Summary
نحن نقدم بروتوكول لتوليد النسب غضروفية من الدم المحيطي البشري (ي) عن طريق الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة (إيبسس) باستخدام طريقة خالية من التكامل، والتي تشمل تشكيل الجنين (إب)، توسيع الخلايا الليفية، وتحريض غضروفية.
Abstract
في هذه الدراسة، استخدمنا خلايا الدم المحيطي (بك) كخلايا أولية لإنتاج غضروفية عن طريق الخلايا الجذعية المحفزة (إيبسس) المستحثة بطريقة خالية من التكامل. بعد تشكيل الجنين (إب) وتشكيل الخلايا الليفية الخلية، هي التي يسببها إيبسس لتمايز غضروفي لمدة 21 يوما تحت ظروف خالية من المصل وخالية من شينو. بعد تحريض غضروفية، يتم تقييم المظاهر من الخلايا من خلال التحولات المورفولوجية، المناعية، والكيمياء الحيوية، وكذلك من خلال الوقت الكمي في الوقت الحقيقي فحص ير من علامات التمايز غضروفي. الكريات تشوندروجيك تظهر الأزرق أسيان إيجابي والتلوين الأزرق تلطيخ. المناعية من الكولاجين الثاني و X تلطيخ هو أيضا إيجابية. محتوى غليكوسامينوغليكان كبريتات (سغاغ) و علامات التمايز غضروفي كولاجن 2 ( COL2 )، كولاجين 10 ( COL10 )، SOX9 ، أغريغكان هي أوبريغولاتد بشكل كبير في تشوندالكريات روجينيك مقارنة هبسس والخلايا الليفية. وتشير هذه النتائج إلى أن بك يمكن استخدامها كخلايا البذور لتوليد إيبسس لإصلاح الغضاريف، وهو المريض محددة وفعالة من حيث التكلفة.
Introduction
الأنسجة الغضروف لديه قدرة ضعيفة جدا لإصلاح الذاتي وتجديد. وتستخدم التدخلات الجراحية المختلفة والعلاجات البيولوجية لاستعادة الغضروف والوظيفة المشتركة، مع نتائج غير مرضية. التطور الأخير لتكنولوجيا الخلايا الجذعية قد تغير كامل مجال إصلاح الغضروف 1 . وقد تم دراسة الخلايا الجذعية المختلفة كخلايا البذور، ولكن الخلايا الجذعية المحفزة البشرية (هيبسس) يبدو أن الخيار الواعد، لأنها يمكن أن توفر أنواع كثيرة من خلايا المريض محددة دون التسبب في ردود الفعل الرفض 2 . وعلاوة على ذلك، فإنها يمكن التغلب على الطبيعة التكاثري محدود من خلايا الكبار والحفاظ على قدراتهم الذاتية التجديد والقدرات متعددة القدرات. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام استهداف الجينات لتغيير النمط الوراثي للحصول على أنواع محددة من غضروفية.
وقد استخدمت الخلايا الليفية على نطاق واسع لتوليد إيبسس لأن إمكانات إعادة البرمجة الخاصة بهم كما تم دراستها جيدا.ومع ذلك، لا تزال هناك بعض القيود التي يجب التغلب عليها، مثل خزعة مؤلمة من المرضى والحاجة إلى التوسع في المختبر من الخلايا الليفية، والتي قد تؤدي إلى طفرات الجينات 3 . وفي الآونة الأخيرة، تبين أن لجان البرنامج والميزانية مفيدة لإعادة البرمجة 4 ؛ وعلاوة على ذلك، كانت تستخدم عادة وتخزينها بشكل واف. فمن الممكن أنها قد إعادة توجيه التركيز الدراسة من الجلد. ومع ذلك، على حد علمنا، وهناك عدد قليل من التقارير عن إعادة برمجة بك تليها التمايز إلى غضروفية.
في الدراسة الحالية، ونحن نستخدم بك كمصدر بديل عن طريق إعادة برمجة لهم في إيبسس ومن ثم التفريق إيبسس في النسب غضروفية من خلال نظام الاستزراع بيليه من أجل محاكاة تشكيل غضروفية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بروتوكول لتوليد هيبسس من لجان مكافحة الإرهاب يمكن العثور عليها في دراستنا السابقة 5 . تمت الموافقة على الدراسة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لمؤسستنا.
1. تشكيل الجنين (إب) تشكيل
- جعل 50 مل من هيبسك المتوسطة: خروج المغلوب دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (دمم) تستكمل مع 15٪ استبدال المصل المغلوب (كسر)، 5٪ مصل بقري الجنين (فبس)، 1 × الأحماض الأمينية غير الضرورية، 55 ميكرومتر 2 ميركابتويثانول، 2 ملي لتر -جلوتامين، و 8 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (بفغف).
- جعل 50 ملوف إب تشكيل المتوسطة: دمم تستكمل مع 15٪ كسر، 5٪ فبس، 1X الأحماض الأمينية غير الضرورية، 55 ميكرومتر 2-ميركابتويثانول، و 2 ملي الجلوتامين.
