Summary
Apresentamos um protocolo para gerar uma linhagem condrogênica de sangue periférico humano (PB) através de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando um método livre de integração, que inclui a formação de corpo embrionóide (EB), expansão de células fibroblásticas e indução condrogênica.
Abstract
Neste estudo, utilizamos células de sangue periférico (PBCs) como células de sementes para produzir condrócitos através de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) em um método livre de integração. Após a formação do corpo embrionóide (EB) e a expansão das células fibroblásticas, os iPSCs são induzidos para a diferenciação condrogênica durante 21 dias sob condições isentas de soro e sem xeno. Após a indução de condrócitos, os fenótipos das células são avaliados por análises morfológicas, imuno-histoquímicas e bioquímicas, bem como pelo exame quantitativo em PCR em tempo real de marcadores de diferenciação condrogênica. Os grânulos condrogénicos mostram coloração azul alcian e azul de toluidina positiva. A imuno-histoquímica da coloração com colágeno II e X também é positiva. O teor de glicosaminoglicano sulfatado (sGAG) e os marcadores de diferenciação condrogénica COLLAGEN 2 ( COL2 ), COLLAGEN 10 ( COL10 ), SOX9 e AGGRECAN são significativamente regulados positivamenteGrânulos rogênicos em comparação com HiPSCs e células fibroblásticas. Esses resultados sugerem que os PBCs podem ser usados como células de sementes para gerar iPSCs para o reparo da cartilagem, que é específico do paciente e econômico.
Introduction
O tecido da cartilagem tem uma capacidade muito fraca de auto-reparação e regeneração. Várias intervenções cirúrgicas e tratamentos biológicos são usados para restaurar a função da cartilagem e articulação, com resultados insatisfatórios. O desenvolvimento recente da tecnologia de células-tronco pode mudar todo o campo de reparo de cartilagem 1 . Várias células-tronco foram estudadas como células de sementes, mas as células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) parecem ser a escolha mais promissora, pois podem fornecer muitos tipos de células específicas do paciente sem causar reações de rejeição 2 . Além disso, eles podem superar a natureza proliferativa limitada das células adultas e manter suas habilidades auto-renováveis e pluripotentes. Além disso, a segmentação por genes pode ser usada para mudar o genótipo para obter tipos específicos de condrócitos.
Os fibroblastos têm sido amplamente utilizados para gerar iPSCs porque seus potenciais de reprogramação também foram bem estudados.No entanto, ainda existem algumas limitações que devem ser superadas, como a biópsia dolorosa dos pacientes e a necessidade de expansão in vitro dos fibroblastos, o que pode resultar em mutações genéticas 3 . Recentemente, os PBCs foram considerados vantajosos para a reprogramação 4 ; Além disso, eles eram comumente utilizados e armazenados abundantemente. É possível que eles possam redirecionar o foco do estudo da pele. No entanto, para o melhor de nosso conhecimento, há poucos relatórios sobre a reprogramação PBC, seguido de diferenciação em condrócitos.
No presente estudo, utilizamos PBCs como uma fonte alternativa, reprogramando-os para iPSCs e depois diferenciando os iPSCs na linhagem condrogênica através de um sistema de cultura de pelota para imitar a formação de condrócitos.
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Protocol
O protocolo para a geração de hiPSCs de PBCs pode ser encontrado em nosso estudo anterior 5 . O estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da nossa instituição.
1. Formação do corpo embrionóide (EB)
- Faça 50 mL de meio HiPSC: Meio de Eagle Modificado por Dulbecco Knockout (DMEM) suplementado com 15% de substituição sérica knockout (KSR), 5% de soro fetal bovino (FBS), 1 × aminoácidos não essenciais, 55 μM de 2-mercaptoetanol, 2 mM L -glutamina e 8 ng / mL de fator de crescimento básico de fibroblasto (bFGF).
- Faça 50 mL de meio de formação de EB: DMEM suplementado com 15% de KSR, 5% de FBS, 1x aminoácidos não essenciais, 55 μM de 2-mercaptoetanol e 2 mM de L-glutamina.
- Faça 50 mL de meio de cultura basal: DMEM suplementado com FBS a 20%, 1 aminoácidos não essenciais essenciais, 2-mercaptoetanol a 55 μM e L-glutamina 2 mM.
- Prepare 10 mL de solução dispase, 1 mg / mL em DMEM knockout.
