، وكما الخلايا الداعمة للنضج الحيوانات المنوية وعلم وظائف الأعضاء 1 ، 2 ، 3 . وهكذا، فإن هذه الخلايا الظهارية تلعب دورا أساسيا في الصحة الإنجابية.

وتعتبر الخلايا الظهارية عموما خلايا غير قابلة للإنجاب التي هي غير قادرة على توليد كل أو لا شيء إمكانات العمل في استجابة لاستقطاب المحفزات، وذلك بسبب عدم وجود الجهد بوابات نا + أو كا 2 + قنوات 4 ، 5 . ومع ذلك، الخلايا الظهارية تعبر يونيكيو مجموعات من القنوات الأيونية والنقل التي تنظم أدوارهم الفسيولوجية المتخصصة، مثل إفراز والنقل المغذيات 6 . وبالتالي فإن الخلايا الظهارية المختلفة تمتلك خصائص كهربائية مميزة. على سبيل المثال، الخلايا الرئيسية تعبر عن كفتر لنقل السوائل والكلوريد والتعبير عن TRPV6 لاستيعاب الكالسيوم، في حين أن الخلايا واضحة تعبر عن مضخة بروتون V-أتباس للحموضة اللمعية 1 ، 7 ، 8 ، 9 . وقد تم الإبلاغ عن بعض شركات النقل وقنوات أيون التي تنظم السمات الفسيولوجية للخلايا الظهارية البربخ، ولكن الخصائص الوظيفية للخلايا الظهارية البربخية لم تفهم إلى حد كبير بعد 10 ، 11 ، 12 ، 13 .

ملحقأولي خلية التصحيح المشبك تسجيل هو تقنية راسخة لفحص الخصائص الجوهرية لكل من الخلايا المنفعلة وغير قابلة للانفجار، ومفيدة بشكل خاص لدراسة وظائف الخلايا في المقام الأول فصل في عينات الخلايا غير المتجانسة. يتم استخدام الجهد المشبك لقياس خصائص الغشاء السلبي والتيارات الأيونية من خلايا واحدة 14 ، 15 . وتشمل خصائص الغشاء السلبي مقاومة المدخلات والسعة. المعلمة السابقة تشير إلى سلوك الغشاء الداخلي، في حين أن الأخير يشير إلى مساحة سطح غشاء الخلية (طبقة ثنائية فوسفورية، حيث توجد القنوات الأيونية والنقل، التي تعمل كعازل رقيق يفصل بين الخلايا خارج الخلية وداخل الخلايا). السعة الغشائية تتناسب طرديا مع مساحة سطح الغشاء الخلوي. جنبا إلى جنب مع المقاومة الغشاء الذي ينعكس من قبل المقاومة المدخلات، ثابت الوقت الغشاء، ثويشير كيف مدى سرعة الغشاء الخلية تستجيب لتدفق التيارات قناة الأيونات، ويمكن تحديد. في هذا الصدد، من خلال الجمع بين خصائص الاستجابة الحالية من سلسلة من الخطوات الجهد تطبيقها على الخلايا، يتم تحديد حركية الفيزيائية الحيوية وخصائص الخلايا 15 ، 16 ، 17 ، 18 .

في هذه الورقة، ونحن تصف إجراءات لعزل الخلايا الظهارية من البربخ ذيل الفئران والخطوات لقياس خصائص الغشاء من أنواع الخلايا المختلفة في خليط الخلية فصل باستخدام خلية كاملة التصحيح المشبك. وتبين لنا أن الخلايا الرئيسية البربخ تظهر خصائص الكهربية الغشاء مميزة وأن المواسير يمكن التعرف عليها بسهولة من أنواع الخلايا الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

يتم إجراء جميع التجارب على الحيوانات بها وفقا للمبادئ التوجيهية من جامعة شانغهايتيش المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام اللجنة، التي تلبي المتطلبات المحلية والدولية.

1. الحيوانات التجريبية

  1. استخدام البالغين الذكور سبراغ داولي الفئران (~ 300-450 ز) بين 8-12 أسابيع من العمر. في هذا العصر في الفئران، وصلت الحيوانات المنوية في البربخ الذيل.

2. عزل الخلايا الظهارية من الجرذ كاودا إبيديديميدس

ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات التالية تحت ظروف غير معقمة ما لم ينص على خلاف ذلك.