- جعل 50 مل من مستنبت القاعدية المتوسطة: دمم تستكمل مع 20٪ فبس، 1 × الأحماض الأمينية غير الضرورية، 55 ميكرومتر 2-ميركابتويثانول، و 2 ملي L- الجلوتامين.
- إعداد 10 مل من محلول ديسباس، 1 ملغ / مل في خروج دموك خروج المغلوب.
- Cultuإعادة هيبسس على 60 ملم الأنسجة ثقافة الأنسجة مع الخلايا المغذية ( أي أحادي الطبقة من الخلايا المشعة الماوس الخلايا الجنينية الجنينية). عندما تكون الخلايا 80-90٪ متموجة، تنأى الخلايا مع ديسباس والمرور هيبسس 1: 3 كل 4-5 أيام. وضع الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ كو 2 حاضنة.
- تشريح المستعمرات هيبسك غير متمايزة إلى قطع أصغر (حوالي 50-100 ميكرون في القطر) باستخدام إبرة الزجاج التي تجرها النار عندما إيبسس 80-90٪ متموجة. عموما، استخدام مستعمرات هيبسك في طبق 60 ملم لتوليد إبس في طبق بتري 100 ملم.
- ثقافة أقل من 100 قطعة صغيرة من المستعمرات في 100 ملم، غير ملتصق طبق بتري تحتوي على 10 مل من إب تشكيل المتوسطة. وضع الأطباق في 37 درجة مئوية و 5٪ كو 2 حاضنة.
- استبدال حوالي 25٪ من الوسط الأولي مع كمية متساوية من وسط الثقافة القاعدية كل يومين. إمالة الطبق للسماح إبس تسوية. إزالة بعناية 3 ملمن الوسط العلوي وإضافة 4 مل من وسط الاستزراع القاعدية الطازجة. لا تزعج إبس.
ملاحظة: وتتميز إبس شكليا من قبل القطع من المستعمرات، مع الأخذ على ظهور جولة مع حدود ناعمة تحت المجهر. - بعد 10 يوما من الثقافة في طبق بيتري غير ملتصقة، معطف 100 ملم جديدة طبق الثقافة الأنسجة مع 4 مل من 0.1٪ الجيلاتين لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
- نقل المتوسطة زائد إبس من 100 ملم، طبق غير ملتصق بتري إلى أنبوب مخروطي 15 مل. السماح للرواسب إبس لمدة 4-5 دقائق. نضح طاف بعناية وترك أقل من 0.5 مل من المتوسطة زائد إبس
- البذور أقل من 100 إبس على 100 ملم، طبق الثقافة الأنسجة المغلفة الجيلاتين مع 10 مل من وسط الثقافة القاعدية. وضع الأطباق في 37 درجة مئوية و 5٪ كو 2 حاضنة.
2. تشكيل خلية بيليه و تشوندروسيت التمايز
- جعل 10 مل من 0.25٪ التربسين / إثيلينديامينيتتراسيتيك حمض (إدتا). جعل 80 مل من بسوسط الثقافة: دمم تستكمل مع 20٪ فبس، 1X الأحماض الأمينية غير الضرورية، 55 ميكرومتر 2-ميركابتويثانول، و 2 ملي L- الجلوتامين.
- جعل 10 مل من وسط التمايز غضروفي: دمم (الجلوكوز عالية) تستكمل مع 10٪ الانسولين-ترانسفرين-السيلينيوم حل (إيتس)، 0.1 ميكرومتر ديكساميثازون، 1 ملي حمض الاسكوربيك، 1٪ البيروفات الصوديوم، و 10 نانوغرام / مل تحويل عامل النمو- بيتا 1 (تغف-β1).
- تحديث المتوسطة مع 10 مل من مستنبت القاعدية المتوسطة بعد 48 ساعة. بعد ذلك، تحديث وسط كل ثلاثة أيام مع 10 مل من وسط الثقافة القاعدية.
ملاحظة: بعد 10 يوما في الثقافة، وينبغي أن توسع الخلايا الليفية الليفية من إبس.- معطف أطباق 100 ملم مع 4 مل من 0.1٪ الجيلاتين لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. تجاهل طاف الخلية وغسل الخلايا مع دولبيكو الفوسفات مخزنة المالحة (دبس) مرة واحدة.
- هضم الخلايا مع 3 مل من التربسين 0.25٪ / إدتا عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وتحييد مع 4 ملتر من وسط الثقافة القاعدية.
- فصل الخلايا في خلايا واحدة عن طريق بيبتينغ صعودا وهبوطا 5-10 مرات وتمريرها من خلال شبكة النايلون 70 ميكرون. أجهزة الطرد المركزي تعليق خلية في 200 x ج لمدة 5 دقائق. إعادة البذور الخلايا على 100 ملم جديدة، طبق الثقافة الأنسجة المغلفة الجيلاتين مع 10 مل من وسط الثقافة القاعدية.
- تحديث المتوسطة مع 10 مل من مستنبت القاعدية المتوسطة بعد 48 ساعة. بعد ذلك، تحديث وسط كل ثلاثة أيام مع 10 مل من وسط الثقافة القاعدية.
