Summary
Presentiamo un protocollo per generare una linea condrogenica dal sangue periferico umano (PB) attraverso cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) utilizzando un metodo senza integrazione, che comprende la formazione del corpo embrionale (EB), l'espansione delle cellule fibroblasiche e l'induzione condrogenica.
Abstract
In questo studio abbiamo utilizzato le cellule del sangue periferico (PBCs) come cellule di sementi per produrre condrociti attraverso cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) in un metodo senza integrazione. A seguito della formazione del corpo embrionale (EB) e dell'espansione cellulare fibroblastica, iPSCs sono indotti per la differenziazione condrogenica per 21 giorni in condizioni prive di siero e privo di xeno. Dopo l'induzione di condrociti, i fenotipi delle cellule sono valutati mediante analisi morfologiche, immunohistochemiche e biochimiche, nonché con l'esame quantitativo in tempo reale PCR di marcatori di differenziazione condrogenica. I pellet condondensivi mostrano una colorazione blu positiva e blu toluidina. L'immunohistochemistry della colorazione dei collagene II e X è anche positivo. Il contenuto di glicosaminoglicano solfato (sGAG) ei marcatori di differenziazione condrogenici COLLAGEN 2 ( COL2 ), COLLAGEN 10 ( COL10 ), SOX9 e AGGRECAN sono notevolmente aumentati nella condizionePellicole rogeniche rispetto a hiPSC e cellule fibroblastiche. Questi risultati suggeriscono che i PBC possono essere utilizzati come cellule di sementi per generare iPSC per la riparazione della cartilagine, che è specifica del paziente e conveniente.
Introduction
Il tessuto cartilagineo ha una capacità molto scarsa per l'auto-riparazione e la rigenerazione. Sono stati utilizzati diversi interventi chirurgici e trattamenti biologici per ripristinare la funzionalità della cartilagine e delle articolazioni, con risultati insoddisfacenti. Il recente sviluppo della tecnologia delle cellule staminali può cambiare l'intero campo di riparazione della cartilagine 1 . Diverse cellule staminali sono state studiate come cellule di sementi, ma le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSCs) sembrano essere la scelta più promettente in quanto possono fornire molti tipi di cellule specifiche del paziente senza causare reazioni di reiezione 2 . Inoltre, possono superare la limitata natura proliferativa delle cellule adulte e mantenere le proprie capacità di auto-rinnovamento e pluripotenti. Inoltre, il targeting genico può essere utilizzato per cambiare il genotipo per ottenere tipi specifici di condrociti.
I fibroblasti sono stati ampiamente usati per generare iPSC perché i loro potenziamenti di riprogrammazione sono stati anche studiati bene.Tuttavia, ci sono ancora alcune limitazioni che devono essere superate, come la dolorosa biopsia dei pazienti e la necessità di espansione in vitro dei fibroblasti, che possono portare a mutazioni genetiche 3 . Recentemente, i PBC sono stati trovati vantaggiosi per la riprogrammazione 4 ; Inoltre, sono stati comunemente utilizzati e abbondantemente memorizzati. È possibile che possano reindirizzare la messa a fuoco dello studio dalla pelle. Tuttavia, al meglio delle nostre conoscenze, ci sono poche relazioni sulla riprogrammazione del PBC seguito dalla differenziazione nei condrociti.
Nello studio in corso, utilizziamo PBC come fonte alternativa riprogrammandoli in iPSC e poi differenziando iPSC nel linfondaggio genetico attraverso un sistema di coltura di pellet per imitare la formazione di condrociti.
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Protocol
Il protocollo per la generazione di hiPSC da PBC può essere trovato nel nostro precedente studio 5 . Lo studio è stato approvato dal consiglio di revisione istituzionale della nostra istituzione.
1. Formazione del corpo embrionale (EB)
- Realizzare 50 ml di mezzo hiPSC: Knockout Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) completato con una sostituzione del siero del 15% (KSR), 5% siero fetale bovino (FBS), 1 x amminoacidi non essenziali, 55 μM 2-mercaptoetanolo, 2 mM L -glutamina e 8 ng / mL di fattore di crescita di fibroblasti di base (bFGF).