  1. إعداد أدوات تشريح والكواشف
    1. تطهير أدوات تشريح عن طريق الغمر في الايثانول 70٪ والسماح لهم الهواء الجاف.
    2. بدوره على حمام الاحترار (32 درجة مئوية). إعداد ودافئة قبل 500 مل من 1X معهد روزويل بارك التذكاري 1640 متوسطة (رمي) تستكمل مع 1٪ (ت / ت) أنتيبيو(100 / مل من البنسلين و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين النهائي)، وصفت بأنها "رمي (+ P / S 1: 100)". قم بتنفيذ هذه الخطوة في محطة عمل تعمل بنظام التحكم في تدفق الهواء النظيف.
    3. إعداد و قبل الحارة 1x 500 مل إيسكوف في تعديل دولبيكو المتوسطة (إدمم) التي تحتوي على الأحماض الأمينية غير الضرورية (0.1 ملم) والبيروفات الصوديوم (1 ملم)، وتستكمل مع 5 α- ديهيدروتستوستيرون (1 نانومتر)، 10٪ البقري الجنين المصل، 1٪ (ت / ت) المضادات الحيوية (100 U / مل البنسلين و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين النهائي)، وصفت بأنها "كامل إدم". إنشاء 50 مل أليكوتس وختم مع بارافيلم. مخزن في 4 درجات مئوية. استخدام شروط العقيم.
    4. إعداد حل كولاجيناز انزيم الهضم عن طريق إذابة كولاجيناز النوع الأول وكولاجيناز النوع الثاني في رمي (+ P / S 1: 100) مما أدى إلى 1 ملغ / مل من كل كولاجيناز في الحل. تصفية من خلال غشاء 0.22 ميكرون وعلامة باسم "كولاجيناز الحل". إبقاء في درجة حرارة الغرفة (رت) حتى الاستخدام. ضبط حجم محلول الإنزيم القائمعلى وزن الانزيم. والحد الأدنى من حجم المطلوبة لكل من البربخ ذرة من الفئران واحد هو 2 مل.
    5. ملء طبق 35 ملم مع رمي (+ P / S 1: 100).
  2. تشريح الفئران ذيل الفلفل
    1. التضحية الحيوان إما عن طريق استخدام بينتوباربيتال الصوديوم 85 ملغ / كغ الملكية الفكرية أو باستخدام غرفة إيسوفلوران حتى الحيوان لا يستجيب لتحفيز ذيل معسر، متابعة عن طريق خلع عنق الرحم.
    2. تطهير أسفل البطن عن طريق مسح مع الايثانول 70٪، ودفع بلطف الخصيتين اثنين وصولا الى أسفل البطن، ومن ثم فتح أسفل البطن بالقرب من كيس الصفن.
    3. التقاط الدهون البربخ، تشريح الجهاز التناسلي كله (الخصيتين، البربخ، والأسهر) وتزج في الطبق مع رمي (+ P / S 1: 100).
    4. نقل الأعضاء التناسلية في الطبق مع رمي (+ P / S 1: 100) إلى محطة عمل العقيم.
    5. تشريح من البربخ ذرة من الأنسجة الضامة والدهنية و إيبيديديمال، كبسولة. وضع البربخ واحد مع ~ 0.2 مل من كولاجيناز الحل في أنبوب 1.5 مل.تحقيق هذه الخطوة في محطة تدفق الهواء نظيفة تسيطر عليها.
  3. التفكك من خلايا واحدة من الفئران ذيل البربخ
    1. قطع البربخ في الحل كولاجيناز باستخدام مقص غرامة حتى يصبح الأنسجة عجينة مثل السوائل. شطف مقص بلطف مع بقية (~ 0.8 مل) محلول انزيم في أنبوب 1.5 مل.
    2. وضع أنبوب على ثيرموميكسر المعدنية لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع سرعة تهز 1000 دورة في الدقيقة.
    3. الطرد المركزي خليط انزيم الأنسجة في 30 x ج في رت لمدة 3 دقائق وصب طاف لزجة التي تحتوي في الغالب على الحيوانات المنوية.
    4. ريسوسبيند بيليه في 1 مل كامل إدم لإرواء كل النشاط الأنزيمي. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 50 مل تحتوي على 49 مل رمي (+ P / S 1: 100).
      ملاحظة: اختياريا، وتصفية تعليق الخلية من خلال غشاء شبكة 100 ميكرون مع تريتورات ثابتةأيون لتجنب كبيرة، خلايا المجاميع. ومع ذلك، لا تستخدم فلتر شبكة إذا كان هناك حاجة إلى تعليق الخلية لزراعة الطبقات الوحيدة الخلية.
    5. الطرد المركزي الخليط الخلوي في 30 x ج في رت لمدة 10 دقيقة. صب طاف.
    6. ريسوسبيند الكرية في 1 مل كامل إدم مع تريتوراتيون لطيف لمدة 5 دقائق على الأقل لفصل خلايا واحدة من الأنزيمية مخاليط الأنسجة البربخية المعالجة.
  4. فصل الخلايا الظهارية من الخلايا الأخرى تحت ظروف معقمة
    1. ثقافة تعليق الخلية على طبق بتري 10 سم تحتوي على كامل إدم لمدة 8 ساعات على الأقل أو بين عشية وضحاها، في حاضنة عند 32 درجة مئوية في 5٪ كو 2 .
    2. إعداد كوفرسليبس العقيمة مقدما عن طريق الغمر في الكحول 100٪. الهواء الجاف وتراجع في حجم صغير من وسط الثقافة. وضع كوفرسليبس في 6 سم أطباق الثقافة أو في آبار واحدة من لوحة 24 جيدا.
    3. في صباح اليوم التالي، وحصاد الخلايا الظهارية فصلها عن طريق جمع بلطف تعليق الخليةسيون من طبق بتري، والذي يتكون في معظمه من الخلايا الظهارية. الطرد المركزي تعليق الخلية في 30 x ج في رت لمدة 5 دقائق، ثم صب طاف.
    4. ريسوسبيند بيليه الخلية في ~ 2 مل كامل إدم.
    5. البذور 0.2 مل من تعليق خلية تحصد على مركز كل ساترة العقيمة.
    6. السماح تعليق خلية تسوية في قطرة السائل لمدة 10 دقيقة على الأقل للسماح للخلايا لالتزام فضفاضة كوفرسليبس الزجاج. إضافة بعناية 1 مل كامل إدمم على حافة طبق 10 سم، أو 0.3 مل كامل إدم إلى كل بئر من لوحة 24 جيدا. لا تخل الخلايا.
    7. الحفاظ على خلايا واحدة معزولة على كوفرسليبس في الحاضنة في 32 درجة مئوية في 5٪ كو 2 حتى التجارب التصحيح المشبك.

3. تسجيل الحلول و ميكروبيبيتس

ملاحظة: للتجارب التصحيح المشبك، واستخدام أفضل المواد الكيميائية ذات الجودة والحلول.

  1. إعداد حلول الأسهم
    1. الأوتوكلاف جميع زجاجات لتخزين الأسهم وتصفية جميع حلول الأسهم (ما عدا الحلول المسببة للتآكل) وتصفية من خلال الأغشية 0.22 ميكرون قبل الاستخدام.
    2. إعداد جميع حلول الأسهم مقدما في رت، وتخزينها في 4 س C: 5 M كلوريد الصوديوم. 1 M بوكل؛ 100 ملي مغكل 2 ؛ 100 ملي كاكل 2 ؛ 200 ملي ناه 2 بو 4 ؛ 100 ملي إغتا (درجة الحموضة 7.0 مع كوه). التعامل مع 5 M هيدروكسيد الصوديوم، 1 M حمض الهيدروكلوريك و 1 M كوه الأسهم كما حلول تآكل.
  2. إعداد معيار تسجيل الخارجي حل الملح الفسيولوجية (بس)
    1. دافئ حلول الأسهم ل رت في صباح التسجيل التصحيح المشبك.
    2. ماصة المكونات من كل الأسهم وفقا لحجم النهائي المطلوب، باستثناء كاكل 2 ، على سبيل المثال لإعداد 500 مل من بس: 140 ملي كلوريد الصوديوم = 14 مل من 5M. 5 ملي بوكل = 2.5 مل من 1M؛ 1.2 ملي مغكل 2 = 6 مل من 100 ملم؛ 1.2 ملي ناه 2 بو 4 = 3 مل من 200 ملم.
    3. إضافة مزدوجةالمياه المقطر (د 2 O) إلى الحجم النهائي من 400 مل وتوازن.
    4. تزن 0.9 غرام من الجلوكوز و 1.19 غرام هيبيس وتذوب تماما في خليط الحل.
    5. إضافة كاكل 2 الأسهم (2.5 ملم = 12.5 مل من 100 ملم) مع التحريك.
    6. أضف ما يصل إلى 99٪ من الحجم النهائي.
    7. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم أو حمض الهيدروكلوريك.
    8. تحقق الأسمولية وضبط باستخدام 5 M كلوريد الصوديوم أو الجلوكوز، إذا لزم الأمر.
    9. إضافة د 2 O إلى الحجم النهائي من 500 مل في اسطوانة.
  3. إعداد الحلول الداخلية ميكروبيبيت (منخفضة إغتا K + القائم على الحلول)
    1. وزن أو ماصة الحجم الصحيح من الكواشف من كل سهم وفقا لحجم النهائي المطلوب والتركيز، على سبيل المثال لإعداد 50 مل منخفضة إغتا K + المستندة إلى حل الخلايا إلى حجم من ~ 30 مل د 2 O: 100 ملي K- غلوكونات = 1.17 غرام؛ 35 ملي بوكل = 1.75 مل من 1 M؛ 2 ملي مغكل 2 = 1 ملمن 100 ملي. 0.1 ملي إغتا = 0.05 مل من 100 ملي. 10 ملي هيبيس = 0.072 ز.
    2. إضافة ما يكفي من المياه ل ~ 95٪ من الحجم النهائي والسماح للحل للتوازن في رت. تأكد من أن الحل واضح.
    3. في حين التحريك باستمرار الحل، وضبط درجة الحموضة إلى 7.2 باستخدام كوه.
    4. تزن وإضافة 0.078 غرام مغ-أتب إلى الحل حتى يتم حله تماما.
    5. وضع الحل على الجليد واستخدام قسامة صغيرة لقياس الأسمولية. عادة، وتدابير الحلول ~ 290 مسمول ولا تحتاج إلى تعديل. إذا كان الأسمولية يختلف بشكل كبير من 280-295 مسمول، وإعداد حل جديد.
    6. أضف د 2 O إلى الحجم النهائي.
    7. تقسيم الحل إلى 500 قسامة ميكرولتر، مرشح مع مرشح حقنة 0.2 ميكرون، ختم بإحكام ومخزن على الفور في ≤ -20 درجة مئوية.
    8. في تاريخ التجربة التصحيح المشبك، ذوبان الجليد قسامة واحدة من الحل داخل الخلايا على الجليد والحفاظ على المبردة خلال تجربة التصحيح المشبك لمنع التدهور.
  4. سحب ماصات التصحيح من الشعيرات الدموية الزجاج (التالية ماصة مجتذب دليل المستخدم) للحصول على أحجام ميكروبيبيت مع مقاومة 5-10 M عندما مليئة حل داخل الخلايا.