ملاحظة: الخلايا الحصول على متجانسة، الليفية تشبه التشكل. - عندما يتم التوصل ~ 90-100٪ التقاء ( أي حوالي 5-7 أيام)، وحصاد الخلايا مع 3 مل من التربسين 0.25٪ / إدتا عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تحييد مع 4 مل من وسط الثقافة القاعدية. فصل الخلايا في خلايا واحدة عن طريق بيبتينغ صعودا وهبوطا 5 مرات. استخدام عدادة الكريات لحساب عدد الخلايا.
- ضع 3 × 10 5 خلايا في أنبوب البولي بروبلين 15 مل. أجهزة الطرد المركزي في 200 x جلمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (رت). إعادة تعليق الخلايا في 1 مل من التمايز غضروفية المتوسطة.
- إعادة الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 3 دقائق والحفاظ على الخلايا في شكل بيليه صغيرة. وضع أنبوب في 37 درجة مئوية و 5٪ كو 2 حاضنة لمدة 21 يوما. ال تقم برغي الغطاء بإحكام، والسماح بتبادل الغاز.
- استبدال 3/4 من الوسط الثقافي كل ثلاثة أيام مع المتوسطة التمايز غضروفية جديدة.
ملاحظة: بعد 21 يوما في الثقافة، هيبسك الكريات تشوندروجينيك (هيبسك-تشون) يجب أن تكون قد شكلت. يتم جمع الخلايا الجذعية الوسيطة الإنسان (مسس)، كما السيطرة الإيجابية، وتربيتها في وسط التمايز غضروفية لمدة 21 يوما لتشكيل الكريات تشوندروجيك (همسك-تشون).
3. تحليل التمايز تشوندروجينيك
- إعداد 10 مل من 10٪ محايد الفورمالين مخزنة.
- إعداد 50 مل من 0.1٪ الكسيان الأزرق الكاشف و 50 مل من 1٪ الكاشف الأزرق تولويدين.
- العلاقات العامةإبار 1 مل من الأجسام المضادة الأولية: الأجسام المضادة الأرنب بولكلونل ضد الكولاجين الثاني (1:50) أو الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الماوس ضد الكولاجين X (1:50). أيضا، وإعداد المضادة للأرنب أو الماوس الأجسام المضادة الثانوية.
- جعل 1 مل من محلول غراء: 10 U / مل في برنامج تلفزيوني مع 0.1 M خلات الصوديوم، 2.4 ملي إدتا، و 5 ملي L- السيستين.
- جعل 100 مل ثنائي ميثيل ميثيلين الأزرق (دمب) حل صبغ: 100 ميكرولتر من 16 ملغ / لتر 1،9-ثنائي ميثيل ميثيلين الأزرق، 40 ملي جليكاين، 40 ملي كلوريد الصوديوم، و 9.5 ملي حمض الهيدروكلوريك. الرقم الهيدروجيني 3.0.
- تقييم التمايز غضروفية من قبل ألسيان الأزرق والبقع الزرقاء التولويدين من أقسام بيليه.
- إصلاح واحد هيبك-تشون بيليه أو همسك-تشون بيليه في 1 مل من 10٪ محايد الفورمالين مخزنة لمدة 24 ساعة.
- نقل بيليه إلى 1 مل من الإيثانول 70٪ في H 2 O. يذوى بيليه مع 1 مل من سلسلة الايثانول متدرج ( أي 25، 50، 75، 90، 95، 100، و 100٪، 3 دقائق لكل منهما).
- توضيح بيليه في 1 مل من 100٪ زيلين ثلاث مرات. Infiltratه بيليه مع البارافين لمدة 1 ساعة في فرن 65 درجة مئوية. تضمين بيليه في كتل البارافين مع 7 × 7 × 5 مم 3 العفن الأساسي، بعد الإجراءات النسيجية الروتينية 6 .
- جعل الأقسام المجاورة بواسطة مشراح مع سمك ما يقرب من 4 ميكرون 7 . التمسك المقاطع على الشرائح الزجاجية.
- تجفيف الشرائح لمدة 2 ساعة عند 60 درجة مئوية في الفرن. ديبارافينيز المقاطع في ثلاث دورات (3 دقائق لكل منهما) باستخدام 100٪ زيلين.
- استخدام سلسلة الكحول المتناقص للإماهة ( أي 100، 100، 95، 95، 70، 50، و 25٪ في H 2 O، 3 دقيقة لكل منهما) ومن ثم إجراء شطف النهائي مع الماء منزوع الأيونات لمدة 5 دقائق.
- وصمة عار المقاطع مع الكاشف الأزرق أسيان 0.1٪ أو 1٪ تلوين الأزرق تلطيخ لمدة 4-5 ح ثم شطف لهم بالماء المقطر.
- يذوى مع سلسلة الايثانول متدرج ( أي 25، 50، 75، 90، 95، 100، و 100٪، 3 دقائق لكل منهما) تليها ثلاثة متتالية ستإبس من التوضيح في 100٪ زيلين. جبل الشرائح وتصور لهم تحت المجهر.