- CultuRe HiPSCs em pratos de cultura de tecidos de 60 mm com células de alimentação ( isto é, uma monocamada de células de fibroblastos embrionárias de ratos irradiados). Quando as células são 80-90% confluentes, desassociar as células com dispase e passar os hiPSCs 1: 3 a cada 4-5 dias. Coloque as células em uma incubadora a 37 ° C e 5% CO 2 .
- Disseca as colônias indiferenciadas do hiPSC em pedaços menores (cerca de 50-100 μm de diâmetro) usando uma agulha de vidro desenhada por fogo quando os iPSCs são 80-90% confluentes. Geralmente, use colônias hiPSC em um prato de 60 mm para gerar EBs em uma placa de Petri de 100 mm.
- Cultive menos de 100 pequenos pedaços de colônias em uma placa de Petri de 100 mm, não aderente contendo 10 mL de meio de formação de EB. Coloque o prato na incubadora a 37 ° C e 5% CO 2 .
- Substitua aproximadamente 25% do meio inicial por uma quantidade igual do meio de cultura basal a cada 2 dias. Incline o prato para permitir que os EBs se assentem. Remova cuidadosamente 3 mLDo meio superior e adicione 4 mL de meio de cultura basal fresco. Não perturbe os EBs.
NOTA: Os EBs são caracterizados morfologicamente pelos pedaços de colônias, assumindo uma aparência redonda com bordas suaves sob o microscópio. - Após 10 dias de cultura na placa de Petri não aderente, revestir uma nova placa de cultura de tecidos de 100 mm com 4 mL de gelatina a 0,1% durante 30 minutos a 37 ° C antes da utilização.
- Transfira o meio mais EBs de uma placa de Petri 100 mm, não aderente, para um tubo cônico de 15 mL. Deixe os EBs sedimentar durante 4-5 min. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e deixar menos de 0,5 mL de EBs médio mais
- Semente menos de 100 EBs em um prato de cultura de tecidos revestidos com gelatina de 100 mm com 10 mL de meio de cultura basal. Coloque o prato na incubadora a 37 ° C e 5% CO 2 .
2. Formação de pellets de células e diferenciação de condrócitos
- Faça 10 mL de tripsina a 0,25% / ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Faça 80 mL de basMeio de cultura Al: DMEM suplementado com FBS a 20%, 1x aminoácidos não essenciais, 55 mM de 2-mercaptoetanol e 2 mM de L-glutamina.
- Faça 10 mL de meio de diferenciação condrogênica: DMEM (alta glicose) suplementado com 10% de solução de insulina-transferrina-selênio (ITS), 0,1xM de dexametasona, 1 mM de ácido ascórbico, 1% de piruvato de sódio e 10 ng / mL de transformação do fator de crescimento - Beta 1 (TGF-β1).
- Atualize o meio com 10 mL de meio de cultura basal após 48 h. Posteriormente, atualize a média a cada três dias com 10 mL de meio basal de cultura.
NOTA: Após 10 dias em cultura, os crescimentos celulares fibroblásticos deveriam se expandir dos EBs.- Revestir os pratos de 100 mm com 4 mL de gelatina a 0,1% durante 30 min a 37 ° C antes da utilização. Descarte o sobrenadante celular e lave as células com a solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) uma vez.
- Digite as células com 3 mL de tripsina a 0,25% / EDTA a 37 ° C durante 5 minutos e neutralize com 4 mL de meio de cultura basal.
- Dissocie as células em células individuais por pipetagem para cima e para baixo 5-10 vezes e passando-as através de uma malha de nylon de 70 μm. Centrifugue a suspensão celular a 200 xg durante 5 min. Re-semeie as células em um novo prato de cultura de tecido revestido com gelatina de 100 mm com 10 mL de meio de cultura basal.
- Atualize o meio com 10 mL de meio de cultura basal após 48 h. Posteriormente, atualize a média a cada três dias com 10 mL de meio basal de cultura.
NOTA: As células adquirem uma morfologia homogênea, semelhante a fibroblastos. - Quando ~ 90-100% de confluência é atingida ( ou seja, cerca de 5-7 dias), colher as células com 3 mL de tripsina a 0,25% / EDTA a 37 ° C durante 5 min. Neutralize com 4 mL de meio de cultura basal. Dissocie as células em células individuais por pipetagem para cima e para baixo 5 vezes. Use um hemocitômetro para contar o número da célula.