4. إعداد تجربة التصحيح المشبك وإنشاء خلية كاملة التكوين مع الخلايا

  1. إعداد تجربة التصحيح المشبك
    1. تشغيل مجموعة التصحيح المشبك (الكمبيوتر، مضخم الكمبيوتر التي تسيطر عليها، التحويل الرقمي، وما إلى ذلك )
    2. فتح برنامج التصحيح المشبك (على سبيل المثال أكسون pCLAMP10 أو هيكا باتشماستر) وإعداد بروتوكولات للتسجيلات الكهربية. تعيين مرشح للإشارة إلى تمريرة منخفضة في 1-3 كيلو هرتز و ديجيتيزر في 10-20 كيلوهرتز.
    3. بدوره على الكاميرا، ميكرومانيبولاتور ومصدر الضوء.
    4. عندما يكون مكبر للصوت التي تسيطر عليها الكمبيوتر على، الأرض الجسم من المجرب عن طريق لمس مع اليدين التصحيح المشبك تلاعب التي تم ترتكز،قبل لمس الرأس، من أجل حمايتها من الصدمات الكهربائية.
    5. نقل الخلايا الظهارية زراعة على ساترة الزجاج إلى غرفة تسجيل مليئة ~ 1 مل من بس القياسية في رت. تغيير بعناية بس الاستحمام مرتين على الأقل باستخدام ماصة قبل أي التجارب التصحيح المشبك.
      ملاحظة: اختياريا، وملء نظام نضح مع بس القياسية أو حل خارجي آخر وفقا لتجربة المخطط لها. إرضاء المجهر محمولة على غرفة تسجيل (أرسي-26G أو أرسي-26GLP) مع بس عدة مرات بسرعة ~ 2 مل / دقيقة قبل بدء التجارب التصحيح المشبك. تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء المحاصرين على طول نظام نضح.
    6. عرض وحدد الخلايا تحت المجهر مقلوب باستخدام أهداف 10X و 40X مجهزة تفاضلية تدخل نظام بصري النقيض. ابحث عن خلايا معزولة واحدة كبيرة للتسجيل. تحديد الخلايا الظهارية البربخ معزولة عن طريق شكل كروية مع م الخامإيكروفيلي على طرف واحد من الأغشية والاستقطاب توزيع محتويات الخلايا ( الشكل 1 ).
    7. باستخدام حقنة 1 مل (إبرة ميكروسيرينج محلية الصنع غير المعدنية)، وملء ميكروبيبيت مع الحل الداخلي (منخفض إغتا K + القائم على حل، راجع الخطوة 3.3). تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء في ميكروبيبيت، والتي يمكن أن تزيد من مقاومة ميكروبيبيت. استخدام ما يكفي من الحل بحيث الحل الداخلي يغمر الكلوريد المغلفة الكهربائي سلك الفضة داخل حامل ميكروبيبيت.
    8. جبل ميكروبيبيت في حامل القطب، وتطبيق ضغط إيجابي منخفض (~ 0.2 مل حجم حقنة). الحفاظ على انخفاض الضغط الإيجابي المستمر حتى لمس غشاء الخلية في الخطوات اللاحقة.
  2. إنشاء خلية كاملة التكوين مع خلايا للتسجيلات
    1. تزج ماصة في حل حمام في أعلى سرعة ميكرومانيبولاتور. العثور على ماصةتلميح في الشاشة المتصلة الكاميرا الرقمية. إبطاء سرعة ميكرومانيبولاتور إلى وضع المتوسطة عالية.
    2. تحقق بسرعة المقاومة ميكروبيبيت (5-10 MΩ) باستخدام الأمر واجهة الحصول على البيانات (على سبيل المثال "اختبار الغشاء" في نظام أكسون) من خلال تطبيق خطوة الجهد (على سبيل المثال 5 مف ل 100 مس) ولدت من مكبر للصوت الكمبيوتر التي تسيطر عليها. تغيير إلى ميكروبيبيت جديدة إذا كانت المقاومة بشكل كبير من هذا النطاق.
    3. البدء في التحرك إلى أسفل الهدف شنت على المجهر. توجه تدريجيا ميكروبيبيت نحو الخلية المحددة. دائما خفض الهدف أولا، ومن ثم خفض ميكروبيبيت إلى الطائرة من التركيز، حتى ميكروبيبيت هو فوق وسط سطح الخلية المحددة.
    4. إلغاء إمكانات تقاطع السائل بين ماصة والحلول حمام إلى الصفر باستخدام "ماصة تعويض" الأمر في واجهة قائد البرنامج.
    5. تعيين مكبر للصوت الكمبيوتر التي تسيطر عليها كومأندر إلى الجهد المشبك واختبار الغشاء إلى وضع "حمام".
    6. التركيز بشكل جيد لعرض أكثر وضوحا من الخلية، ثم خفض تدريجيا ميكروبيبيت باستخدام ميكرومانيبولاتور في سرعة منخفضة والمتوسطة.
    7. عندما ميكروبيبيت على مقربة من الخلية (يتضح من انخفاض التيار عندما أثارها أمر اختبار الغشاء)، وإزالة الضغط الإيجابي المنخفض على الفور وتطبيق ضغط سلبي ضعيف (0.1 مل حجم حقنة) لتشكيل جيغاسيال (> 1 GΩ) .
    8. مراقبة المقاومة مع اختبار الغشاء. إذا كانت المقاومة أكثر من 500 ميجاواط، ولكن أقل من 1 جيجاواط، استخدم إمكانات سلبية (عادة ما تكون قابلية الإمساك التي تم تعيينها إلى -60 مف)، والتي يمكن أن تساعد في تشكيل الجيجاسي. تعويض التيار بالسعة عابرة من ميكروبيبيت.
    9. إذا كان الختم> 1 GΩ ومستقرة (كما هو مبين في واجهة البرنامج)، وتطبيق شفط وجيزة وقوية من أجل كسر غشاء الخلية. لا تنطبق التعويض عن سيمقاومة الشفاء و سعة الخلية.
    10. مباشرة بعد تحقيق تكوين خلية كاملة ناجحة، وتطبيق خطوة 10 هيبيربولاريزينغ مف (5 آثار مع الحد الأدنى من فترات زمنية، مدة 20 مللي ثانية، وعينة إشارة في 20 كيلو هرتز) من إمكانية عقد من -60 مف.
    11. تبديل وضع الجهد إلى وضع صفر الحالي ووضع علامة أسفل قراءات من واجهة البرنامج أو إجراء تسجيل خالية من الفجوة (10-60 ق) لقراءات الغشاء المحتملة للخلية.
    12. التبديل بسرعة إلى والبقاء في وضع الجهد وتطبيق بروتوكولات الجهد وفقا للتجارب المخطط لها وقياس الردود الحالية. لا يتم تطبيق الطرح على تيار التسرب الداخلي أثناء التسجيلات.
    13. مراقبة استقرار الردود خلال التسجيلات، أو المعلمات المختلفة للخلية. على سبيل المثال، استخدم واجهة اختبار "غشاء اختبار" للتحقق من مقاومة الإدخال (R ط )، ومقاومة سلسلة (R ق ) والخلية(C م ) في اختبار الغشاء في وضع "الخلية" أثناء تبديل البروتوكولات.
      ملاحظة: قطرات مفاجئة في مقاومة المدخلات عادة ما يدل على التصحيح فضفاضة، وزيادة دراماتيكية في المقاومة سلسلة قد يكون مؤشرا على طرف ميكروبيبيت انسداد من العضيات داخل الخلايا أو شظايا غشاء. أثناء التسجيل، ورصد بانتظام موقع ميكروبيبيت للتحقق مما إذا كان يحدث الانجراف، والتي قد تؤدي إلى فقدان التصحيح. إذا الانجراف هو مشكلة، ورفع بعناية معا ميكروبيبيت وخلايا الترقيع بعيدا عن الجزء السفلي من غرفة التسجيل. قد تؤدي هذه الخطوة في بعض الأحيان إلى فقدان التصحيح، وفي هذه الحالة، فمن الضروري لتكرار كامل خلية التصحيح المشبك الإجراء.