- أداء المناعية.
ملاحظة: يتم تقييم مزيد من أقسام بيليه إضافية من قبل المناعية.- بعد ديبارافينيزاتيون والإماهة، وجلب الشرائح ليغلي في 1 ملي إدتا، ودرجة الحموضة 8.0 (ماء في الماء المغلي من قبل الأوتوكلاف). السماح لهم الجلوس لمدة 8 دقائق في درجة حرارة الغليان ثم السماح للشرائح لتبرد في رت.
- شطف الشرائح مع الماء منزوع الأيونات 3 مرات. احتضان الأقسام في 3٪ H 2 O 2 الحل في الميثانول في رت لمدة 15 دقيقة لمنع النشاط البيروكسيداز الذاتية.
- شطف الشرائح مع الماء منزوع الأيونات وتزجها في دبس لمدة 5 دقائق. تطبيق 50-100 ميكرولتر من المخفف بشكل مناسب (1:50) الأجسام المضادة الأولية للأقسام على الشرائح ومن ثم احتضان لهم في غرفة ترطيب في رت لمدة 1 ساعة.
- غسل الشرائح 3 مرات (5 دقائق لكل منهما) مع دبس. احتضان ساينضج مع الأجسام المضادة الثانوية المقابلة ( أي مكافحة الأرنب أو الماوس) لمدة 15 دقيقة في رت.
- غسل الشرائح 3 مرات (لمدة 5 دقائق لكل منهما) مع دبس. أداء الكشف داب تحت المجهر.
- غسل الشرائح مع دبس 3 مرات (2 دقيقة لكل منهما). كونتيرستين النوى الخلية عن طريق غمر الشرائح في الهيماتوكسيلين لمدة 1-2 دقيقة. يذوى مع سلسلة الايثانول متدرج (25، 50، 75، 90، 95، 100، و 100٪، 3 دقائق لكل منهما) تليها ثلاث خطوات متتالية من التوضيح مع الزيلين. أخيرا، جبل الشرائح وتصور لهم تحت المجهر.
- اكتشاف محتوى سغاغ.
- هضم كريات تشوندروجينيك في حل غراء في 60 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
- تحديد محتوى الحمض النووي باستخدام عدة فحص دسدنا ونظام الفلورومتر. قياس محتوى سغاغ عن طريق مزجها مع دمب حل صبغ تحت قياس الامتصاصية في 525 نانومتر 8 .
- حساب تركيز سغاغ ضد منحنى القياسيةسمك القرش شوندروتن كبريتات.
- إجراء تحليل ير في الوقت الحقيقي من علامات التمايز غضروفية في الكريات هيبسك-تشون.
- حصاد 3-4 من الكريات تشوندروجينيك بإضافة 500 ميكرولتر من كاشف استخراج الجليد الباردة إلى أنبوب واحد. دوامة تماما. احتضان عينة لمدة 5 دقائق في رت.
- إضافة 0.1 مل من الكلوروفورم. دوامة العينة لمدة 15 ثانية واحتضان ذلك في رت لمدة 3 دقائق. الطرد المركزي العينة لمدة 15 دقيقة في 12000 x ج و 4 درجة مئوية. نقل المرحلة المائية العليا (حوالي 250 ميكرولتر) إلى أنبوب ميكروسنتريفوج 1.5 مل جديد.
- إضافة 25 ميكرولتر من خلات الصوديوم و 1 ميكرولتر من الجليكوجين إلى العينة. يعجل الحمض النووي الريبي عن طريق مزجها مع 250 ميكرولتر من الكحول الآيزوبروبيل. تخلط جيدا. احتضان العينة في رت لمدة 10 دقيقة.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 12000 x ج و 4 درجة مئوية. إزالة طاف تماما. غسل بيليه رنا مرتين مع 500 ميكرولتر من الايثانول 75٪.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائقفي 7500 x ج و 4 درجة مئوية. إزالة كل الإيثانول بقايا والهواء الجاف بيليه رنا لمدة 5-10 دقيقة. حل الحمض النووي الريبي في 10 ميكرولتر من نوكليس خالية من المياه.
- تحويل الحمض النووي الريبي إلى [كدنا] باستخدام نظام النسخ العكسي. موضوع عينات [كدنا] في الوقت الحقيقي ير باستخدام قر عدة مزيج الرئيسي (2X) ونظام الوقت الحقيقي ير 9 .
ملاحظة: تسلسل التمهيدي هي:
(ح) أغريكان -F: تغاغاغغغك؛
h أغريكان -R: تغاغتاغتغتاغاغا؛
h β-أكتين -F: تغاتغاتغاكتكتكسك؛
h β-أكتين -R: غتكتكاغتاغتاغتاغك؛
h COL2 -F: تغغاتكاغغاسك؛
h COL2 -R: غتكغاتغتكتكاتكت؛
h SOX9 -F: أغغاسكاكاتكاغاك؛
h SOX9 -R: كتغاتغكتغتغ؛
h COL10 -F: أتغككاكاتاككت؛
h COL10 -R: غتاغتغكتتكتكت.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تشوندروجينيك التمايز من هيبسس:
تم استخدام وسط تشكيل إب ووسط الثقافة القاعدية للتمييز بين هيبس في النسب الوسيطة. تم استخدام طريقة ثقافة متعددة الخطوات ( الشكل 1 ). أولا، كانت متباينة هبسك عفوية عن طريق تشكيل إب لمدة 10 يوما (D10؛ الشكل 2A ). ثانيا، انسحبت الخلايا من إبس لمدة 10 أيام أخرى (D10 + 10). خلال هاتين الخطوتين، إيبسس فقدت تدريجيا مورفولوجيز الأصلي والحصول على مورفولوجيز المغزل على شكل ( الشكل 2B )، والتي تغيرت بعد ذلك إلى شكل الليفية بعد مرور. ثالثا، تم توسيع الخلايا في أحادي الطبقة بعد الثقافة الفرعية ( الشكل 2C ). واستبعدت الخلايا المتبقية غير المتمايزة خلال هذه الخطوة. ثم، تم توسيع الخلايا والالتزام الخلايا الليفية مثل الخلايا بعد5-7 أيام في الثقافة أحادي الطبقة (D10 + 10 + 7). رابعا، عندما وصلت خلايا هبسك-الليفية تشبه (هيبسك-F) حوالي التقاء 90٪، تم تحريضهم للتمييز في غضروفية عن طريق ثقافة بيليه 3D ( الشكل 2D ) 10 .
توصيف الكريات هيبك-تشون:
تم استزراع هيبسك-F في 15 مل أنابيب البولي بروبيلين في بيليه لمدة 21 يوما. قد تجمع الخلايا الغضروفية في المختبر وتنتج مصفوفة خارج الخلية مميزة عندما تكون في ثقافة عالية الكثافة. في نهاية الثقافة، يمكننا أن نرى كتلة كثيفة الغضاريف، وبيليه هيبسك-تشون، والتي كانت تصل إلى 2-3 ملم طويلة و 3 مم ( الشكل 2D ). كانت الخلايا إيجابية ل أسيان الأزرق ( الشكل 3A ) والتولويدين الأزرق ( الشكل 3B ) تلطيخ، والتي أشارت إلى نجاحأول تمايز غضروفي من الكريات هيبسك. تحليل المناعية للكولاجين الثاني ( الشكل 3C ) والكولاجين X ( الشكل 3D ) أثبتت أيضا أن الكريات هيبسك-تشون قد وضعت النمط الظاهري تشبه خلية الغضروفية. تم إجراء ضوابط سلبية من المناعية للكولاجين الثاني والكولاجين X لإثبات أفضل تلطيخ إيجابي (لا تظهر البيانات) 5 .
تم إجراء تحليل سغاغ أيضا بعد التمايز غضروفي ( الشكل 3E ). تم الكشف عن محتويات سغاغ في حبيبات هيبك-تشون، هيبسك-F، إبس، و هيبسس غير متمايزة. تم تعديل محتوى سغاغ بشكل ملحوظ في حبيبات هيبك-تشون مقارنة بالمجموعات الأخرى ( P <0.05). في السيطرة الإيجابية من همسك-تشون، كما تم تنظيم محتوى سغاغ بشكل ملحوظ ( P <0.05) مقارنة همسس. ومع ذلك، محتويات سغاغبين الكريات همسك والكريات هيبسك-تشون أظهرت أي فرق ( P > 0.05).
التعبير الجيني من التمايز غضروفية علامات:
تم استخدام التعبير الجيني للعلامات التمايز للنسيج شوندرو السلف السلف ( SOX9 و COL2 ) و غوندروسيتس متباينة تماما ( أغريكان و COL10 ) لتوصيف النمط الظاهري من الكريات غضروفية ( الشكل 4 ). في مقارنات بين هبسك، هيبسك-F، و هيبسك-تشون الكريات، تعبيرات COL2 ، COL10 ، SOX9 ، أغريكان تم تنظيمها بشكل كبير في هيبسك-تشون من المجموعات الأخرى ( P <0.05). في السيطرة الإيجابية من همسك-تشون، كان التعبير عن هذه العلامات أيضا أوبريغولاتد بشكل كبير من همسكس ( P <0.05). ومع ذلك، فإن التعبير الجيني بين همسC الكريات و هيبك-تشون الكريات أظهرت أي اختلافات ( P > 0.05). في كل شيء، هذه النتائج تشير إلى نجاح عملية التمايز غضروفية من إيبسس الإنسان.