- Coloque 3 x 10 5 células em um tubo de polipropileno de 15 mL. Centrífuga a 200 xgDurante 5 minutos à temperatura ambiente (RT). Re-suspender as células em 1 mL de meio de diferenciação condrogênica.
- Re-centrifugar as células a 300 xg durante 3 min e manter as células em forma de pelotização pequena. Coloque o tubo na incubadora de 37 ° C e 5% de CO 2 por 21 dias. Não aperte bem a tampa e deixe a troca de gás.
- Substitua 3/4 do meio de cultura a cada três dias com novo meio de diferenciação condrogênica.
NOTA: Após 21 dias em cultura, os grânulos de hiPSC-condrogênicos (hiPSC-Chon) deveriam se formar. As células estaminais mesenquimais humanas (MSCs), como controle positivo, também são coletadas e cultivadas no meio de diferenciação condrogênica por 21 dias para formar pellets condrogênicos (hMSC-Chon).
3. Análise da diferenciação condrogênica
- Prepare 10 mL de 10% de formalina tampão neutro.
- Prepare 50 mL de reagente azul alciano a 0,1% e 50 mL de reagente azul de toluidina a 1%.
- PrEpare 1 mL dos anticorpos primários: anticorpos policlonais de coelho contra anticorpos monoclonais de colagénio II (1:50) ou de murganho contra colágeno X (1:50). Além disso, prepare anticorpos secundários anti-coelho ou rato.
- Faça 1 mL de solução de papaína: 10 U / mL em PBS com acetato de sódio 0,1 M, EDTA 2,4 mM e L-cisteína 5 mM.
- Faça 100 mL de solução de corante de azul de dimetilmetileno (DMMB): 100 μL de 16 mg / L de azul de 1,9-dimetilmetileno, glicina 40 mM, NaCl 40 mM e HC1 9,5 mM; PH 3.0.
- Avalie a diferenciação condrogênica por manchas azuis alcianas e azul de toluidina das seções de pelotização.
- Corrija um grânulo HiPSC-Chon ou pellet de hMSC-Chon em 1 mL de 10% de formalina tampão neutro durante 24 h.
- Transfira o grânulo para 1 mL de etanol a 70% em H 2 O. Desidralize o sedimento com 1 mL de uma série de etanol graduada ( isto é, 25, 50, 75, 90, 95, 100 e 100%, 3 min cada).
- Esclarecer o grânulo em 1 mL de 100% de xileno três vezes. InfiltratE o grânulo com parafina durante 1 h num forno a 65 ° C. Incorporar o grânulo em blocos de parafina com um molde de base de 7 x 7 x 5 mm 3 , seguindo procedimentos histológicos de rotina 6 .
- Faça seções adjacentes por microtome com uma espessura de aproximadamente 4 μm 7 . Aderir às seções em lâminas de vidro.
- Secar as lâminas por 2 h a 60 ° C num forno. Desparafine as secções em três ciclos (3 min cada) usando 100% de xileno.
- Use uma série de álcool decrescente para reidratação ( ou seja, 100, 100, 95, 95, 70, 50 e 25% em H 2 O, 3 min cada) e, em seguida, execute um enxágüe final com água desionizada durante 5 min.
- Manchar as secções com 0,1% de reagente azul alciano ou 1% de coloração com azul de toluidina durante 4-5 h e depois enxaguá-las com água destilada.
- Desidratar com uma série de etanol graduada ( isto é, 25, 50, 75, 90, 95, 100 e 100%, 3 min cada) seguido de três períodos consecutivosEps de esclarecimento em 100% de xileno. Monte os slides e visualize-os ao microscópio.
- Realizar imuno-histoquímica.
NOTA: Seções adicionais de pelota são ainda avaliadas por imuno-histoquímica.- Após a desparafinação e a reidratação, coloque as lâminas a ferver em EDTA 1 mM, pH 8,0 (impermeável em água cozida por autoclave). Deixe-os sentar durante 8 min a uma temperatura de sub-ebulição e, em seguida, deixe as lâminas arrefecer à temperatura ambiente.
- Enxaguar as lâminas com água desionizada 3 vezes. Incubar as secções em solução a 3% de H 2 O 2 em metanol à TA durante 15 min para bloquear a actividade de peroxidase endógena.
- Enxaguar as lâminas com água desionizada e mergulhá-las em DPBS durante 5 min. Aplique 50-100 μL de anticorpo primário adequadamente diluído (1:50) às secções das lâminas e depois incubri-las em uma câmara humidificada à TA durante 1 h.