5. تحليل الخصائص الكهربية الكهربية السلبية للخلايا

  1. بعد الحصول على البيانات من التجارب التصحيح المشبك، افتح البيانات خالية من الفجوة في البرنامج كلامبيت وقياس متوسطقيمة لإمكانية غشاء يستريح لكل خلية. بدلا من ذلك، استخدم القيمة كما هو ملحوظ من الجهد صفر التيار في الوضع الحالي. تصحيح القيم مع إمكانات تقاطع السائل (12.4 مف في هذه الدراسة).
  2. فتح البيانات من الخطوة 10-مف هيبيربولاريزينغ (ΔV) التي تم الحصول عليها من خلية، وقياس الفرق الحالي قبل وأثناء الخطوة (Δ I خطوة )، وحساب مقاومة الإدخال (R i ) باستخدام المعادلة على النحو التالي:
    المعادلة 1
  3. حساب السعة الخلية (C م ، في وحدة من يف) (استخدام نفس البيانات الحالية من 10-مف خطوة هيبيربولاريزينغ من خلال دمج المساحة الإجمالية تحت تيار مكثف الغشاء خلال الأولي الحالي تسوس عابرة رفعت على الزناد خطوة الجهد)، للحصول على قيمة إجمالي الشحن المتراكم (Q، في وحدة با • مللي ثانية) للخلية. استخدم المعادلة التالية:
    المعادلة 2
  4. حساب قيمة المقاومة سلسلة (R s ) لكل خلية عن طريق تركيب الحالي عابر الأولي من الخطوة السلبية 10-مف مع خوارزمية أسي القياسية للحصول على الوقت الحالي تسوس الحالي ( T ، في وحدة مس) واستخدام بعد المعادلة:
    المعادلة 3

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الإجراء الهضم الأنزيمي وصفها لعزل الخلايا الظهارية من البربخ ذيل الفئران هو بروتوكول معدلة من دراساتنا السابقة 9 ، 12 . هذه الطريقة تنتج خليطا من الخلايا المفردة مع أكثر من 90٪ بقاء ودون بثور سطحية أو تورم حجم الخلية. يتكون خليط الخلية غير المتجانسة أساسا من الخلايا الرئيسية والخلايا واضحة والخلايا القاعدية، كما وصفنا سابقا 1 . في هذا البروتوكول، عينات نقية نسبيا من الخلايا الظهارية البربخ يمكن الحصول عليها عن طريق زراعة الخلايا فصلها بين عشية وضحاها بين عشية وضحاها على طبق بيتري للسماح لالتصاق الخلايا غير الظهارية (مثل الخلايا الليفية والخلايا الملساء) على الطبق، كما أظهرت في الشكل 1A (قبل الحصاد). ويمكن بعد ذلك تمييز أنواع الخلايا بشكل مبدئي من خلال الظواهر الخاصة بهم تحت المجهروتصنيفها وفقا لخصائصها الغشاء السلبي محددة. في خليط الخلية فصلها، وهناك مجموعة من الخلايا التي لديها ميكروفيلي أو غشاء الخام على طرف واحد من غشاء سطحها، والمحتويات الخلوية الاستقطاب. وتسمى هذه الخلايا الرئيسية أو خلايا تشبه واضحة ( الشكل 1B ، والسهام). هذه الخلايا الظهارية المستقطبة لا يمكن تمييزها من خلال ميزاتها المورفولوجية ولكن يمكن تحديدها وفقا لخصائصها الغشاء السلبي والاستجابات تصرف الحصول عليها من كامل خلية التصحيح المشبك التسجيلات. مجموعة أخرى من الخلايا أصغر في الحجم مع عدم وجود ستيريوسيليا على نهاية واحدة من الغشاء وليس واضحة محتويات الخلوية الاستقطاب. وتسمى هذه الخلايا لا ميكروفيلي، وتتألف من خلايا القاعدية في الغالب ( الشكل 1B ، النجمة).

