Summary
我々は、胚様体（EB）形成、線維芽細胞増殖および軟骨形成誘導を含む無組み込み法を用いて、誘導末梢血（PB）から誘導された多能性幹細胞（iPSC）を介して軟骨系統を生成するためのプロトコールを提示する。
Abstract
この研究では、統合された方法で誘導された多能性幹細胞（iPSCs）を介して軟骨細胞を産生するために、末梢血細胞（PBC）を種細胞として使用した。胚様体（EB）形成および線維芽細胞増殖に続いて、iPSCは、無血清および無細胞条件下で21日間軟骨分化のために誘導される。軟骨細胞誘導後、形態学的、免疫組織化学的および生化学的分析、ならびに軟骨形成性分化マーカーの定量的リアルタイムPCR検査によって、細胞の表現型を評価する。軟骨形成性ペレットは、アルシアンブルーおよびトルイジンブルー染色が陽性であることを示す。コラーゲンIIおよびX染色の免疫組織化学も陽性である。硫酸化グリコサミノグリカン（sGAG）含量および軟骨分化マーカーCOLLAGEN2 （ COL2 ）、 COLLAGEN10 （ COL10 ）、 SOX9およびAGGRECANは、hiPSCsおよび線維芽細胞と比較して非還元性のペレットが得られた。これらの結果は、PBCを軟骨修復のためのiPSCsを生成するための種細胞として使用することができることを示唆しており、これは患者特異的かつ費用対効果が高い。
Introduction
軟骨組織は、自己修復および再生の能力が非常に低い。様々な外科的介入および生物学的処置が、不十分な結果を伴って軟骨および関節機能を回復させるために使用される。最近の幹細胞技術の発展は、軟骨修復領域全体を変化させる可能性がある1 。様々な幹細胞が種細胞として研究されてきたが、拒絶反応を起こさずに多くのタイプの患者特異的細胞を提供することができるため、ヒト誘導性多能性幹細胞（hiPSC）が最も有望な選択肢であるようである2 。さらに、成人細胞の限られた増殖性を克服し、自己複製能および多能性を維持することができる。さらに、特定のタイプの軟骨細胞を得るために遺伝子ターゲティングを用いて遺伝子型を変えることができる。
再プログラミングの可能性も十分に研究されているので、繊維芽細胞はiPSCを生成するために広く使用されている。しかし、患者からの痛みを伴う生検や、線維芽細胞のin vitroでの拡大が必要であり、遺伝子突然変異を引き起こす可能性があるなど、まだ克服しなければならないいくつかの限界が存在する3 。最近、PBCはリプログラミング4にとって有利であることが判明した。さらに、それらは一般に利用され豊富に貯蔵されていた。研究の焦点を皮膚からリダイレクトする可能性があります。しかし、私たちが知る限りでは、軟骨細胞への分化が続くPBCの再プログラミングに関する報告はほとんどありません。
現在の研究では、軟骨細胞の形成を模倣するために、iPSCをそれらをiPSCに再プログラミングし、次いでペレット培養系を介して軟骨系統に分化させることによって、PBCを代替源として利用する。
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Protocol
PBCsからhiPSCを生成するためのプロトコールは、我々の以前の研究5に見出すことができる。この研究は、私たちの機関の機関審査委員会によって承認されました。
1.胚様体（EB）形成
- 5％ウシ胎児血清（FBS）、1×非必須アミノ酸、55μM2-メルカプトエタノール、2mM L-メルカプトエタノール、2mM L-メチオニン、および2mM LPSを補充したノックアウトダルベッコ改変イーグル培地（DMEM） - グルタミン、および8ng / mL塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）を含む。
- 50mLのEB形成培地を調製する：15％KSR、5％FBS、1x非必須アミノ酸、55μM2-メルカプトエタノール、および2mM L-グルタミンを添加したDMEM。
- 20％FBS、1×非必須アミノ酸、55μM2-メルカプトエタノール、および2mM L-グルタミンを補充した基礎培地50mLを調製する。
- ディスパーゼ溶液10 mLをノックアウトDMEMで1 mg / mLに調製する。
- カルチュフィーダー細胞（ すなわち、照射されたマウス胚線維芽細胞の単層）を有する60mm組織培養皿上に再平滑化した。細胞が80〜90％コンフルエントである場合、細胞をディスパーゼで解離させ、4〜5日ごとにhiPSCs1：3を通過させる。 37℃および5％CO 2インキュベーターに細胞を入れる。
- iPSCsが80〜90％コンフルエントである場合、未分化hIPSCコロニーを火で引かれたガラス針を用いてより小さな断片（直径約50〜100μm）に解剖する。一般に、100mmのペトリ皿にEBを生成するために60mmの皿にhiPSCコロニーを使用します。