- Lave os slides 3 vezes (5 min cada) com DPBS. Incube a saMills com os anticorpos secundários correspondentes ( isto é, anti-coelho ou rato) durante 15 minutos à TA.
- Lave os slides 3 vezes (durante 5 minutos cada) com DPBS. Execute a detecção DAB ao microscópio.
- Lave os slides com DPBS 3 vezes (2 min cada). Contrapona os núcleos celulares imergindo as lâminas em hematoxilina por 1-2 minutos. Desidratar com uma série de etanol graduada (25, 50, 75, 90, 95, 100 e 100%, 3 minutos cada) seguido de três etapas consecutivas de clarificação com xileno. Finalmente, monte as lâminas e visualize-as no microscópio.
- Detectar o conteúdo do sGAG.
- Digeste os grânulos condrogénicos na solução de papaína a 60 ° C durante 2 h.
- Determine o conteúdo de DNA usando o kit de análise de dsDNA e o sistema de fluorômetro. Medir o conteúdo de sGAG misturando-o com solução de corante DMMB sob a absorção de medição a 525 nm 8 .
- Calcule a concentração de sGAG contra uma curva padrão deSulfato de condroitina de tubarão.
- Execute a análise de PCR em tempo real dos marcadores de diferenciação condrogênica em grânulos de hiPSC-Chon.
- Colhe 3-4 dos mesmos grânulos condrogénicos adicionando 500 μL de reagente de extração gelada a um tubo. Vortex completamente. Incubar a amostra durante 5 minutos à TA.
- Adicione 0,1 mL de clorofórmio. Vortex a amostra por 15 s e incuba-a à TA por 3 min. Centrifugue a amostra por 15 minutos a 12.000 xg e 4 ° C. Transfira a fase aquosa superior (cerca de 250 μL) para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Adicionar 25 μL de acetato de sódio e 1 μL de glicogênio à amostra. Precipite o ARN misturando-o com 250 μL de álcool isopropílico. Homogeneizar. Incubar a amostra à TA por 10 min.
- Centrifugar durante 10 min a 12,000 xg e 4 ° C. Remova o sobrenadante completamente. Lavar a pastilha de ARN duas vezes com 500 μL de 75% de etanol.
- Centrifugar por 5 min.A 7.500 xg e 4 ° C. Remova todo o etanol sobrante e deixe secar a pastilha de ARN por 5-10 min. Dissolver o ARN em 10 μL de água livre de nuclease.
- Converta o RNA em cDNA usando um sistema de transcriptase reversa. Sujeite as amostras de cDNA para PCR em tempo real usando qPCR kit master mix (2x) e um sistema de PCR em tempo real 9 .
NOTA: As sequências do iniciador são:
H AGGRECAN -F: TCGAGGACAGCGAGGCC;
H AGGRECAN -R: TCGAGGGTGTAGCGTGTAGAGA;
H β-ACTIN -F: TTTGAATGATGAGCCTTCGTCCCC;
H β-ACTIN -R: GGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAAGC;
H COL2 -F: TGGACGATCAGGCGAAACC;
H COL2- R: GCTGCGGATGCTCTCAATCT;
H SOX9 -F: AGCGAACGCACATCAAGAC;
H SOX9 -R: CTGTAGGCGATCTGTTGGGG;
H COL10 -F: ATGCTGCCACAAATACCCTTT;
H COL10 -R: GGTAGTGGGCCTTTTATGCCT.
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Representative Results
Diferenciação condrogênica dos hiPSCs:
O meio de formação de EB e o meio de cultura basal foram utilizados para diferenciar os hiPSCs na linhagem mesenquimatosa. Foi utilizado um método de cultura de vários passos ( Figura 1 ). Primeiro, os hiPSCs foram diferenciados espontaneamente através da formação de EB por 10 dias (D10, Figura 2A ). Em segundo lugar, as células superaram os EBs por mais 10 dias (D10 + 10). Durante estes dois passos, os iPSCs perderam gradualmente suas morfologias originais e obtiveram morfologias em forma de fuso ( Figura 2B ), que depois mudaram para uma forma fibroblástica após a passagem. Em terceiro lugar, as células foram expandidas em monocamada após a subcultura ( Figura 2C ). As células indiferenciadas residuais foram excluídas durante este passo. Em seguida, as células foram expandidas e comprometidas com células fibroblásticas após5-7 dias em cultura monocamada (D10 + 10 + 7). Em quarto lugar, quando as células HiPSC-fibroblásticas (hiPSC-F) atingiram cerca de 90% de confluência, foram induzidas a se diferenciar em condrócitos através de uma cultura de pelotização 3D ( Figura 2D ) 10 .