- Realizzare 50 mLof EB media di formazione: DMEM integrato con 15% KSR, 5% FBS, 1x aminoacidi non essenziali, 55 μM 2-mercaptoetanolo e 2 mM L-glutammina.
- Preparare 50 ml di substrato di coltura basale: DMEM integrato con 20% FBS, 1 amminoacido non essenziale, 55 μM 2-mercaptoetanolo e 2 mM L-glutammina.
- Preparare 10 mL di soluzione di dispersione, 1 mg / mL nel DMEM eliminato.
- cultuRe hiPSCs su piatti di coltura tissutale da 60 mm con cellule alimentatrici ( cioè un monostrato di cellule fibroblastiche embriotiche irradiate del mouse). Quando le cellule sono confluenti del 80-90%, dissociate le cellule con dispersione e passaggio i hiPSCs 1: 3 ogni 4-5 giorni. Inserire le cellule in un incubatore di CO 2 di 37 ° C e 5%.
- Disseccare le colonie hiPSC indifferenziate in piccoli pezzi (circa 50-100 μm di diametro) utilizzando un ago di vetro disegnato a fuoco quando iPSCs sono confluenti 80-90%. Generalmente, utilizzare le colonie hiPSC in un piatto da 60 mm per generare EB in un piatto di Petri da 100 mm.
- Coltivare meno di 100 piccoli pezzi di colonie in un piatto di Petri non aderente da 100 mm contenente 10 ml di mezzo di formazione EB. Mettere i piatti in un incubatore di CO 2 di 37 ° C e 5%.
- Sostituire circa il 25% del mezzo iniziale con una medesima quantità di mezzo di coltura basale ogni 2 giorni. Inclinare il piatto per lasciare che i EB si stabiliscano. Rimuovere con cautela 3 mlDi media superiore e aggiungere 4 ml di terreno colturale fresco di base. Non disturbare le EB.
NOTA: I EB sono caratterizzati morfologicamente dai pezzi di colonie, assumendo un aspetto rotondo con bordi lisci sotto il microscopio. - Dopo 10 giorni di coltura nel piatto Petri non aderente, ricoprire un nuovo piatto da 100 mm di coltura tissutale con 4 ml di gelatina 0,1% per 30 minuti a 37 ° C prima dell'uso.
- Trasferire il mezzo e gli EB da un piatto di Petri non aderente da 100 mm a un tubo conico da 15 ml. Lasciate il sedimento EB per 4-5 min. Aspirare con attenzione il surnatante e lasciare meno di 0,5 ml di mezzo e EB
- Seme meno di 100 EB su un piatto di coltura tissutale rivestito con gelatina da 100 mm con 10 ml di terreno di coltura basale. Mettere i piatti in un incubatore di CO 2 di 37 ° C e 5%.
2. Formazione delle cellule di pellicola e differenziazione dei condrociti
- Preparare 10 mL di 0,25% di acido triposina / etilendiammina-tetraacetico (EDTA). Crea 80 ml di bassorilievoAl medium di coltura: DMEM integrato con 20% FBS, 1x amminoacidi non essenziali, 55 μM 2-mercaptoetanolo e 2 mM L-glutamina.
- Crea 10 ml di mediazione differenziata: DMEM (elevato glucosio) integrato con 10% di insulina transferrina-selenio (ITS), 0,1 μM dexametasone, 1 mM acido ascorbico, 1% piruvato di sodio e 10 ng / Beta 1 (TGF-β1).
- Aggiornare il mezzo con 10 ml di terreno di coltura basale dopo 48 h. Quindi, aggiornare il mezzo ogni tre giorni con 10 ml di substrato di coltura basale.
NOTA: Dopo 10 giorni di coltura, le colture fibroblastiche dovrebbero essere estese dalle EB.- Cappare i piatti da 100 mm con 4 ml di gelatina 0,1% per 30 minuti a 37 ° C prima dell'uso. Scartare il surnatante di cellule e lavare le cellule con una volta con Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS).
- Digestare le cellule con 3 mL di 0.25% di trysina / EDTA a 37 ° C per 5 min e neutralizzare con 4 mL del mezzo di coltura basale.