يمكن تمييز الخلايا الرئيسية الظهارية الأولية من الخلايا الأخرى من قبلإر مميزة خصائص الغشاء السلبي ( الشكل 2 ) والأنماط الحالية ( الشكل 3 ) استجابة لبروتوكول الجهد تطبيقها باستخدام كامل خلية تقنية التصحيح المشبك. يمكن للخصائص الكهربية الغشاء السلبي للخلايا تساعد على تقييم الحالة الصحية الأولية للخلايا الفردية ومجموعات نوع الخلية. ويرد ملخص من النقاط المؤامرة الفردية من السعة الغشاء (C م )، ومقاومة المدخلات (R م ) وإمكانية الغشاء (V م ) من كل مجموعة الخلايا في الشكل 2A . ليس هناك فرق في الوقت ثابت لسعة غشاء بين أنواع الخلايا المختلفة (~ 0.4 مللي ثانية) (لا تظهر البيانات في هذه المخطوطة). باستخدام الحل المنخفض إغتا K + ، ومتوسط ​​قياس السعة الغشاء للخلايا الرئيسية هو 9.4 0.5 يف (ن = 32) وبالنسبة للخلايا الشبيهة مثل 9.7 1.9 يف (ن = 12). السعة الغشاء منوالخلايا لا ميكروفيلي هو 5.2 0.8 يف (ن = 17)، وهو أصغر إحصائيا من مدير وخلايا شبيهة مثل غشاء السعة.

مقاومة المدخلات من الخلايا الرئيسية في الشكل 2A (لوحة الأوسط) هو 1.1 ± 0.2 GΩ (ن = 32)، وأن الخلايا الواضحة هي 2.2 ± 0.8 GΩ (ن = 12)، وهو أقل بكثير (P <0.001) من أي من الخلايا لا ميكروفيلي (8.9 ± 2.1 GΩ؛ ن = 17). كما هو مبين في الشكل 2A (اللوحة اليمنى)، وقياس الغشاء الصفر الحالية المحتملة ( أي يستريح غشاء المحتملة V م ) تم قياسها بعد فترة وجيزة من تكوين خلية كاملة وتستخدم لمقارنة المجموعات بعد التصحيح مع إمكانات تقاطع السائل (12.4 بالسيارات). وكانت الخلايا تستحم بشكل روتيني في بس القياسية و دياليزد مع 0.1 ملي إغتا K + القائم على ماصة حل تحتوي على أتب. معهمإين غشاء المحتملة من الخلايا الرئيسية هو -26 ± 2 (ن = 28)، بين -51 مف و +1 مف، ومتوسط ​​احتمال الغشاء للخلايا تشبه واضحة هو -30 ± 3 مف (ن = 10)، بين 47-مف و -17 مف. تمتلك الخلايا التي لا تحتوي على ميكروفيلي أعلى متوسط ​​غشاء محتمل مع قيمة -33 ± 5 مف (ن = 17)، بين -63 مف و -13 مف.

انخفاض مقاومة المدخلات من الخلايا الرئيسية تشير إلى أن هناك صلات جوهرية في هذه الخلايا، ولكن يمكن أن تشير إلى تسرب الختم بين ماصة والأغشية خلية التصحيح. لمعالجة هذا القلق، قمنا أولا باستبعاد البيانات من تلك الخلايا مع التغيرات المفاجئة (تدل على تسرب الختم) من الخصائص الكهربائية أثناء التسجيلات. ثم قمنا بتحليل العلاقة بين مقاومة الختم عند عتبة 1 غيغا أوم مع مقاومة المدخلات، كما هو مبين في الشكل 2B . وكانت النتيجة قيمة ارتباط منخفضة جدا (R 2 ≈ 0.02). وهذا يشير إلى أن مقاومة الختم له تأثير ضئيل على مقاومة المدخلات، وأن الخصائص الكهربائية السلبية المبلغة للخلايا المختلفة (مثل مقاومة المدخلات المنخفضة للخلايا الرئيسية) هي الخصائص الجوهرية لهذه الخلايا.

الشكل 3A هو الاستجابة الحالية نموذجية سجلت من الخلايا الرئيسية تحت ظروف شبه الفسيولوجية مع الخلايا الاستحمام في محلول الملح الفسيولوجية العادي (بس)، دياليزد مع انخفاض ماصة إغتا K القائم على محلول وتحفيز من إمكانية عقد -60 مف إلى سلسلة من 500 مللي ثانية اختبار الفولتية (تتراوح بين -120 مف إلى +60 مف كما هو مبين في إدراج الشكل 3B ). يظهر اقتفاء أثر في الشكل 3C الاستجابات نموذجية يستريح غشاء الخلية الرئيسية المحددة تحت المشبك صفر الحالي في وجود، أوغياب أتب في حل ماصة. في وجود أتب، وإمكانات يستريح مستقرة نسبيا. في حين لوحظ فرط الاستقطاب التدريجي عندما تم دياليزد الخلايا مع محلول ماصة دون أتب. الغشاء الأولي المحتملة المحتملة تقاس في بداية غسيل الكلى مع حلول ماصة يظهر أي فرق كبير في الخلايا مع أو بدون أتب ( الشكل 3D )، مما يشير إلى أن القيم المقاسة كانت لا تزال سليمة وتتأثر الحد الأدنى من حلول ماصة.

شكل 1
الشكل 1 : السمات المورفولوجية من الفئران معزولة ذيل البربخ الخلايا الظهارية. ( A، B ) أمثلة من الخلايا الظهارية المعزولة من الفئران ذرة البربدة قبل ( A ) وبعد ( B ) إعادة حصاد أوفرنيت الثقافة على طبق قبل التجارب التصحيح المشبك. السهام تشير إلى خلايا ميكروفيلي، والتي تتكون أساسا من الخلايا الرئيسية والخلايا تشبه واضحة. النجمة تشير إلى خلايا لا ميكروفيلي. تم اختيار خلايا واحدة فقط لتسجيل التصحيح المشبك. شريط مقياس = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2 : خصائص غشاء سلبي من الفئران واحد ذيل البربخ الخلايا الظهارية. ( A ) المؤامرات نقطة من خصائص غشاء السلبي من الفئران واحد ذيل البربخ الخلايا الظهارية. حل ماصة منخفضة إغتا K + المستندة وحل الاستحمام هو بس القياسية. ( B ) تحليل الارتباط من المدخلات ريسإستانس مع مقاومة ختم الخلايا. نس : لا فرق كبير، * P <0.05، ** P <0.01 *** P <0.001 فرق كبير مقابل الضوابط المناسبة باستخدام اتجاه واحد أنوفا مع بونفيروني بعد الاختبار المخصص. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3
الشكل 3 : نموذجي التيارات خلية كاملة في الخلايا الرئيسية البربخ واحد. ( A ) التيارات خلية كاملة نموذجية سجلت من الخلايا الظهارية البربخية واحدة سجلت تحت ظروف شبه الفسيولوجية باستخدام بروتوكول النبض استحضار كما هو مبين في مجموعة من ب. خط منقط أشار إلى مستويات الصفر الحالية. ( ب ) العلاقة الحالية الجهد من الاستجابة الحاليةإس المقاسة في النقاط الزمنية المشار إليها كما في A. البيانات هي وسائل ± سيم من ثمانية خلايا رئيسية من ثلاثة على الأقل الحيوانات. ( C ) اقتفاء أثر ممثل من إمكانات غشاء يستريح من الخلايا الرئيسية دياليزد مع حل ماصة، إما مع أتب (+ أتب) أو بدون أتب (-ATP). ( D ) رسم بياني شريطي لا يوجد فرق كبير بين إمكانية غشاء الاستعادة الأولية ل + أتب و -ATP. القيم هي وسائل ± سيم قياس في الوقت المشار إليه في لوحة C. الأرقام في قوس داخل الأشرطة تشير إلى عدد الخلايا التي تم اختبارها من ثلاث حيوانات على الأقل. نس : لا فرق كبير. ( E ) تحليل الارتباط لمقاومة الختم ومقاومة المدخلات من جميع الخلايا، أو الخلايا الرئيسية فقط، مقابل الأغشية يستريح قياسها في المشبك صفر الحالي بعد فترة وجيزة من إنشاء خلية كاملة والمقاييس الحالية قياسها في فرط الاستقطاب خطوة إلى -100 مف من عقد potential. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