الشكل 1: نظرة تخطيطية للبروتوكول. طريقة متعددة الخطوات ثقافة تستخدم لتمييز إيبسس الإنسان في غضروفية، بما في ذلك : 1) التمايز عفوية عن طريق تشكيل إب، 2) نمو الخلية من إبس، 3) ثقافة الخلية أحادي الطبقة بعد الثقافة الفرعية، و 4) 3D بيليه الثقافة. يتم تقييم النمط الظاهري خلية غضروفية عن طريق التحليل النسيجي، والتحليل البيوكيميائي، والتعبير الجيني غضروفي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: توصيف الكريات هيبسك-تشون. ( A ) تلطيخ ألسيان الأزرق و ( B ) تلوين الأزرق تلطيخ من غليكوسامينوغليكانز و بروتيوglycans. شريط مقياس = 100 ميكرون. ( C و D ) المناعية للكولاجين الثاني والكولاجين X. شريط مقياس = 100 ميكرون. ( E ) توصيف البيوكيميائية للكريات هيبسك-تشون مقابل هيبس، إبس، و هيبسك-F مقارنة مع همسك-تشون مقابل همسس. سغاغ في الحمض النووي. يمثل شريط المتوسط ± سيم. N = 3، P <0.05. وقد تم تعديل هذا الرقم من دراستنا السابقة 5 . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحليل التعبير الجيني. رت-قر تحليل التعبير الجيني من علامات التمايز غضروفية ( COL2 ، COL10 ، SOX9 ، أغريكان ) في هيبسك-تشون مقابل هيبسس و هيبسسف مقارنة مع همسك-تشون مقابل همسس. يمثل شريط المتوسط ± سيم. N = 3، P <0.05. وقد تم تعديل هذا الرقم من دراستنا السابقة 5 . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، ونحن نقدم بروتوكول لتوليد غضروفية من بك عبر إيبسس. لأن بك هي أكثر شيوعا وتستخدم على نطاق واسع في المجال السريري، فهي تعرض كبديل محتمل لإعادة البرمجة. في هذه الدراسة، تم استخدام ناقلات عرضية (إيف) لإعادة برمجة بك في إيبسس، وفقا للطريقة التي وضعتها تشانغ وآخرون. 11 - هذا النهج الخالي من التكامل لا ينطوي على دمج الجينات المرتبطة بالفيروس، والذي يعتقد أن يكون لها تأثير واسع في المجال السريري 12 ، 13 . وقد تم استيفاء كفاءة إعادة برمجة توليد الخلايا الجذعية المتطايرة (إيبسس) الخالية من التكامل من خلايا الدم في هذه الدراسة. أكثر من 30 إيبسس يمكن أن تنتج من 2 مل من الدم المحيطي. ولذلك، فإن بك لديها القدرة على أن تكون خلايا البذور المستخدمة لتوليد إيبسس لغضروف الهندسة والتطبيقات السريرية الأخرى.
الخطوات الرئيسية من تشوندروجيك ديفيرنتياتيون من هيبسس شملت: تشكيل إب، ونمو الخلية من إبس، ثقافة أحادي الطبقة، وثقافة بيليه 3D. يتم تشريح مستعمرات هيبسك غير متمايزة إلى قطع أصغر باستخدام إبرة الزجاج التي تجرها النار. الطريقة الميكانيكية، على الرغم من أن أكثر تقنية، هو أفضل من الهضم الأنزيمي (مثل ديسباس أو كولاجيناز) بسبب الأضرار المخفضة وحجم محدد (50 - 100 ميكرون في القطر) عند الاستحواذ. وعلاوة على ذلك، يمكن للهضم الميكانيكي التخلص يدويا من الخلايا المغذية، والتي سوف قمع التمايز هيبسك. هيبسكس تفرقيا عفوية لتشكيل إبس، والتي تتميز بأنها المجاميع ثلاثية، متعددة الخلوية مع حدود ناعمة. يمكن لعدة إبس تجميع معا لتشكيل الأشكال غير النظامية. من أجل الحفاظ على إبس في ظروف جيدة، يتم استزراع أقل من 100 إبس في 100 ملم، طبق غير ملتصق بتري، مع 10 مل من وسط تشكيل إب. ويعتقد أن حوالي 50 إبس في واحد 100 مم طبق ليكون أفضل تركيز. ثم يتم تصنيف إبس على إلى 10 سم، والأطباق المغلفة الجيلاتين مع وسط الثقافة القاعدية. كثافة توزيع إبس مهم لنمو كاف من إبس. يتم استزراع أقل من 100 إبس على طبق 100 ملم. في غضون 10 أيام من الثقافة، وخلايا الليفية تدريجيا يتم تجاوزها وتوسيعها من إبس. يتم تنفيذ خطوة أحادي الطبقة لاستبعاد الخلايا غير متمايزة المتبقية الموجودة في إبس، وكذلك لتوسيع الخلايا الملتزمة النسب الوسيطة. يتم فرز البذور 0.5-1 × 10 6 في طبق 100 ملم للثقافة الخلية أحادي الطبقة. تم تحليل التعبير عن علامات سطح الخلية على هيبسك-F عن طريق تحليل التدفق الخلوي في دراستنا السابقة 5 . وأظهرت النتائج أن غالبية هيبسك-F أعرب CD73 (81.81 ± 2.05٪) و CD105 (إندوغلين، 81.90 ± 1.61٪)، والتي من المعروف أن تكون علامات الوسيطة الإنسان إيجابية. وعلاوة على ذلك، استخدمت ستة إيبسس مختلفة وخلايا جذعية جنينية واحدة الإنسان (إيسك) لإعادة إنتاج هذه الأساليب.