- 10mLのEB形成培地を含む100mmの付着していないペトリ皿に100個未満の小さなコロニーを培養する。皿を37℃および5％CO 2インキュベーターに入れる。
- 初期培地の約25％を2日ごとに等量の基礎培地に交換する。 EBを落ち着かせるためにディッシュを傾けます。注意深く3 mL新鮮な基礎培地4 mLを添加する。 EBを邪魔しないでください。
注：EBは、コロニーの断片によって形態学的に特徴付けられ、顕微鏡下で滑らかな境界を有する丸い外観をとる。 - 非粘着性のペトリ皿で10日間培養した後、使用前に37℃で30分間、4℃の0.1％ゼラチンで新しい100mm組織培養皿をコーティングする。
- 培地とEBを100 mmの付着していないペトリ皿から15 mLコニカルチューブに移す。 EBを4〜5分間沈降させる。上清を注意深く吸引し、培地+ EBの0.5 mL未満を残す
- 10mLの基礎培地を含む100mmのゼラチン被覆組織培養皿上に100個未満のEBを種子に接種する。皿を37℃および5％CO 2インキュベーターに入れる。
細胞ペレット形成および軟骨細胞分化
- 0.25％トリプシン/エチレンジアミン四酢酸（EDTA）10 mLを調製する。 basの80 MLを作るα培養培地：20％FBS、1×非必須アミノ酸、55μM2-メルカプトエタノール、および2mM L-グルタミンを補充したDMEM。
- 10％インスリントランスフェリンセレン溶液（ITS）、0.1μMデキサメタゾン、1mMアスコルビン酸、1％ピルビン酸ナトリウム、および10ng / mLのトランスフォーミング増殖因子 - セレン溶液を補充したDMEM（高グルコース） β1（TGF-β1）である。
- 48時間後に培地を10 mLの基礎培地で再び分けます。その後、10mLの基礎培地で3日ごとに培地をリフレッシュする。
注：培養10日後、線維芽細胞の細胞の伸長はEBから拡大しているはずです。- 使用前に、100 mmディッシュを4 mlの0.1％ゼラチンで30分間37℃でコートします。細胞上清を捨て、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）で一度洗浄する。
- 細胞を37℃で5分間0.25％トリプシン/ EDTA 3 mLで消化し、4 mで中和するLの基礎培地を含む。
- 5〜10回上下にピペッティングし、70μmナイロンメッシュに通すことにより、細胞を単一細胞に解離させる。細胞懸濁液を200xgで5分間遠心分離する。新しい100mmゼラチンコート組織培養皿に細胞を基礎培地10mLで再播種する。
- 48時間後に培地を10 mLの基礎培地で再び分けます。その後、10mLの基礎培地で3日ごとに培地をリフレッシュする。
注：細胞は、均一な線維芽細胞様形態を獲得する。 - 約90〜100％のコンフルエンスに達したら（ すなわち、約5〜7日）、細胞を37℃で0.25％トリプシン/ EDTA 3mLで5分間採取する。基本培地4 mLで中和する。ピペットで5回上下させることにより、細胞を単一の細胞に解離させる。血球計算盤を使用して細胞数を数えます。
- 15mLポリプロピレンチューブに3×10 5個の細胞を入れる。 200 xgで遠心分離機室温（RT）で5分間インキュベートする。 1mLの軟骨形成分化培地で細胞を再懸濁する。
- 細胞を300xgで3分間再遠心分離し、小さなペレット形態で細胞を維持する。チューブを37℃および5％CO 2インキュベーターに21日間入れる。蓋をしっかり締めてガス交換をしないでください。
- 新鮮な軟骨形成分化培地で3日ごとに培地の3/4を交換する。
注：培養21日後、hiPSC-軟骨形成ペレット（hiPSC-Chon）が形成されているはずである。陽性対照としてのヒト間葉系幹細胞（MSC）も回収し、軟骨形成性分化培地で21日間培養し、軟骨形成性ペレット（hMSC-Chon）を形成する。
3.軟骨分化の解析
- 10％中性緩衝ホルマリン10 mLを調製する。
- 50mLの0.1％アルシアンブルー試薬と50mLの1％トルイジンブルー試薬を調製する。
- Pr一次抗体：コラーゲンII（1:50）に対するウサギポリクローナル抗体またはコラーゲンX（1:50）に対するマウスモノクローナル抗体の1mLを発現させる。また、抗ウサギまたはマウス二次抗体を調製する。
- 1mLのパパイン溶液を調製する：0.1M酢酸ナトリウム、2.4mM EDTA、および5mM L-システインを含むPBS中10U / mL。
- 100ミリリットルのジメチルメチレンブルー（DMMB）染料溶液を調製する：100μLの16mg / Lの1,9-ジメチルメチレンブルー、40mMのグリシン、40mMのNaCl、および9.5mMのHCl; pH3.0。
- ペレット切片のアルシアンブルーおよびトルイジンブルー染色による軟骨形成分化を評価する。
- 1mLの10％中性緩衝ホルマリン中で24時間、1つのhiPSC-ChonペレットまたはhMSC-Chonペレットを固定する。