في هذا البروتوكول، فإن تشتت الأنزيمية من الفئران ذيل البربخ يولد باستمرار الخلايا الظهارية صحية. نوعية الخلايا الظهارية البربخية للتجارب التصحيح المشبك يعتمد على بضع خطوات حاسمة في البروتوكول. على سبيل المثال، الطرد المركزي من خليط الخلية في قوة الطرد المركزي منخفضة (30 زغ) مهم لإزالة الحيوانات المنوية والمحتوى البربخ اللمعية. والخلايا الظهارية البربخ تصبح غير صحية في وجود الحيوانات المنوية في ثقافة الخلية. وبالإضافة إلى ذلك، زراعة خليط الخلية فصلها على طبق بتري لعدة ساعات هو خطوة هامة من أجل إزالة الخلايا الليفية وخلايا العضلات الملساء. والخلايا غير الظهارية تلتزم أسرع على طبق الثقافة، وبالتالي، وترك الخلايا الظهارية في تعليق، والتي يمكن إعادة حصادها طموح لطيف. وعلاوة على ذلك، كولاجيناز الهضم و تريتوراتيون مع ماصة الزجاج غرامة هي خطوتين مهمتين للإفراج عنهمخلايا واحدة أثناء إجراء تفكك الخلية. وأخيرا، فإن الهضم الأنزيمي من خلايا البربخ أمر بالغ الأهمية لتجربة التصحيح المشبك لأن نقص الهضم عن طريق النشاط الأنزيمية غير فعالة أو الإفراط في الهضم عن طريق الحضانة لفترات طويلة يمكن أن تعطل تشكيل ختم جيغا أوم بين ماصة وأغشية الخلايا.

في مخاليط الخلايا، والخلايا في شكل عمودي أكبر مع غشاء الخام تحمل ستيريوسيليا على نهاية واحدة والتوزيع المستقطب من محتويات الخلايا ويفترض الخلايا الرئيسية أو خلايا واضحة. الخلايا الأخرى التي لا تمتلك ميكروفيلي بارزة واستقطاب محتويات الخلية قد تشمل الخلايا القاعدية وبعض الخلايا من الجهاز المناعي. بالإضافة إلى وصف السمات المورفولوجية الأساسية للخلايا الظهارية البربخية، يستخدم هذا البروتوكول كامل خلية طريقة التصحيح المشبك لقياس خاصية الغشاء السلبي من كل خلية. هذه الخصائص الغشائية تسمح للتمييز الأوليأنواع الخلايا. هذا الأسلوب لديه بعض القيود مثل غسل محتويات داخل الخلية مع حل ماصة والاختلافات الإلكترونية فيما يتعلق التعديلات الهندسة الخلوية أثناء التسجيلات المستمرة 19 ، 20 . ونحن نقدم فقط المعلمات التي قمنا قياسها مباشرة بعد إنشاء التكوين خلية كاملة، والتي تعكس الظروف الأولية، سليمة نسبيا من الخلايا. خصائص الغشاء السلبي من كل خلية تشمل السعة الغشائية، ومقاومة المدخلات وإمكانية غشاء يستريح.

السعة المحددة لأغشية الخلايا هي عموما المتفق عليها لتكون 1 μF / سم 2 وهذا ينطبق على الخلايا (مثل الخلايا المناعية والخلايا العصبية) مع طي محدود على أغشية الخلوية 16 ، 18 . ومع ذلك، فإن ثابت السعة المحددة يميل إلى أن يكون أكبر للخلايا ثإيث أكثر تعقيدا، والأبنية الخلوية، مثل الخلايا الظهارية، التي لديها العديد من طيات الغشاء الخلوي في المقصورات متميزة. تشير التقارير إلى أن قيم خط الخلايا الظهارية مدك هي 4 μF / سم 2 و 3 μF / سم 2 للقمي و غشاء القاعدية محددة السعة، على التوالي 17 . في هذه الدراسة، ومتوسط ​​قياس غشاء السعة هي ~ 8 يف و 12 ~ يف لمجموعة الخلايا لا ميكروفيلي والخلايا الرئيسية وخلايا تشبه خلايا واضحة ( أي خلايا ميكروفيلي)، على التوالي. باستخدام السعة المحددة من 1 μF / سم 2 لحساباتنا، والمناطق السطحية الخلية المقدرة هي 500 ميكرون 2 و 1000 ميكرون 2 للخلايا لا ميكروفيلي والخلايا ميكروفيلي، على التوالي، والذي يتوافق مع أقطار 13 ميكرون و 18 ميكرون. ومع ذلك، فإن هذه التقديرات أكبر مما كان متوقعا استنادا إلى أحجام الخلايا تحت المجهر، والتي هي ~ 81؛ م و ~ 12 ميكرون للخلايا لا ميكروفيلي وخلايا ميكروفيلي، على التوالي، وهذه الخلايا حوالي 2.4 μF / سم 2 و 1.9 μF / سم 2 ، على التوالي. نتائجنا تشير إلى أن المشهد الغشاء من خلايا ميكروفيلي لا أكثر تعقيدا من الخلايا الدقيقة الزغب، وهو ما يتسق مع وظائف إفراز والنقل.

السعة المحددة لأغشية الخلايا هي عموما المتفق عليها لتكون 1 μF / سم 2 وهذا ينطبق على الخلايا (مثل الخلايا المناعية والخلايا العصبية) مع طي محدود على أغشية الخلوية 16 ، 18 . ومع ذلك، فإن ثابت السعة المحددة يميل إلى أن يكون أكبر للخلايا مع أكثر تعقيدا، والهياكل الخلوية، مثل الخلايا الظهارية، التي لديها العديد من طيات الغشاء الخلوي في المقصورات متميزة. وتشير التقارير إلى أن قيم خط الخلايا الظهارية مدك هي 4 μF / سم 2 و 3 μF / سم 2 17 . في هذه الدراسة، ومتوسط ​​قياس غشاء السعة هي ~ 8 يف و 12 ~ يف لمجموعة الخلايا لا ميكروفيلي والخلايا الرئيسية وخلايا تشبه خلايا واضحة ( أي خلايا ميكروفيلي)، على التوالي. باستخدام السعة المحددة من 1 μF / سم 2 لحساباتنا، والمناطق السطحية الخلية المقدرة هي 500 ميكرون 2 و 1000 ميكرون 2 للخلايا لا ميكروفيلي والخلايا ميكروفيلي، على التوالي، والذي يتوافق مع أقطار 13 ميكرون و 18 ميكرون. ومع ذلك، فإن هذه التقديرات أكبر مما كان متوقعا على أساس أحجام الخلايا تحت المجهر، ~ 8 ميكرون و ~ 12 ميكرون للخلايا لا ميكروفيلي والخلايا الدقيقة، على التوالي، وهذه الخلايا هي أفضل متوافقة مع قيمة السعة المحددة 2 μF / سم 2 . وهذا يشير إلى أن المشهد الغشاء للخلايا الظهارية البربخية هو موره معقدة من أنواع الخلايا الأخرى، والتي تتفق مع وظائف إفراز والنقل.