في هذه الحالة، تم استخدام الوسط الغضروفي الكلاسيكي من أجل تحريض غضروف الغضروف من ال هبسس، حيث يتم استخلاص تغف-beta1 و ديكساميثازون في وسط استزراع الكريات، وقد ثبت أن يكون لها تأثير كبير على القدرات المحتملة غضروفية 14. كان هناك فرق آخر من البروتوكولات الأخرى تركيز 10٪ إيتس، وهو أعلى بكثير من 1٪ إيتس 15 ٪ ، 16 ٪ 1٪ إيتس بالإضافة إلى 10٪ فبس المعززة تشكيل الغضاريف في أساليب أخرى 17 ، 18. إيتس كبديل المصل يمكن أن تعزز انتشار غضروفي وتشكيل والاحتفاظ الظواهر غضروفية.من أجل استبدال المكونات الحيوانية من فبس، قمنا بترقية تركيز إيتس إلى 10٪، والتي ثبت إلى الترويجي بكفاءةتي غضروفية التمايز 7 .وتعد زراعة الخلايا ذات الكثافة السكانية العالية عاملا أساسيا آخر للتمايز الغضروفي. هناك العديد من أساليب زراعة الخلايا الأخرى التي يمكن استخدامها للحث على التمايز غضروفية، مثل ثقافة ميكروماس، والثقافة المشتركة مع خلايا أخرى، والثقافة القائمة على المواد البيولوجية، والتلاعب الجيني 1 ، 19 ، 15 . ثقافة بيليه 3D في دراستنا، مما يؤدي إلى كثافة الخلايا العالية وتفاعل الخلايا الخلوية عالية، هو أسهل لأداء دون خلايا أو مواد أخرى. منذ يتم تنفيذها في أنابيب الطرد المركزي 15 مل، واحد الحد هو أنه يمكن أن تستخدم إلا في مقايسة التمايز غضروفية على نطاق صغير. ومع ذلك، يمكن استخدام لوحات 96-جيدا مع قيعان مستديرة كبديل واعد 7 . لذلك، تحسين آخر إلى أساليب الثقافة يمكن أن تعزز كفاءة تشوندروجينيكالتمايز في المختبر . في دراستنا، تم إجراء تحريض غضروفي لمدة تصل إلى 21 يوما في ظل خالية من المصل وحالة خالية من شينو، والتي تمت خلالها إزالة جميع العناصر المرتبطة بالحيوان. لذلك، فإن الإجراء في دراستنا قابل للتكيف للتطبيقات السريرية في المستقبل.
ويعتقد أن الخلايا الجذعية ذاتيا سوف يكون الخيار المثالي لإصلاح الغضروف، لأنها قد لا تقلل فقط الرفض، ولكن أيضا تحقيق تجديد الأنسجة من خلال الاستفادة من المسار الطبيعي للتنمية الجنينية 20 ، 21 . ومع ذلك، وجد أن لديهم إمكانات التكاثري محدودة في المختبر 22 . ولذلك، فإن طريقة خالية من التكامل لتوليد غضروفية من بك عبر إيبسس قد يكون نهجا واعدا أكثر للهندسة الغضاريف الأنسجة. مع طريقتنا، 2 مل من الدم يمكن أن يكون كافيا للحث على غضروفية المريض محددة اللازمة لتغضروف الغضاريفالخبر. وعلاوة على ذلك، ونحن أيضا استخدام همسكس كسيطرة إيجابية للمقارنة مع خلايا متباينة من إيبسس، مما يشير إلى أن إيبسس لديها إمكانات التمايز غضروفي جيدة.