- ペレットをH 2 O中の70％エタノール1mLに移す。ペレットを1mLの段階的エタノールシリーズ（ すなわち、 25,50,75,90,95,100および100％、それぞれ3分間）で脱水する。
- ペレットを1％100％キシレンで3回洗浄する。侵入者ペレットを65℃のオーブン中でパラフィンで1時間処理する。通常の組織学的手順6に従って、ペレットをパラフィンブロックに7×7×5mm 3ベース金型で埋め込む。6 。
- 約4μmの厚さのミクロトームで隣接する切片を作る7 。セクションをスライドガラスに貼り付けます。
- スライドを60℃で2時間オーブンで乾燥する。 100％キシレンを用いて3サイクル（各3分）で切片を脱パラフィンする。
- 再水和（ すなわち、 H 2 O中100,100,95,95,70,50、および25％、それぞれ3分間）のために減少するアルコール系列を使用し、次いで5分間脱イオン水で最終的なすすぎを行う。
- 0.1％アルシアンブルー試薬または1％トルイジンブルー染色で4〜5時間染色した後、蒸留水ですすいでください。
- 段階的エタノールシリーズ（ すなわち、 25,50,75,90,95,100,100％、各3分）で脱水し、続いて3回連続して100％キシレンでの浄化のeps。スライドをマウントし、顕微鏡で視覚化します。
- 免疫組織化学を行う。
注：追加のペレット切片を免疫組織化学によってさらに評価する。- 脱パラフィンおよび再水和後、スライドを1mM EDTA、pH8.0（オートクレーブで沸騰させた水中での防水）中で沸騰させる。それらを沸点以下の温度で8分間放置させ、次にスライドを室温で冷却させる。
- スライドを脱イオン水で3回すすぐ。切片をメタノール中の3％H 2 O 2溶液に室温で15分間インキュベートし、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックする。
- 脱イオン水でスライドをすすぎ、DPBSに5分間浸します。 50-100μLの適切に希釈した（1:50）一次抗体をスライド上の切片に適用し、次にそれらを加湿チャンバー内で室温で1時間インキュベートする。
- DPBSでスライドを3回（各5分）洗浄する。 saをインキュベートする対応する二次抗体（ すなわち、抗ウサギまたはマウス）と、RTで15分間掛けた。
- DPBSでスライドを3回（それぞれ5分間）洗浄する。顕微鏡下でDAB検出を行います。
- スライドをDPBSで3回洗浄する（各2分）。スライドをヘマトキシリン中に1〜2分間浸して細胞核を対比染色する。漸変エタノールシリーズ（25,50,75,90,95,100,100％;各3分）で脱水した後、キシレンで3回連続して清澄化する。最後に、スライドをマウントし、それらを顕微鏡下で視覚化する。
- sGAGコンテンツを検出します。
- 60℃で2時間、パパイン溶液中の軟骨形成性のペレットを消化する。
- dsDNAアッセイキットおよび蛍光光度計システムを使用してDNA含量を決定する。 525 nmの8の吸光度を測定する下DMMB色素溶液と混合することによってのsGAG含量を測定します。
- 標準曲線に対するsGAGの濃度を計算するサメのコンドロイチン硫酸。
- hiPSC-Chonペレット中の軟骨分化マーカーのリアルタイムPCR分析を実施する。
- 500μLの氷冷抽出試薬を1本のチューブに加えることにより、同じ軟骨形成性のペレットを3〜4回収穫する。徹底的にボルテックス。サンプルを室温で5分間インキュベートする。
- 0.1mLのクロロホルムを加える。サンプルを15秒間ボルテックスし、室温で3分間インキュベートする。 12,000 xgおよび4℃で15分間サンプルを遠心分離する。上水相（約250μL）を新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに移す。
- 25μLの酢酸ナトリウムと1μLのグリコーゲンをサンプルに添加する。 250μLのイソプロピルアルコールと混合してRNAを沈殿させます。徹底的に混合する。サンプルを室温で10分間インキュベートする。
- 12,000 xgおよび4℃で10分間遠心分離する。上清を完全に除去する。 RNAペレットを500μLの75％エタノールで2回洗浄する。
- 5分間遠心分離する7,500 xgおよび4℃で測定した。残りのエタノールをすべて除去し、RNAペレットを5〜10分間風乾します。 10μLのヌクレアーゼフリー水にRNAを溶解する。
- 逆転写酵素システムを用いてRNAをcDNAに変換する。定量PCRキットマスターミックス（2×）を用いて、リアルタイムPCRおよびリアルタイムPCRシステム9にcDNAサンプルを施します。
注：プライマー配列は次のとおりです。
h AGGRECAN -F：TCGAGGACAGCGAGGCC;
h AGGRECAN -R：TCGAGGGTGTAGCGTGTAGAGA;
hβ-ACTIN -F：TTTGAATGATGAGCCTTCGTCCCC;
hβ-ACTIN- R：GGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAAGC;
h COL2- F：TGGACGATCAGGCGAAACC;
h COL2- R：GCTGCGGATGCTCTCAATCT;
h SOX9- F：AGCGAACGCACATCAAGAC;
h SOX9- R：CTGTAGGCGATCTGTTGGGG;
h COL10- F：ATGCTGCCACAAATACCCTTT;
h COL10- R：GGTAGTGGGCCTTTATGCCT。
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Representative Results
hiPSCsの軟骨形成分化：
EB形成培地および基礎培地を使用してhiPSCを間葉系統に分化させた。多段階培養法を用いた（ 図1 ）。最初に、hiPSCを10日間EB形成により自発的に分化させた（D10; 図2A ）。第2に、細胞はEBからさらに10日間（D10 + 10）逸脱した。これらの2つのステップの間、iPSCは徐々に元の形態を失い、紡錘形の形態を得た（ 図2B ）。その後、通過後に線維芽細胞の形態に変化した。第3に、継代培養後に細胞を単層で増殖させた（ 図2C ）。残りの未分化細胞は、この工程中に除外した。その後、細胞を増殖させ、線維芽細胞様細胞に曝露した。単層培養で5〜7日間（D10 + 10 + 7）。第4に、hiPSC線維芽様細胞（hiPSC-F）が約90％コンフルエンスに達したとき、3Dペレット培養（ 図2D ） 10を介して軟骨細胞に分化するように誘導された。
hiPSC-Chonペレットのキャラクタリゼーション：
hiPSC-Fをペレット状の15mLポリプロピレンチューブ中で21日間培養した。軟骨形成細胞は、高密度培養においてインビトロで組み立てられ、特徴的な細胞外マトリックスを生成し得る。培養終了時には、高密度軟骨様凝集体であるhiPSC-Chonペレット（長さ2〜3mm、厚さ3mm）（ 図2D ）を見ることができた。細胞はアルシアンブルー（ 図3A ）およびトルイジンブルー（ 図3B ）染色で陽性であり、成功したul hiPSCペレットの軟骨形成分化。コラーゲンII（ 図3C ）およびコラーゲンX（ 図3D ）の免疫組織化学分析により、hiPSC-Chonペレットが軟骨細胞様表現型を発達させたことがさらに証明された。コラーゲンIIおよびコラーゲンXについての免疫組織化学の陰性対照を、陽性染色（データは示さず） 5をよりよく証明するために行った。
sGAG分析も軟骨分化後に行った（ 図3E ）。 hiPSC-Chonペレット、hiPSC-F、EB、および未分化hiPSCにおいてsGAG含量が検出された。 sGAG含量は、hiPSC-Chonペレットにおいて他の群より有意に上方調節された（ P <0.05）。 hMSC-Chonの陽性対照において、sGAG含量もhMSCと比較して有意に上方調節された（ P <0.05）。しかし、sGAGの内容hMSCペレットとhiPSC-Chonペレットとの間に差はない（ P > 0.05）。
軟骨分化マーカーの遺伝子発現：
軟骨前駆細胞系統（ SOX9およびCOL2 ）および完全に分化した軟骨細胞（ AGGRECANおよびCOL10 ）の分化マーカーの遺伝子発現を、軟骨ペレットの表現型を特徴付けるために使用した（ 図4 ）。 hiPSC、hiPSC-FおよびhiPSC-Chonペレット間の比較において、 COL2 、 COL10 、 SOX9 、およびAGGRECANの発現は、hiPSC-Chonにおいて他の群より有意に上方制御された（ P <0.05）。 hMSC-Chonの陽性対照において、これらのマーカーの発現もhMSCよりも有意に上方制御された（ P <0.05）。しかし、hMSCペレットおよびhiPSC-Chonペレットは差がないことを示した（ P > 0.05）。結局のところ、これらの結果は、ヒトiPSCとの成功した軟骨形成分化プロセスを示唆している。
図1：プロトコルの概要。含む軟骨細胞へのヒトiPS細胞を区別するために使用される多段階培養法：EB形成を介して、1）自発的分化、EBから2）細胞の成長、3）単層細胞培養継代後、および4）3Dペレット培養。軟骨細胞の表現型は、組織学的分析、生化学的分析、および軟骨形成遺伝子発現によって評価される。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2：hiPSCからの軟骨細胞の生成。 （ A ）D10上でのEB形成。スケールバー=100μm。 （ B ）D10 + 10上のEBからの細胞増殖。スケールバー=100μm。 （ C ）D10 + 10 + 7上の単層細胞培養。スケールバー=100μm。 （ D ）3Dペレット培養。この数字は、以前の研究5から変更されています。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3：hiPSC-Chonペレットのキャラクタリゼーション。 （ A ）アルシアンブルー染色および（ B ）グリコサミノグリカンおよびプロテオのトルイジンブルー染色グリカン。スケールバー=100μm。 （ CおよびD ）コラーゲンIIおよびコラーゲンXの免疫組織化学。スケールバー=100μm。 （ e ）hMSC-Chon対hMSCと比較して、hiPSC、Chonペレット対hiPSC、EB、およびhiPSC-Fの生化学的特徴付け。 DNAあたりsGAG。バーは平均±SEMを表す。 N = 3、* P <0.05。この数字は、以前の研究5から変更されています。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図4：遺伝子発現解析。 hiPSC-Chon対hiPSC およびhiPSの軟骨分化マーカー（ COL2 、 COL10 、 SOX9 およびAGGRECAN ）のRT-qPCR遺伝子発現分析CFをhMSC-ChonとhMSCと比較した。バーは平均±SEMを表す。 N = 3、* P <0.05。この数字は、以前の研究5から変更されています。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、iPSCを介してPBCから軟骨細胞を生成するためのプロトコールを提供する。 PBCはより一般的であり、臨床分野で広く使用されているので、それらは再プログラムのための潜在的な代替物として提示される。この研究では、エピソームベクター（EV）を用いて、Zhang らによって確立された方法に従って、PBCをiPSCに再プログラムした。 11 。この統合のないアプローチは、臨床分野12、13で幅広い効果を持つと考えられているウイルス関連遺伝毒性を、統合関与しません。この研究における血球からのインテグレーションフリーiPSCsの生成の再プログラミング効率が満足された。末梢血2mLから30個以上のiPSCを作製することができました。したがって、PBCは、軟骨工学および他の臨床応用のためのiPSCを生成するために使用される種細胞である可能性がある。
軟骨形成分化の主要なステップEB形成、EBからの細胞増殖、単層培養および3Dペレット培養を含むhiPSCからの突然変異。未分化のhiPSCコロニーを、火をつけたガラス針を用いてより小さな断片に解剖する。機械的方法は、得られた損傷および特定のサイズ（直径50〜100μm）のために、より技術的ではあるが、酵素消化（ディスパーゼまたはコラゲナーゼなど）よりも優れている。さらに、機械的消化は、hiPSC分化を抑制するフィーダー細胞を手動で処分することができる。 hiPSCは自発的に分化してEBを形成し、これは滑らかな境界を有する三次元多細胞凝集体として特徴付けられる。いくつかのEBは、不規則な形を形成するために一緒にクラスタ化することができます。 EBを良好な状態に維持するために、10mm未満のEB形成培地を含む100mmの付着していないペトリ皿中で100個未満のEBを培養する。 1つの100mmディッシュ内に約50のEBが最良の濃度であると考えられている。次いで、EBを 10cm、ゼラチンコートディッシュを基礎培地で培養した。 EBの分布の密度は、EBの十分な増殖のために重要である。 100mm未満のEBを100mmディッシュに培養する。培養の10日以内に、線維芽細胞は徐々に増殖し、EBから増殖する。単層段階は、EBに存在する未完成の未分化細胞を排除し、間葉系統にコミットされた細胞を増殖させるために行われる。 0.5〜1×10 6細胞を、単層細胞培養のための100mmディッシュに播種する。 hiPSC-F上の細胞表面マーカーの発現を、我々の以前の研究5においてフローサイトメトリー分析によって分析した。結果は、hiPSC-Fの大部分が、陽性ヒト間葉マーカーであることが知られているCD73（81.81±2.05％）およびCD105（エンドグリン; 81.90±1.61％）を発現することを示した。さらに、6つの異なるiPSCおよび1つのヒト胚性幹細胞（ESC）が、これらの方法を再現するために使用されている。
TGF-β1とデキサメタゾンはペレット培地に補充されていますが、これらの要因は補充されています。軟骨形成潜在能力の14に有意な影響を有することが実証されている。他のプロトコルから別の違いは、その15、16。1％ITS + 10％FBSを高める一般的に報告され、1％よりもはるかに高い10％ITSの濃度でした他の方法17における軟骨形成、18。ITS血清代替物としては、軟骨細胞の増殖および形成を促進し、軟骨形成表現型を保持することができるが。FBSの動物成分を交換するために、我々は証明されているITS 10％の濃度を、アップグレード効率的に宣伝する軟骨細胞分化7 。高密度細胞培養は、軟骨分化のための別の必須因子である。このようなマイクロマス培養、他の細胞との共培養、バイオマテリアルベースの培養、及び遺伝子操作1、19、15などの軟骨形成分化を誘導するために使用することができる多くの他の細胞培養法があります。本発明者らの研究における3Dペレット培養は、高い細胞密度および高い細胞 - 細胞相互作用をもたらし、他の細胞または材料なしで実施するのがより容易である。それが15mLの遠心チューブで行われるので、小規模の軟骨形成分化アッセイでしか使用できないという制限があります。しかし、丸底を有する96ウェルプレートを有望な代替物として使用することができる7 。従って、培養方法に対する他の改良は、軟骨形成の効率を促進することができたインビトロでの分化。我々の研究では、21日間の長期間にわたる軟骨形成誘導が無血清および無添加の条件下で行われ、その間にすべての動物関連成分が除去された。したがって、我々の研究における手順は、将来の臨床応用に適応可能である。
彼らが拒絶反応を減少するだけでなく、胚発生20、21の自然経過を利用することにより、組織の再生を達成することができるだけでなく、として自家幹細胞は、軟骨修復のための理想的な選択であると考えられています。しかしながら、それらはインビトロで増殖能が制限されていることが判明した22 。したがって、iPSCを介してPBCから軟骨細胞を生成させるための統合されていない方法は、軟骨組織工学のためのより有望なアプローチであり得る。我々の方法では、軟骨欠損に必要な患者特異的軟骨細胞を誘導するには、2mLの血液で十分である可能性があるts。さらに、我々はまた、hPSCsを陽性対照として使用して、iPSCから分化した細胞と比較し、iPSCが良好な軟骨分化能を有することを示唆した。
結論として、この研究は、PBCが軟骨細胞再生の候補として使用できることを証明した。これは、再生医療に対する患者特異的かつ費用効果の高いアプローチにおいて、軟骨修復のための種細胞を生成する将来の方向性をさらに反映し得る。
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Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
著者らは彼のプラスミドについてXiaobin Zhangに感謝したい。私たちはまた、実験中に彼らの親切な助けをしてくれたShaorong GaoとQianfei Wangにも感謝します。この研究は、中国国立自然科学財団（No.81101346,81271963,81100331）、北京215高水準人材養成プロジェクト（No.2014-3-025）、北京チャオヤン病院基金（No CYXX-2017-01）、中国科学アカデミー青年イノベーション推進協会（YL）
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829018 | Basal medium used for hiPSC culture and EB formation medium |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Invitrogen | 10828028 | A more defined, FBS-free medium supplement used for hiPSC culture and EB formation medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | sh30070.03 | Used for hiPSC culture and EB formation medium,offers excellent value for cell culture |
| Nonessential amino acids | Chemicon | TMS-001-C | Used as a growth supplement in all the cell culture medium, to increase cell growth and viability |
| L-glutamine | Invitrogen | TMS-002-C | An amino acid required for cell culture |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B | A cytokine used for sustaining the pluripotency and self-renewal of hiPSCs |
| Dispase | Invitrogen | 17105041 | Used for hiPSC dissociation for subculture |
| DMEM | Gibco | C11960 | Basal medium used for MSC culture medium |