في تسجيلات الخلية بأكملها، وتسرب تسرب عبر الغشاء وعلى الختم بين الغشاء وماصة ساهمت كلاهما في خصائص الغشاء المقاسة. الختم لديه مقاومة أعلى بكثير من الغشاء، وذلك له تأثير ضئيل على قياس خصائص الغشاء السلبي، مثل مقاومة المدخلات والغشاء الصفر الحالية المحتملة. واتساقا مع هذا المفهوم، أدى تحليل الارتباط لمقاومة الختم عند عتبة 1 غيغا أوم ضد مقاومة المدخلات لكل خلية إلى قيمة 0.02 ~، مما يشير إلى تأثير ضعيف جدا. كذلك أعطت تحاليل ارتباط أخرى لمقاومة الختم أو مقاومة المدخلات مقابل إمكانات الغشاء المستريح أو المقاس الحالي المقاس عند -100 مف قيم منخفضة لجميع الخلايا المختبرة أو للخلايا الرئيسية فقط. نتائجنا ديمونسترات أن مقاومة المدخلات من الخلايا الرئيسية البربخ والخلايا تشبه واضحة هو أقل بكثير من الخلايا لا ميكروفيلي، وبالتالي توفير معلمة أولية للحكم للتمييز أنواع الخلايا. وتشير هذه النتائج إلى أن انخفاض مقاومة المدخلات في الخلايا الرئيسية هو خاصية الفسيولوجية الذاتية للخلايا. الخلايا الظهارية واحدة تمتلك أيضا أنماط الحالية متميزة ردا على البروتوكولات المطبقة والظروف التجريبية. لاحظنا أن كل نوع خلية محددة عرضت أنماط الحالية الفريدة تحت نفس بروتوكول الجهد المطبق. مثال يوضح في الشكل 3 يوضح الاستجابات الحالية نموذجية سجلت من الخلايا الرئيسية تحت ظروف شبه الفسيولوجية، كما ذكرنا سابقا 9 . والخصائص الكهربية الفسيولوجية لكل نوع من الخلايا المتخصصة متباينة بسهولة (لا تظهر البيانات في هذه الورقة). واستنادا إلى هذه المعايير،أنواع الخلايا المختلفة يمكن تصنيفها تقريبا في الخلايا الرئيسية، وخلايا تشبه واضحة وخلايا لا ميكروفيلي، كما هو موضح في النتائج.

مقاومة المدخلات هي مقاومة الغشاء ردا على الخطوة المحتملة تطبيق (10 مف خطوة هيبيربولاريزينغ في هذه الدراسة) أثارت من إمكانية عقد -60 مف. ويعكس ذلك مدى نشاط القناة المفتوحة استجابة للإمكانيات المطبقة. وفي هذا الصدد، فإن المقاومة المنخفضة تعني ضمنا "تسرب" جوهري كبير للخلايا، في حين أن المقاومة العالية تنطوي على قنوات مغلقة. انخفاض قيمة المدخلات المقاومة في الخلايا الرئيسية يتوافق مع سلوك غشاء بارز، في حين أن الخلايا الشبيهة مثل التي تمتلك تصرف صغير في إمكانات غشاء الاختبار يعني سلوكها المعتدل في ظل ظروف التسجيل. مقاومة المدخلات عالية بشكل كبير من الخلايا لا ميكروفيلي يعني أنه ليس لديهم قنوات مفتوحة في هذا الوضع. في صفر-سوالمشبك رنت، متوسط ​​إمكانات غشاء يستريح من الخلايا الظهارية المعزولة قياسها هي في نطاق 26-33 مف لمجموعات الخلايا الثلاث. هذه القيم قابلة للمقارنة مع احتمال الغشاء المبلغ عنها (-30 مف) باستخدام طريقة ميكرولكترود 21 . ومع ذلك، فإن إمكانيات الراحة قياس تختلف اختلافا واسعا في الخلايا الفردية (من +3 مف إلى -63 مف) على الرغم من عدم وجود إمكانات ارتفاع عفوية. هذا الاختلاف قد يعكس التفاعل بين مختلف أنشطة القنوات الأيونية في أنواع مختلفة من الخلايا، مثل التفاعل مقترن من TRPV6 وقنوات TMEM16A في الخلايا الرئيسية، كما ذكرنا مؤخرا 9 . ومن الجدير بالذكر أنه عندما تم دياليزد الخلايا مع ماصة أتب، لاحظنا أي إمكانات كهربائية عفوية في الخلايا الرئيسية. وهذا يتفق مع تصنيف الخلايا الظهارية كما غير قابلة للإثارة 4 . A فرط الاستقطاب التدريجي عندما تم دياليزد الخلايا مع بيالحل بيت دون أتب قد تعكس ظهور تدريجي من أتب الحساسة البوتاسيوم الحالي. وقد أفيد أن يتم التعبير عن قنوات البوتاسيوم الحساسة أتب في جهاز جولجي من الخلايا الرئيسية للبربخ الفئران وأن نضوب أتب داخل الخلايا يؤدي إلى تفعيل قنوات K أتب 14 ، 22 . هذه الملاحظة تشير إلى أن إدراج أتب في حل ماصة تفضل الظروف الفسيولوجية مستقرة من الخلايا الرئيسية البربخ.