- Dissociare le cellule in singole cellule pipettando su e giù per 5-10 volte e passandole attraverso una maglia nylon da 70 μm. Centrifugare la sospensione cellulare a 200 xg per 5 min. Rieseguire le cellule su un nuovo piatto di coltura tissutale 100 mm con rivestimento di gelatina con 10 ml di substrato di coltura basale.
- Aggiornare il mezzo con 10 ml di terreno di coltura basale dopo 48 h. Quindi, aggiornare il mezzo ogni tre giorni con 10 ml di substrato di coltura basale.
NOTA: Le cellule acquisiscono una omogenea morfologia tipo fibroblastica. - Quando si raggiunge la confluenza di ~ 90-100% ( cioè circa 5-7 giorni), raccogliere le cellule con 3 mL di 0.25% di trysina / EDTA a 37 ° C per 5 min. Neutralizzare con 4 ml di terreno di coltura basale. Dissociare le cellule in singole cellule pipettando su e giù per 5 volte. Utilizzare un emocitometro per contare il numero della cellula.
- Posizionare 3 x 10 5 cellule in un tubo di polipropilene da 15 ml. Centrifugare a 200 xgPer 5 minuti a temperatura ambiente (RT). Riposizionare le cellule in 1 ml di mezzo di differenziazione condrogenica.
- Riacentrifugare le cellule a 300 xg per 3 min e mantenere le cellule in forma di pellet. Mettere il tubo nel 37 ° C e 5% CO 2 incubatore per 21 giorni. Non avvitare bene il coperchio e lasciare scambiare il gas.
- Sostituire 3/4 del terreno di coltura ogni tre giorni con un nuovo mezzo di differenziazione condrogenica.
NOTA: dopo 21 giorni di coltura, i pellets hiPSC-condrogenici (hiPSC-Chon) dovrebbero essere formati. Le cellule staminali mesenchimali umane (MSC), come un controllo positivo, sono raccolte e coltivate anche nel terreno di differenziazione condrogenica per 21 giorni per formare pellet condensatori (hMSC-Chon).
3. Analisi della differenziazione condrogenica
- Preparare 10 mL di formalina a tampone neutro al 10%.
- Preparare 50 ml di reagente blu alciente 0,1% e 50 ml di reagente blu toluidina 1%.
- Pr1 ml degli anticorpi primari: anticorpi policlonali coniglio contro collagene II (1:50) o anticorpi monoclonali del topo contro il collagene X (1:50). Inoltre, preparare anticorpi secondari anti-coniglio o mouse.
- Preparare 1 mL di soluzione papaina: 10 U / mL in PBS con 0,1 M acetato di sodio, 2,4 mM EDTA e 5 mM L-cisteina.
- Preparare 100 ml di soluzione di tinture blu dimetilmetilene (DMMB): 100 μl di 16 mg / l di 1,9 dimetilmetilene blu, 40 mM di glicina, 40 mM di NaCl e 9,5 mM di HCl; PH 3,0.
- Valutare la differenziazione condrogenica dalle macchie azzurre blu e toluidina blu delle sezioni di pellet.
- Fissare un pellet hiPSC-Chon o pellet hMSC-Chon in 1 mL di formalina tampone neutralizzato al 10% per 24 h.
- Trasferire il pellet in 1 ml di etanolo al 70% in H 2 O. Disidratare il pellet con 1 ml di etanolo graduato ( cioè 25, 50, 75, 90, 95, 100 e 100%, 3 min ciascuno).
- Chiarire il pellet in 1 ml di xilene al 100% tre volte. infiltratIl pellet con paraffina per 1 h in un forno a 65 ° C. Incorporare il pellet in blocchi di paraffina con uno stampo di 7 x 7 x 5 mm 3 , seguendo le procedure istologiche di routine 6 .
- Realizzare sezioni adiacenti per microtoma con uno spessore di circa 4 μm 7 . Aderire le sezioni sulle vetrate.
- Asciugare le diapositive per 2 ore a 60 ° C in un forno. Deparaffinare le sezioni in tre cicli (3 min ciascuno) usando il xilene al 100%.
- Utilizzare una serie di alcol in diminuzione per la reidratazione ( cioè 100, 100, 95, 95, 70, 50 e 25% in H 2 O, 3 minuti ciascuno) e quindi eseguire un risciacquo finale con acqua deionizzata per 5 minuti.
- Macchiare le sezioni con 0,1% reagente blu alcian o 1% toluidine blu colorazione per 4-5 ore e poi risciacquare con acqua distillata.
- Dehidrato con una serie di etanolo gradato ( cioè 25, 50, 75, 90, 95, 100 e 100%, 3 min ciascuno) seguiti da tre st consecutiveEps di chiarificazione in 100% di xilene. Montare le diapositive e visualizzarle sotto un microscopio.
- Eseguire immunohistochemistry.
NOTA: Ulteriori sezioni di pellet vengono ulteriormente valutate mediante immunohistochemistry.- Dopo la deparaffinazione e la reidratazione, portare le scivolature ad ebollizione in 1 mM EDTA, pH 8,0 (impermeabile in acqua bollita da autoclave). Lasciarli sedere per 8 minuti ad una temperatura sottobollente e lasciare che le diapositive si raffreddino a RT.
- Sciacquare le diapositive con acqua deionizzata 3 volte. Incubare le sezioni in soluzione al 3% di H 2 O 2 in metanolo a RT per 15 minuti per bloccare l'attività endogena perossidasi.
- Sciacquare le diapositive con acqua deionizzata e immergetele in DPBS per 5 min. Applicare 50-100 μL di anticorpo primario opportunamente diluito (1:50) alle sezioni sulle diapositive e poi incubarle in una camera umidificata a RT per 1 ora.
- Lavare le diapositive 3 volte (5 min ciascuna) con DPBS. Incubare la saCon i rispettivi anticorpi secondari corrispondenti (ad esempio, anti-coniglio o topo) per 15 minuti a RT.
- Lavare le diapositive 3 volte (per 5 min ciascuna) con DPBS. Eseguire la rilevazione DAB sotto un microscopio.
- Lavare le diapositive con DPBS 3 volte (2 minuti ciascuno). Contrasta i nuclei delle cellule immergendo le diapositive in ematossilina per 1-2 minuti. Dehidrato con una serie di etanolo classificato (25, 50, 75, 90, 95, 100 e 100%, 3 min ciascuno) seguito da tre fasi consecutive di chiarificazione con xilene. Infine, montare le diapositive e visualizzarle sotto il microscopio.
- Rileva il contenuto di sGAG.
- Digete i pellet condensatori in soluzione papaina a 60 ° C per 2 ore.
- Determinare il contenuto del DNA utilizzando il kit di analisi dsDNA e il sistema di fluorometri. Misurare il contenuto di sGAG mescolandolo con la soluzione di tintura DMMB sotto misura di assorbanza a 525 nm 8 .
- Calcolare la concentrazione di sGAG contro una curva standard diLo squalo condroitina solfato.
- Eseguire l'analisi PCR in tempo reale dei marcatori di differenziazione condrogenica nei pellet hiPSC-Chon.
- Raccolta 3-4 di medesime pellet condensanti aggiungendo 500 μl di reagente di estrazione ghiacciata ad un tubo. Vortice bene. Incubare il campione per 5 minuti a RT.
- Aggiungere 0,1 ml di cloroformio. Vortex il campione per 15 s e incubare a RT per 3 min. Centrifugare il campione per 15 minuti a 12.000 xg e 4 ° C. Trasferire la fase acquosa superiore (circa 250 μL) in un nuovo tubo di microcentrifuga da 1,5 ml.
- Aggiungere 25 μL di acetato di sodio e 1 μl di glicogeno al campione. Precipitare l'RNA mescolandolo con 250 μL di alcool isopropilico. Mescolare accuratamente. Incubare il campione in RT per 10 min.
- Centrifugare per 10 min a 12.000 xg e 4 ° C. Rimuovere completamente il surnatante. Lavare il pellet RNA due volte con 500 μl di etanolo al 75%.
- Centrifugare per 5 minA 7.500 xg e 4 ° C. Rimuovere l'etanolo residuo e asciugare in aria l'impianto di RNA per 5-10 min. Sciogliere l'RNA in 10 μL di acqua priva di nucleasi.
- Convertire l'RNA in cDNA usando un sistema di trascrizione trasversale. Soggetti i campioni di cDNA a PCR in tempo reale utilizzando il mix master del kit qPCR (2x) e un sistema PCR in tempo reale 9 .
NOTA: Le sequenze primer sono:
H AGGRECAN -F: TCGAGGACAGCGAGGCC;
H AGGRECAN -R: TCGAGGGTGTAGCGTGTAGAGA;
H β-ACTIN -F: TTTGAATGATGAGCCTTCGTCCCC;
H β-ACTIN -R: GGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAAGC;
H COL2 -F: TGGACGATCAGGCGAAACC;
H COL2 -R: GCTGCGGATGCTCTCAATCT;
H SOX9 -F: AGCGAACGCACATCAAGAC;
H SOX9 -R: CTGTAGGCGATCTGTTGGGG;
H COL10 -F: ATGCTGCCACAAATACCCTTT;
H COL10 -R: GGTAGTGGGCCTTTTATGCCT.
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Representative Results
Differenziazione condrogenica di hiPSCs:
Il medium di formazione EB e il mezzo di coltura basale sono stati utilizzati per differenziare i hiPSC nel linfatico mesenchimale. È stato utilizzato un metodo di coltura a più fasi ( Figura 1 ). In primo luogo, i hiPSCs sono stati spontaneamente differenziati tramite la formazione di EB per 10 giorni (D10; Figura 2A ). In secondo luogo, le cellule hanno superato le EB per altri 10 giorni (D10 + 10). Durante questi due passaggi iPSC gradualmente perse le loro morfologie originali e ottenne morfologie a forma di mandrino ( figura 2B ), che poi sono state trasformate in una forma fibroblastica dopo il passaggio. In terzo luogo, le cellule sono state espanse in monostrato dopo la subcultura ( Figura 2C ). Durante questa fase sono state escluse le cellule indifferenziate residue. Quindi, le cellule sono state espanse e impegnate a cellule fibroblastiche come dopo5-7 giorni nella coltura monolayer (D10 + 10 + 7). Quarto, quando le cellule simili a fibroblasti hiPSC (hiPSC-F) hanno raggiunto il confluenza del 90%, sono state indotte a differenziarsi in condrociti mediante una coltura a pellet 3D ( figura 2D ) 10 .
Caratterizzazione di pellets hiPSC-Chon:
HiPSC-F sono stati coltivati in 15 ml di polipropilene in polvere per 21 giorni. Le cellule condrogeniche possono assemblare in vitro e produrre una caratteristica matrice extracellulare quando si tratta di una coltura ad alta densità. Alla fine della cultura, si vedeva un denso aggregato di cartilagine, il pellet hiPSC-Chon, lungo fino a 2-3 mm e spessore 3 mm ( Figura 2D ). Le cellule erano positive per l'azzurro alciano ( Figura 3A ) e la toluidina blu ( Figura 3B ), che ha indicato il successoUl differenziazione condrogenica dei pellet hiPSC. L'analisi dell'immunohistochemistry per il collagene II ( Figura 3C ) e il collagene X ( Figura 3D ) hanno inoltre dimostrato che i pellets hiPSC-Chon avevano sviluppato un fenotipo condroprofico. Sono stati eseguiti controlli negativi di immunohistochemistry per collagene II e collagene X per dimostrare meglio la colorazione positiva (dati non mostrati) 5 .
L'analisi di sGAG è stata eseguita anche dopo la differenziazione condrogenica ( Figura 3E ). I contenuti di sGAG sono stati rilevati nei pellet hiPSC-Chon, hiPSC-F, EB e nei hiPSC indifferenziati. Il contenuto di sGAG è stato significativamente aumentato nei pellet hiPSC-Chon rispetto agli altri gruppi ( P <0,05). Nel controllo positivo del hMSC-Chon, il contenuto di sGAG è stato anche significativamente regolato ( P <0,05) rispetto agli hMSCs. Tuttavia, i contenuti di sGAGTra pellet hMSC e pellets hiPSC-Chon non hanno dimostrato differenze ( P > 0,05).
Espressione genica dei marker di differenziazione condrogenica:
L'espressione genica dei marcatori di differenziazione per i linfondi chondro -progenitrici ( SOX9 e COL2 ) e condrociti completamente differenziati ( AGGRECAN e COL10 ) sono stati utilizzati per caratterizzare il fenotipo dei pellet condrogenici ( Figura 4 ). Nel confronto tra pellicole hiPSC, hiPSC-F e hiPSC-Chon, le espressioni di COL2 , COL10 , SOX9 e AGGRECAN sono state significativamente aumentate nel hiPSC-Chon rispetto agli altri gruppi ( P <0,05). Nel controllo positivo del hMSC-Chon, l'espressione di questi marcatori è stata anche significativamente aumentata rispetto a quella di hMSC ( P <0,05). Tuttavia, l'espressione genica tra hMSC pellets e hiPSC-Chon pellets non hanno dimostrato differenze ( P > 0,05). Nel complesso, questi risultati suggeriscono un processo di differenziazione condensato di successo dai iPSC umani.
Figura 1: Schema generale del protocollo. Un metodo di coltura a più fasi utilizzato per differenziare iPSC umani in condrociti, tra cui : 1) differenziazione spontanea tramite formazione EB, 2) crescita delle cellule da EB, 3) coltura cellulare monolayer dopo subcultura e 4) coltura pellet 3D. Il fenotipo condrocitico è valutato mediante analisi istologica, analisi biochimica e espressione genica condrogenica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Generazione di condrociti da hiPSCs. ( A ) formazione EB su D10. Barra di scala = 100 μm. ( B ) Crescita cellulare da EB a D10 + 10. Barra di scala = 100 μm. ( C ) coltura di cellule monolayer su D10 + 10 + 7. Barra di scala = 100 μm. ( D ) coltura pellet 3D. Questa cifra è stata modificata dal nostro precedente studio 5 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Caratterizzazione dei pellet hiPSC-Chon. ( A ) colorazione blu alciana e ( B ) toluidine blue colorazione di glicosaminoglicani e proteoglicani. Barra di scala = 100 μm. ( C e D ) Immunohistochemistry per collagene II e collagene X. Barra di scala = 100 μm. ( E ) Caratterizzazione biochimica dei pellet hiPSC-Chon contro hiPSCs, EBs e hiPSC-F rispetto a hMSC-Chon contro hMSCs. SGAG per DNA. La barra rappresenta la media ± SEM. N = 3, * P <0,05. Questa cifra è stata modificata dal nostro precedente studio 5 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Analisi dell'espressione di geni. Analisi dell'espressione genica RT-qPCR di marcatori differenziali ( COL2 , COL10 , SOX9 e AGGRECAN ) in hiPSC-Chon versus hiPSCs e hiPSCF rispetto a hMSC-Chon contro hMSCs. La barra rappresenta la media ± SEM. N = 3, * P <0,05. Questa cifra è stata modificata dal nostro precedente studio 5 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui forniamo un protocollo per generare condrociti da PBC tramite iPSC. Poiché i PBC sono più comuni e ampiamente utilizzati nel campo clinico, essi vengono presentati come una potenziale alternativa per la riprogrammazione. In questo studio, visi episomici (EV) sono stati utilizzati per riprogrammare PBC in iPSC, seguendo il metodo stabilito da Zhang et al. 11 . Questo approccio senza integrazione non prevede l'integrazione di genotossicità associata a virus, che si ritiene avere un ampio effetto nel campo clinico 12 , 13 . L'efficienza di riprogrammazione di generare iPSC senza integrazione da cellule del sangue in questo studio è stata soddisfatta. Più di 30 iPSCs potrebbero essere prodotti da 2 mL di sangue periferico. Pertanto, i PBC hanno il potenziale di essere le cellule di sementi utilizzate per generare iPSC per l'ingegneria della cartilagine e altre applicazioni cliniche.
Le fasi principali di diffondere condrogenicoNizzazione dai hiPSC inclusi: formazione EB, crescita delle cellule da EB, coltura monolayer e coltura pellet 3D. Le colonie hiPSC indifferenziate vengono disseccate in pezzi più piccoli utilizzando un ago di vetro disegnato a fuoco. Il metodo meccanico, anche se più tecnico, è migliore della digestione enzimatica (come la dispersione o la collagenasi) a causa del danno ridotto e della dimensione specifica (50-100 μm di diametro) all'acquisto. Inoltre, la digestione meccanica può disporre manualmente delle celle di alimentazione, che reprimono la differenziazione hiPSC. I hiPSC si differenziano spontaneamente per formare EB, che sono caratterizzati da aggregati tridimensionali multi-cellulari con bordi lisci. Molti EB possono raggrupparsi insieme per formare forme irregolari. Al fine di mantenere le EB in buone condizioni, meno di 100 EB sono coltivati in un piatto di Petri non aderente da 100 mm, con 10 mL di mezzo di formazione EB. Circa 50 EB in un piatto da 100 mm è considerato la migliore concentrazione. Le EBs sono poi inondate A 10 cm, piatti ricoperti di gelatina con supporto di coltura basale. La densità della distribuzione di EB è importante per la crescita sufficiente di EB. Meno di 100 EB vengono coltivati su un piatto da 100 mm. Entro dieci giorni dalla coltura, le cellule fibroblastiche sono gradualmente fuoriuscite e ampliate dalle EB. Il passaggio monolayer viene eseguito per escludere le cellule residue indifferenziate presenti nelle EB, così come per espandere le cellule impegnate nel linfatico mesenchimale. Le cellule 0.5-1 x 10 6 vengono seminate in un piatto da 100 mm per la coltura di cellule monolayer. L'espressione di marcatori di superficie delle cellule su hiPSC-F è stata analizzata mediante analisi di flusso-citometria nel nostro studio precedente 5 . I risultati hanno mostrato che la maggior parte dei hiPSC-F ha espresso CD73 (81,81 ± 2,05%) e CD105 (endoglin; 81,90 ± 1,61%), noti per essere i marker positivi umani mesenchimali. Inoltre, sei differenti iPSC e una cellula staminale embrionale umana (ESC) sono stati utilizzati per riprodurre questi metodi.
Ve_content "> La differenziazione condrogenica indotta da cellule pluripotenti è anche un processo chiave complesso, in considerazione di questo, è stato utilizzato il classico condensato classico per l'induzione della condogenesi da hiPSC, mentre il TGF-beta1 e il dexametasone sono integrati nel mezzo di coltura pellet. hanno dimostrato di avere una notevole influenza sulla capacità potenziali condrogeniche 14. Un'altra differenza da altri protocolli era la concentrazione del 10% ITS, che è molto superiore al solito indicata 1% ITS 15, 16. 1% ITS + 10% FBS migliorata La formazione di cartilagine in altri metodi 17 , 18. L' ITS come sostituto sierico può promuovere la proliferazione e la formazione dei condrociti e mantenere i fenotipi condrogenici. Al fine di sostituire i componenti animali di FBS, abbiamo aggiornato la concentrazione di ITS al 10% Per promuovere efficacementeDifferenziazione condrocitica 7 .Una cultura cellulare ad alta densità è un altro fattore essenziale per la differenziazione condrogenica. Esistono molti altri metodi di coltura cellulare che possono essere usati per indurre una differenziazione condrogenica, come la cultura di micromassi, la co-coltura con altre cellule, la cultura biomateriale e la manipolazione genica 1 , 19 , 15 . La coltura 3D del pellet nel nostro studio, che si traduce in un'elevata densità cellulare e un'elevata interazione cellulare, è più facile da eseguire senza altre cellule o materiali. Poiché viene eseguita nei tubi di centrifuga da 15 ml, una limitazione è che può essere utilizzata solo in un test di differenziazione condizionale di piccole dimensioni. Tuttavia, piatti a 96 pozzetti con fondi rotondi potrebbero essere utilizzati come un'alternativa promettente 7 . Pertanto, altri miglioramenti ai metodi di coltura potrebbero promuovere l'efficienza dei condrogeniciDifferenziazione in vitro . Nel nostro studio, l'induzione condrogenica fino a 21 giorni è stata effettuata in condizioni prive di siero e xeno-free, durante la quale tutti i componenti animali sono stati rimossi. Pertanto, la procedura del nostro studio è adattabile alle future applicazioni cliniche.
Si ritiene che le cellule staminali autologhe sarebbero la scelta ideale per la riparazione della cartilagine, in quanto non solo possono ridurre il rigetto, ma anche ottenere la rigenerazione dei tessuti sfruttando il naturale andamento dello sviluppo embrionale 20 , 21 . Tuttavia, si è trovato che hanno un potenziale proliferativo limitato in vitro 22 . Pertanto, un metodo senza integrazione per la generazione di condrociti da PBC tramite iPSCs può essere un approccio più promettente per l'ingegneria dei tessuti cartilaginei. Con il nostro metodo, 2 mL di sangue potrebbe essere sufficiente per indurre i condrociti specifici del paziente necessari per la defecazione della cartilaginets. Inoltre, abbiamo utilizzato anche hMSCs come un controllo positivo da confrontare con le cellule differenziate da iPSCs, che suggerivano che iPSC posseggano buoni potenziali di differenziazione dei condensatori.
In conclusione, questo studio ha dimostrato che i PBC possono essere utilizzati come candidati per la rigenerazione condrocitica. Ciò potrebbe riflettere ulteriormente una direzione futura per generare le cellule di sementi per la riparazione della cartilagine in un approccio paziente-specifico e conveniente alla medicina rigenerativa.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori vogliono ringraziare Xiaobin Zhang per il suo plasmide. Ringraziamo anche Shaorong Gao e Qianfei Wang per il loro aiuto gentile durante l'esperimento. Questo studio è sostenuto dalla Fondazione Nazionale di Scienze Naturali della Cina (No.81101346, 81271963, 81100331), dal progetto di talento di Pechino 215 ad alto livello (No.2014-3-025) e dal Fondo Chao-Yang Hospital di Pechino (No CYXX-2017-01) e l'Associazione per la promozione dell'innovazione giovanile dell'Accademia delle Scienze Cinesi (YL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829018 | Basal medium used for hiPSC culture and EB formation medium |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Invitrogen | 10828028 | A more defined, FBS-free medium supplement used for hiPSC culture and EB formation medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | sh30070.03 | Used for hiPSC culture and EB formation medium,offers excellent value for cell culture |
| Nonessential amino acids | Chemicon | TMS-001-C | Used as a growth supplement in all the cell culture medium, to increase cell growth and viability |
| L-glutamine | Invitrogen | TMS-002-C | An amino acid required for cell culture |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B | A cytokine used for sustaining the pluripotency and self-renewal of hiPSCs |
| Dispase | Invitrogen | 17105041 | Used for hiPSC dissociation for subculture |
| DMEM | Gibco | C11960 | Basal medium used for MSC culture medium |
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | Used for cell attachment onto the dishes |
| 0.25% trypsin/EDTA | Gibco | 25200072 | Used for cell dissociation |
| DPBS | Gibco | 14190250 | A balanced salt solution used for cell wash or reagent preparing |
| 2-mercaptoethanol | invitrogen | 21985023 | Used as a growth supplement in all the cell culture medium. |
| ITS | invitrogen | 41400045 | Insulin, Transferrin, Selenium Solution.Used for chondrogenic differentiation. |
| Ascorbic acid | Sigma | 4403 | Known as vitamin C. It helps in active growth and has antioxidant property. |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | Added to cell culture medium as an energy source in addition to glucose. |
| Transforming growth factor-beta 1 | Peprotech | AF-100-21C | A cytokine that regulate cell proliferation, growth and chondrogenic differentiation. |
| Rabbit polyclonal antibodies against Collagen II | Abcam | ab34712 | This antibody reacts with Type II collagens,which is specific for cartilaginous tissues. |
| Mouse monoclonal antibodies to Collagen X | Abcam | ab49945 | This antibody reacts with Type X collagen,which is a product of hyperthrophic chondrotocytes. |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | For mounting and long-term storage of slides |
| Toluidine blue | Sigma | 89640 | Used for proteoglycans detection. |
| Alcian blue | Amresco | #0298 | Used for glucosaminoglycans detection. |
| Papain | Sigma | P4762-25MG | Used to digest chondrogenic pellets. |
| Dimethylmethylene blue | Sigma | 341088-1G | Used to quantitate glycosaminoglyans |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma | C4384-250MG | Used to draw the standard curve for sGAG content measurement. |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 (100) | Used to determine DNA content |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | Used for RNA isolation from cells |
| Reverse Transcriptase System | Promega | A3500 | Used to convert RNA into cDNA |
| SYBR FAST qPCR kit Master Mix | Kapa | KK4601 | Used for Real-time PCR |
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