في الختام، أثبتت هذه الدراسة أن بك يمكن استخدامها كمرشحين لتجدد غضروفي. وهذا يمكن أن يعكس كذلك الاتجاه المستقبلي لتوليد خلايا البذور لإصلاح الغضروف في نهج المريض محددة وفعالة من حيث التكلفة للطب التجديدي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
ويود المؤلفون أن يشكروا زياوبين تشانغ على البلازميد. كما نشكر شاورونغ قاو وكيانفي وانغ على مساعدتهم الكريمة خلال التجربة. ويدعم هذه الدراسة من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية في الصين (No.81101346، 81271963، 81100331)، ومشروع بكين 215 المواهب رفيعة المستوى (No.2014-3-025)، وصندوق بكين تشاو يانغ مستشفى (لا (سيكس-2017-01)، وجمعية تشجيع الابتكار الشبابية للأكاديمية الصينية للعلوم (يل).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829018 | Basal medium used for hiPSC culture and EB formation medium |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Invitrogen | 10828028 | A more defined, FBS-free medium supplement used for hiPSC culture and EB formation medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | sh30070.03 | Used for hiPSC culture and EB formation medium,offers excellent value for cell culture |
| Nonessential amino acids | Chemicon | TMS-001-C | Used as a growth supplement in all the cell culture medium, to increase cell growth and viability |
| L-glutamine | Invitrogen | TMS-002-C | An amino acid required for cell culture |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B | A cytokine used for sustaining the pluripotency and self-renewal of hiPSCs |
| Dispase | Invitrogen | 17105041 | Used for hiPSC dissociation for subculture |
| DMEM | Gibco | C11960 | Basal medium used for MSC culture medium |
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | Used for cell attachment onto the dishes |
| 0.25% trypsin/EDTA | Gibco | 25200072 | Used for cell dissociation |
| DPBS | Gibco | 14190250 | A balanced salt solution used for cell wash or reagent preparing |
| 2-mercaptoethanol | invitrogen | 21985023 | Used as a growth supplement in all the cell culture medium. |
| ITS | invitrogen | 41400045 | Insulin, Transferrin, Selenium Solution.Used for chondrogenic differentiation. |
| Ascorbic acid | Sigma | 4403 | Known as vitamin C. It helps in active growth and has antioxidant property. |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | Added to cell culture medium as an energy source in addition to glucose. |
| Transforming growth factor-beta 1 | Peprotech | AF-100-21C | A cytokine that regulate cell proliferation, growth and chondrogenic differentiation. |
| Rabbit polyclonal antibodies against Collagen II | Abcam | ab34712 | This antibody reacts with Type II collagens,which is specific for cartilaginous tissues. |
| Mouse monoclonal antibodies to Collagen X | Abcam | ab49945 | This antibody reacts with Type X collagen,which is a product of hyperthrophic chondrotocytes. |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | For mounting and long-term storage of slides |
| Toluidine blue | Sigma | 89640 | Used for proteoglycans detection. |
| Alcian blue | Amresco | #0298 | Used for glucosaminoglycans detection. |
| Papain | Sigma | P4762-25MG | Used to digest chondrogenic pellets. |
| Dimethylmethylene blue | Sigma | 341088-1G | Used to quantitate glycosaminoglyans |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma | C4384-250MG | Used to draw the standard curve for sGAG content measurement. |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 (100) | Used to determine DNA content |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | Used for RNA isolation from cells |
| Reverse Transcriptase System | Promega | A3500 | Used to convert RNA into cDNA |
| SYBR FAST qPCR kit Master Mix | Kapa | KK4601 | Used for Real-time PCR |
References
- Diekman, B. O., et al. Cartilage tissue engineering using differentiated and purified induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (47), 19172-19177 (2012).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Loh, Y. H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood. Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).
- Zhang, X. B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (5), 264-274 (2013).
- Li, Y., et al. Reprogramming of blood cells into induced pluripotent stem cells as a new cell source for cartilage repair. Stem Cell Res Ther. 7 (31), (2016).
- Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods Enzymol. 533, 225-233 (2013).
- Solchaga, L. A., Penick, K. J., Welter, J. F. Chondrogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells: tips and tricks. Methods Mol Biol. 698, 253-278 (2011).
- Oldershaw, R. A., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells toward chondrocytes. Nat Biotechnol. 28 (11), 1187-1194 (2010).
- Monje, L., Varayoud, J., Luque, E. H., Ramos, J. G. Neonatal exposure to bisphenol A modifies the abundance of estrogen receptor alpha transcripts with alternative 5'-untranslated regions in the female rat preoptic area. J Endocrinol. 194 (1), 201-212 (2007).
- Teramura, T., et al. Induction of mesenchymal progenitor cells with chondrogenic property from mouse-induced pluripotent stem cells. Cell Reprogram. 12 (3), 249-261 (2010).
- Su, R. J., et al. Efficient generation of integration-free ips cells from human adult peripheral blood using BCL-XL together with Yamanaka factors. PLoS One. 8 (5), e64496 (2013).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 588-598 (2011).
- Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31 (3), 458-466 (2013).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
- Qu, C., et al. Chondrogenic differentiation of human pluripotent stem cells in chondrocyte co-culture. Int J Biochem Cell Biol. 45 (8), 1802-1812 (2013).
- Guzzo, R. M., Gibson, J., Xu, R. H., Lee, F. Y., Drissi, H. Efficient differentiation of human iPSC-derived mesenchymal stem cells to chondroprogenitor cells. J Cell Biochem. 114 (2), 480-490 (2013).
- Koyama, N., et al. Human induced pluripotent stem cells differentiated into chondrogenic lineage via generation of mesenchymal progenitor cells. Stem Cells Dev. 22 (1), 102-113 (2013).
- Liu, X., et al. Role of insulin-transferrin-selenium in auricular chondrocyte proliferation and engineered cartilage formation in vitro. Int J Mol Sci. 15 (1), 1525-1537 (2014).
- Guzzo, R. M., Scanlon, V., Sanjay, A., Xu, R. H., Drissi, H. Establishment of human cell type-specific iPS cells with enhanced chondrogenic potential. Stem Cell Rev. 10 (6), 820-829 (2014).
- Goepfert, C., Slobodianski, A., Schilling, A. F., Adamietz, P., Portner, R. Cartilage engineering from mesenchymal stem cells. Adv Biochem Eng Biotechnol. 123, 163-200 (2010).
- Ingber, D. E., et al. Tissue engineering and developmental biology: going biomimetic. Tissue Eng. 12 (12), 3265-3283 (2006).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