تقنية خلية كاملة المشبك التصحيح هو طريقة راسخة التي تستخدم عادة لدراسة الفيزيولوجيا الكهربية للخلايا المنشطة، مثل الخلايا العصبية. في هذه الورقة، أظهرنا أنه أيضا أداة مفيدة لتوصيف خصائص بيويلكتريكال للخلايا غير قابلة للانفجار، مثل الخلايا الظهارية. وبالإضافة إلى ذلك، هذا البروتوكول يتيح التحقيقات وظيفية من البربخ معزولة الابتدائيالخلايا الظهارية لزيادة توضيح دورهم الفسيولوجي في البربخ. توفر هذه الدراسة بعض الخصائص الكهربائية الأولية للخلايا الظهارية المعزولة من الفئران ذئبة البربخ للمساعدة في التحقيقات المستقبلية للسلوك الفسيولوجي لهذه الخلايا وأهميتها البيولوجية الكامنة في البربخ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

نشكر الدكتور كريستوفر أنتوس على تعليقات مفيدة على النص. وأيد هذا العمل بتمويل من جامعة شانغهاي تك منح ليني شوم وبتمويل من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (ننسكف رقم 31471370).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instrument of AXON system
Computer controlled amplifier Molecular Devices - Axon Multiclamp 700B patch-clamp amplifier
Digital Acquisition system Molecular Devices - Axon Digidata 1550 converter
Microscope Olympus BX-61WI
Micromanipulator Sutter Instruments MPC-325
Recording chamber and in-line Heater Warner Instruments TC-324C
Instrument of HEKA system
Patch Clamp amplifier Harvard Bioscience - HEKA EPC-10 USB double
Microscope Olympus IX73
Micromanipulator Sutter Instruments MPC-325
Recording chamber and in-line Heater Warner Instruments TC-324C
Other Instrument
Micropipette Puller Sutter Instrument  P-1000
Recording Chamber Warner Instruments RC-26G or homemade chamber
Borosilicate capillary glass with filament Sutter Instrument / Harvard Apparatus BF150-86-10
Vibration isolation table TMC  63544
Digital Camare HAMAMASTU ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU
Reagents for isolation
RPMI 1640 medium Gibco 22400089
Penicillin/Streptomycin Gibca 15140112
IMDM ATCC  30-2005 
IMDM Gibco C12440500BT
Collagenase I Sigma C0130
Collagenase II Sigma C6885
5-α-dihydrotestosterone Medchemexpress HY-A0120
Fetal bovine serum capricorn FBS-12A
Micropipette internal solutions (K+-based solution) (pH 7.2, 280-295 mOsm)
KCl, 35mM Sigma/various V900068
MgCl2 · 6H2O, 2mM Sigma/various M2393
EGTA, 0.1mM Sigma/various E4378
HEPES, 10mM Sigma/various V900477
K-gluconate, 100mM Sigma/various P-1847
Mg-ATP, 3mM Sigma/Various A9187
The standard external recording physiological salt solution (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm)
NaCl, 140mM Sigma/various V900058
KCl, 4.7mM Sigma/various V900068
CaCl2, 2.5mM Sigma/various V900266
MgCl2 · 6H2O, 1.2mM Sigma/various M2393
NaH2PO4, 1.2mM Sigma/various V900060
HEPES, 10mM Sigma/various V900477
Glucose, 10mM Sigma/various V900392
For pH adjustment
NaOH Sigma/various V900797 Purity >=97%
KOH Sigma/various 60371 Purity >=99.99%

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shum, W. W. C., Ruan, Y. C., Da Silva, N., Breton, S. Establishment of Cell-Cell Cross Talk in the Epididymis: Control of Luminal Acidification. J Androl. 32, (6), 576-586 (2011).
  2. Robaire, B., Hinton, B. T. Knobil and Neill's Physiology of Reproduction. Plant, T. M., Zeleznik, A. J. Elsevier. 691-771 (2015).
  3. Da Silva, N., et al. A dense network of dendritic cells populates the murine epididymis. Reproduction. 141, (5), 653-663 (2011).
  4. Kolb, H. A. Special Issue on Ionic Channels II. Springer. 51-91 (1990).
  5. Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 80, (2), 259-268 (1995).
  6. Frizzell, R. A., Hanrahan, J. W. Physiology of Epithelial Chloride and Fluid Secretion. Cold Spr Harb Pers Med. 2, (6), (2012).
  7. Wong, P. Y. D. CFTR gene and male fertility. Mol Hum Reprod. 4, (2), 107-110 (1998).
  8. Shum, W. W. C., et al. Transepithelial Projections from Basal Cells Are Luminal Sensors in Pseudostratified Epithelia. Cell. 135, (6), 1108-1117 (2008).
  9. Gao, D. Y., et al. Coupling of TRPV6 and TMEM16A in epithelial principal cells of the rat epididymis. J Gen Physiol. 148, (2), 161-182 (2016).
  10. Huang, S. J., et al. Electrophysiological Studies of Anion Secretion in Cultured Human Epididymal Cells. J Physiol. 455, 455-469 (1992).
  11. Chan, H. C., Fu, W. O., Chung, Y. W., Chan, P. S. F., Wong, P. Y. D. An Atp-Activated Cation Conductance in Human Epididymal Cells. Biol Repro. 52, (3), 645-652 (1995).
  12. Cheung, K. H., et al. Cell-cell interaction underlies formation of fluid in the male reproductive tract of the rat. J Gen Physiol. 125, (5), 443-454 (2005).
  13. Pastor-Soler, N., Pietrement, C., Breton, S. Role of acid/base transporters in the male reproductive tract and potential consequences of their malfunction. Physiol. 20, 417-428 (2005).
  14. Evans, A. M., Osipenko, O. N., Haworth, S. G., Gurney, A. M. Resting potentials and potassium currents during development of pulmonary artery smooth muscle cells. Ame J Physiol-Heart Circ Physiol. 275, (3), 887-899 (1998).
  15. Golowasch, J., et al. Membrane Capacitance Measurements Revisited: Dependence of Capacitance Value on Measurement Method in Nonisopotential Neurons. J Neurophysiol. 102, (4), 2161-2175 (2009).
  16. Cole, K. S. Membranes, Ions and Impulses. A Chapter of Classical Biophysics. University of California Press. Berkeley, Calif. (1968).
  17. Lo, C. M., Keese, C. R., Giaever, I. Impedance analysis of MDCK cells measured by electric cell-substrate impedance sensing. Biophys J. 69, 2800-2807 (1995).
  18. Solsona, C., Innocenti, B., Fernandez, J. M. Regulation of exocytotic fusion by cell inflation. Biophys J. 74, (2), 1061-1073 (1998).
  19. Robinson, D. W., Cameron, W. E. Time-dependent changes in input resistance of rat hypoglossal motoneurons associated with whole-cell recording. J Neurophysiol. 83, (5), 3160-3164 (2000).
  20. Sontheimer, H. Neuro Methods: Patch-Clamp Applications and Protocols. Boulton, A. A., Baker, G. B., Walz, W. Humana Press. New Jersey. (1995).
  21. Cheung, Y. M., Hwang, J. C., Wong, P. Y. Epithelial membrane potentials of the epididymis in rats [proceedings]. J Physiol. 263, (2), 280 (1976).
  22. Lybaert, P., et al. KATP channel subunits are expressed in the epididymal epithelium in several mammalian species. Biol Reprod. 79, (2), 253-261 (2008).
خلية كاملة التصحيح المشبك تسجيلات من الخلايا الظهارية الأولية المعزولة من البربخ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, B. L., Gao, D. Y., Zhang, X. X., Shi, S., Shum, W. Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis. J. Vis. Exp. (126), e55700, doi:10.3791/55700 (2017).More

Zhang, B. L., Gao, D. Y., Zhang, X. X., Shi, S., Shum, W. Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis. J. Vis. Exp. (126), e55700, doi:10.3791/55700 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter