Summary

Ganzzellige Patch-Clamp Aufnahmen von isolierten primären Epithelzellen aus dem Epididymis

Published: August 03, 2017
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Summary

Wir präsentieren ein Protokoll, das Zellisolation und Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung kombiniert, um die elektrischen Eigenschaften der primär dissoziierten Epithelzellen aus den Ratten-Cauda-Epididymiden zu messen. Dieses Protokoll erlaubt die Untersuchung der funktionellen Eigenschaften von primären epididymalen Epithelzellen, um die physiologische Rolle des Nebenhodens weiter zu erforschen.

Abstract

Das Nebenhoden ist ein wesentliches Organ für die Spermienreifung und die reproduktive Gesundheit. Das epididymale Epithel besteht aus aufwendig verbundenen Zelltypen, die sich nicht nur in molekularen und morphologischen Merkmalen, sondern auch in physiologischen Eigenschaften unterscheiden. Diese Unterschiede spiegeln ihre vielfältigen Funktionen wider, die zusammen die notwendige Mikroumgebung für die post-testikuläre Spermienentwicklung im epididymalen Lumen bilden. Das Verständnis der biophysikalischen Eigenschaften der epididymalen Epithelzellen ist entscheidend für die Aufdeckung ihrer Funktionen in der Spermien- und Reproduktionsgesundheit, sowohl unter physiologischen als auch pathophysiologischen Zuständen. Während ihre funktionellen Eigenschaften noch nicht vollständig aufgeklärt sind, können die epididymalen Epithelzellen unter Verwendung der Patch-Clamp-Technik, einem Werkzeug zur Messung der zellulären Ereignisse und der Membraneigenschaften einzelner Zellen, untersucht werden. Hier beschreiben wir die Methoden der Zellisolation und der Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung auf meaSicher die elektrischen Eigenschaften der primär dissoziierten Epithelzellen aus der Ratte cauda epididymide.

Introduction

Die Nebenhoden im männlichen Fortpflanzungstrakt sind ein Organ, das mit einer Schicht von Mosaik-Epithelzellen ausgekleidet ist. Wie in anderen Epithelgeweben arbeiten die verschiedenen Zelltypen des epididymalen Epithels, einschließlich der Hauptzellen, klaren Zellen, Basalzellen und Zellen aus den immunologischen und lymphatischen Systemen, in einer konzertierten Weise als Barriere an der Tubulusfront und als die Stützzellen für die Spermienreifung und Physiologie 1 , 2 , 3 . So spielen diese Epithelzellen eine wesentliche Rolle in der reproduktiven Gesundheit.

Epithelzellen werden im Allgemeinen als nicht-erregbare Zellen angesehen, die aufgrund von fehlenden spannungsgesteuerten Na + – oder Ca 2+ -Kanälen 4 , 5 nicht in der Lage sind, All-or-none-Aktionspotentiale als Reaktion auf depolarisierende Stimuli zu erzeugen. Epithelzellen exprimieren jedoch uniQue Sätze von Ionenkanälen und Transportern, die ihre spezialisierten physiologischen Rollen regeln, wie Sekretion und Nährstofftransport 6 . Verschiedene Epithelzellen besitzen daher charakteristische elektrische Eigenschaften. Beispielsweise exprimieren die Hauptzellen die CFTR für den Fluid- und Chloridtransport und exprimieren den TRPV6 für die Calciumreabsorption, während die klaren Zellen die Protonenpumpe V-ATPase zur Luminesäurebildung 1 , 7 , 8 , 9 exprimieren. Manche Transporter und Ionenkanäle, die die physiologischen Merkmale der epididymalen Epithelzellen regulieren, wurden berichtet, aber die funktionellen Eigenschaften von epididymalen Epithelzellen sind weitgehend noch nicht verstanden 10 , 11 , 12 , 13 .

WhOle-Zell-Patch-Clamp-Aufzeichnung ist eine etablierte Technik zur Untersuchung der intrinsischen Eigenschaften sowohl erregbarer als auch nicht erregbarer Zellen und ist besonders hilfreich für die Untersuchung der Funktionen von primär dissoziierten Zellen in heterogenen Zellproben; Die Spannungsklemme dient zur Messung der passiven Membraneigenschaften und der Ionenströme einzelner Zellen 14 , 15 . Die passiven Membraneigenschaften umfassen Eingangswiderstand und Kapazität. Der frühere Parameter gibt die intrinsische Membranleitfähigkeit an, während letzteres die Oberfläche der Zellmembran impliziert (eine Phospholipiddoppelschicht, bei der sich Ionenkanäle und Transporter befinden, die als dünner Isolator dienen, der extrazelluläre und intrazelluläre Medien trennt). Die Membrankapazität ist direkt proportional zur Oberfläche der Zellmembran. Zusammen mit dem Membranwiderstand, der durch den Eingangswiderstand reflektiert wird, ist die Membranzeitkonstante, wWas zeigt, wie schnell das Zellmembranpotential auf den Fluss von Ionenkanalströmen reagiert, kann bestimmt werden. In dieser Hinsicht werden durch die Kombination der Stromansprechcharakteristiken aus einer Reihe von an die Zellen angelegten Spannungsschritten die biophysikalischen Kinetiken und Eigenschaften der Zellen bestimmt 15 , 16 , 17 , 18 .

In der vorliegenden Arbeit beschreiben wir die Verfahren zur Isolierung von Epithelzellen aus dem Ratten-Cauda-Nebenhoden und die Schritte zur Messung der Membraneigenschaften verschiedener Zelltypen in der dissoziierten Zellmischung unter Verwendung der Ganzzell-Patch-Clamp. Wir zeigen, dass die epididymalen Hauptzellen unterschiedliche elektrophysiologische Membranen aufweisen und dass die Leitwerte leicht aus anderen Zelltypen identifiziert werden können.

Protocol

Alle Tierversuche werden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des ShanghaiTech University Institutional Animal Care and Use Committee durchgeführt, die die lokalen und internationalen Anforderungen erfüllen. 1. Experimentelle Tiere Verwenden Sie erwachsene männliche Sprague-Dawley-Ratten (~ 300-450 g) zwischen 8-12 Wochen alt. In diesem Alter bei den Ratten ist das Sperma in den Cauda-Nebenhoden angekommen. 2. Isolierung von Epithelzellen aus…

Representative Results

Das beschriebene enzymatische Aufschlussverfahren für die Isolierung von Epithelzellen aus den Ratten-Cauda-Epididymiden ist ein modifiziertes Protokoll aus unseren bisherigen Studien 9 , 12 . Diese Methode erzeugt eine Mischung von Einzelzellen mit über 90% Lebensfähigkeit und ohne Oberflächenblasen oder gequollenes Zellvolumen. Die heterogene Zellmischung besteht hauptsächlich aus Hauptzellen, klaren Zellen und Basalzellen…

Discussion

In diesem Protokoll führte die enzymatische Dispersion der Ratten-Cauda-Epididymide konsequent zu gesunden Epithelzellen. Die Qualität der epididymalen Epithelzellen für die Patch-Clamp-Experimente hängt von einigen kritischen Schritten im Protokoll ab. Zum Beispiel ist die Zentrifugation der Zellmischung bei einer niedrigen Zentrifugalkraft (30 xg) für die Entfernung der Spermatozoen und des epididymalen Lumeninhalts wichtig; Die epididymalen Epithelzellen werden in Gegenwart der Spermatozoen in der Zellkultur ung…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dr. Christopher Antos für hilfreiche Kommentare zum Text. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Start-up-Finanzierung von ShanghaiTech University verliehen an Winnie Shum und durch die Finanzierung von der National Natural Science Foundation von China (NNSFC Nr. 31471370).

Materials

Instrument of AXON system
Computer controlled amplifier Molecular Devices – Axon Multiclamp 700B patch-clamp amplifier
Digital Acquisition system Molecular Devices – Axon Digidata 1550 converter
Microscope Olympus BX-61WI
Micromanipulator Sutter Instruments MPC-325
Recording chamber and in-line Heater Warner Instruments TC-324C
Instrument of HEKA system
Patch Clamp amplifier Harvard Bioscience – HEKA EPC-10 USB double
Microscope Olympus IX73
Micromanipulator Sutter Instruments MPC-325
Recording chamber and in-line Heater Warner Instruments TC-324C
Other Instrument
Micropipette Puller Sutter Instrument  P-1000
Recording Chamber Warner Instruments RC-26G or homemade chamber
Borosilicate capillary glass with filament Sutter Instrument / Harvard Apparatus BF150-86-10
Vibration isolation table TMC  63544
Digital Camare HAMAMASTU ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU
Reagents for isolation
RPMI 1640 medium Gibco 22400089
Penicillin/Streptomycin Gibca 15140112
IMDM ATCC  30-2005 
IMDM Gibco C12440500BT
Collagenase I Sigma C0130
Collagenase II Sigma C6885
5-α-dihydrotestosterone Medchemexpress HY-A0120
Fetal bovine serum capricorn FBS-12A
Micropipette internal solutions (K+-based solution) (pH 7.2, 280-295 mOsm)
KCl, 35mM Sigma/various V900068
MgCl2 · 6H2O, 2mM Sigma/various M2393
EGTA, 0.1mM Sigma/various E4378
HEPES, 10mM Sigma/various V900477
K-gluconate, 100mM Sigma/various P-1847
Mg-ATP, 3mM Sigma/Various A9187
The standard external recording physiological salt solution (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm)
NaCl, 140mM Sigma/various V900058
KCl, 4.7mM Sigma/various V900068
CaCl2, 2.5mM Sigma/various V900266
MgCl2 · 6H2O, 1.2mM Sigma/various M2393
NaH2PO4, 1.2mM Sigma/various V900060
HEPES, 10mM Sigma/various V900477
Glucose, 10mM Sigma/various V900392
For pH adjustment
NaOH Sigma/various V900797 Purity >=97%
KOH Sigma/various 60371 Purity >=99.99%

References

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Cite This Article
Zhang, B. L., Gao, D. Y., Zhang, X. X., Shi, S., Shum, W. Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis. J. Vis. Exp. (126), e55700, doi:10.3791/55700 (2017).

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