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | Used for cell attachment onto the dishes |
| 0.25% trypsin/EDTA | Gibco | 25200072 | Used for cell dissociation |
| DPBS | Gibco | 14190250 | A balanced salt solution used for cell wash or reagent preparing |
| 2-mercaptoethanol | invitrogen | 21985023 | Used as a growth supplement in all the cell culture medium. |
| ITS | invitrogen | 41400045 | Insulin, Transferrin, Selenium Solution.Used for chondrogenic differentiation. |
| Ascorbic acid | Sigma | 4403 | Known as vitamin C. It helps in active growth and has antioxidant property. |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | Added to cell culture medium as an energy source in addition to glucose. |
| Transforming growth factor-beta 1 | Peprotech | AF-100-21C | A cytokine that regulate cell proliferation, growth and chondrogenic differentiation. |
| Rabbit polyclonal antibodies against Collagen II | Abcam | ab34712 | This antibody reacts with Type II collagens,which is specific for cartilaginous tissues. |
| Mouse monoclonal antibodies to Collagen X | Abcam | ab49945 | This antibody reacts with Type X collagen,which is a product of hyperthrophic chondrotocytes. |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | For mounting and long-term storage of slides |
| Toluidine blue | Sigma | 89640 | Used for proteoglycans detection. |
| Alcian blue | Amresco | #0298 | Used for glucosaminoglycans detection. |
| Papain | Sigma | P4762-25MG | Used to digest chondrogenic pellets. |
| Dimethylmethylene blue | Sigma | 341088-1G | Used to quantitate glycosaminoglyans |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma | C4384-250MG | Used to draw the standard curve for sGAG content measurement. |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 (100) | Used to determine DNA content |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | Used for RNA isolation from cells |
| Reverse Transcriptase System | Promega | A3500 | Used to convert RNA into cDNA |
| SYBR FAST qPCR kit Master Mix | Kapa | KK4601 | Used for Real-time PCR |
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