Caracterização de pílulas HiPSC-Chon:
O hiPSC-F foi cultivado em tubos de polipropileno de 15 mL em pelota durante 21 dias. As células condrogénicas podem se montar in vitro e produzir uma matriz extracelular característica quando em cultura de alta densidade. No final da cultura, pudemos ver um agregado denso, semelhante a cartilagem, o sedimento HiPSC-Chon, que era de 2-3 mm de comprimento e 3 mm de espessura ( Figura 2D ). As células foram positivas para a coloração azul alciano ( Figura 3A ) e azul de toluidina ( Figura 3B ), que indicou o sucessoDiferenciação condrogênica de pellets de hiPSC. A análise de imuno-histoquímica para o colágeno II ( Figura 3C ) eo colágeno X ( Figura 3D ) demonstraram ainda que os grânulos HiPSC-Chon desenvolveram um fenótipo semelhante a condrócito. Os controles negativos da imuno-histoquímica para colágeno II e colágeno X foram realizados para provar melhor a coloração positiva (dados não mostrados) 5 .
A análise de sGAG também foi realizada após diferenciação condrogênica ( Figura 3E ). O conteúdo de sGAG foi detectado em grânulos HiPSC-Chon, HiPSC-F, EBs e HiPSCs indiferenciados. O conteúdo do sGAG foi significativamente regulado positivamente nos grânulos HiPSC-Chon do que nos outros grupos ( P <0,05). No controle positivo de hMSC-Chon, o conteúdo de sGAG também foi significativamente aumentado ( P <0,05) em comparação com hMSCs. Contudo, o conteúdo do sGAGEntre os grânulos de hMSC e as pastilhas HiPSC-Chon não demonstraram diferença ( P > 0,05).
Expressão genética dos marcadores de diferenciação condrogênica:
A expressão de genes dos marcadores de diferenciação para a linhagem condro-progenitor ( SOX9 e COL2 ) e condrócitos totalmente diferenciados ( AGGRECAN e COL10 ) foram utilizados para caracterizar o fenótipo dos grânulos condrogénicos ( Figura 4 ). Em comparações entre os hiPSCs, o hiPSC-F e os grânulos HiPSC-Chon, as expressões de COL2 , COL10 , SOX9 e AGGRECAN foram significativamente reguladas positivamente no hiPSC-Chon do que nos outros grupos ( P <0,05). No controle positivo de hMSC-Chon, a expressão desses marcadores também foi significativamente regulada acima do que em hMSCs ( P <0,05). No entanto, a expressão do gene entre o HMSAs pastilhas de C e os grânulos de hiPSC-Chon não demonstraram diferenças ( P > 0,05). Ao todo, esses resultados sugerem um processo de diferenciação condrogênica bem-sucedido de iPSCs humanos.
Figura 1: Visão geral esquemática do protocolo. Um método de cultura de vários passos usado para diferenciar iPSCs humanos em condrócitos, incluindo : 1) diferenciação espontânea através de formação de EB, 2) crescimento celular de EBs, 3) cultura de células monocamadas após subcultura e 4) cultura de pelotização 3D. O fenótipo de condrócitos é avaliado por análise histológica, análise bioquímica e expressão de genes condrogênicos. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Figura 2: Geração de condrócitos de hiPSCs. ( A ) formação de EB em D10. Barra de escala = 100 μm. ( B ) Crescimento celular de EBs em D10 + 10. Barra de escala = 100 μm. ( C ) Cultura celular monocamada em D10 + 10 + 7. Barra de escala = 100 μm. ( D ) cultura de pellets 3D. Este número foi modificado em nosso estudo anterior 5 . Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Figura 3: Caracterização de pelozes HiPSC-Chon. ( A ) Coloração azul Alcian e ( B ) coloração com azul de toluidina de glicosaminoglicanos e proteoGlicanos. Barra de escala = 100 μm. ( C e D ) Imuno-histoquímica para colágeno II e colágeno X. Barra de escala = 100 μm. ( E ) Caracterização bioquímica de grânulos HiPSC-Chon versus hiPSCs, EBs e hiPSC-F em comparação com hMSC-Chon versus hMSCs. SGAG por DNA. A barra representa a média ± SEM. N = 3, * P <0,05. Este número foi modificado em nosso estudo anterior 5 . Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Figura 4: Análise da expressão genética. Análise da expressão do gene RT-qPCR de marcadores de diferenciação condrogênica ( COL2 , COL10 , SOX9 e AGGRECAN ) em hiPSC-Chon versus hiPSCs e hiPSCF em comparação com hMSC-Chon versus hMSCs. A barra representa a média ± SEM. N = 3, * P <0,05. Este número foi modificado em nosso estudo anterior 5 . Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
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Discussion
Aqui, fornecemos um protocolo para gerar condrócitos de PBCs via iPSCs. Como os PBCs são mais comuns e amplamente utilizados no campo clínico, eles são apresentados como uma alternativa potencial para a reprogramação. Neste estudo, foram utilizados vetores episásicos (EV) para reprogramar PBCs em iPSCs, seguindo o método estabelecido por Zhang et al. 11 . Esta abordagem sem integração não envolve a integração da genotoxicidade associada ao vírus, que se acredita ter um efeito amplo no campo clínico 12 , 13 . A eficiência de reprogramação da geração de iPSCs sem integração de células sanguíneas neste estudo foi satisfeita. Mais de 30 iPSCs podem ser produzidos a partir de 2 mL de sangue periférico. Portanto, os PBCs têm o potencial de ser as células de sementes usadas para gerar iPSCs para engenharia de cartilagem e outras aplicações clínicas.
Os principais passos do diferencial condrogênicoA participação dos hiPSCs incluiu: formação de EB, crescimento celular de EBs, cultura de monocamada e cultura de pelotização 3D. As colônias HiPSC indiferenciadas são dissecadas em pedaços menores usando uma agulha de vidro desenhada por fogo. O método mecânico, embora mais técnico, é melhor do que a digestão enzimática (como dispase ou colagenase) devido ao dano reduzido e ao tamanho específico (50 a 100 μm de diâmetro) na aquisição. Além disso, a digestão mecânica pode descartar manualmente as células alimentadoras, o que irá reprimir a diferenciação hiPSC. Os hiPSCs se diferenciam espontaneamente para formar EBs, que são caracterizados como os agregados tridimensionais, multi-celulares com bordas lisas. Vários EBs podem se agrupar para formar formas irregulares. Para manter os EBs em boas condições, menos de 100 EBs são cultivados em uma placa de Petri de 100 mm, não aderente, com 10 mL de meio de formação de EB. Cerca de 50 EBs em um prato de 100 mm são pensados para ser a melhor concentração. Os EBs são então semeados A 10 cm, pratos revestidos com gelatina com meio de cultura basal. A densidade da distribuição de EBs é importante para a superação suficiente de EBs. Menos de 100 EBs são cultivados em um prato de 100 mm. Dentro de 10 dias de cultura, as células fibroblásticas são gradualmente superadas e expandidas a partir dos EBs. O passo monocamada é realizado para excluir células indiferenciadas residuais presentes nos EBs, bem como para expandir células comprometidas com a linhagem mesenquimatosa. 0,5-1 x 10 6 células são semeadas em um prato de 100 mm para cultura celular monocamada. A expressão de marcadores de superfície celular em hiPSC-F foi analisada por análise de citometria de fluxo em nosso estudo anterior 5 . Os resultados mostraram que a maioria do hiPSC-F expressou CD73 (81,81 ± 2,05%) e CD105 (endoglin; 81,90 ± 1,61%), que são conhecidos pelos marcadores mesenquimatosos humanos positivos. Além disso, foram utilizados seis iPSCs diferentes e uma célula-tronco embrionária humana (ESC) para reproduzir esses métodos.
A diferenciação condrogênica induzida de células pluripotentes também é um processo chave complexo. Com isso, utilizou-se meio classificante clássico para a indução de condrogênese de HiPSCs. O TGF-beta1 e a dexametasona são suplementados no meio de cultura de pelotização. Esses fatores Demonstraram ter uma influência significativa sobre as capacidades de potencial condrogênico 14. Outra diferença de outros protocolos foi a concentração de 10% ITS, que é muito maior do que o relatado tipicamente 1% ITS 15 , 16. 1% ITS mais 10% FBS aprimorado Formação de cartilagem em outros métodos 17 , 18. O ITS como um substituto do soro pode promover a proliferação e formação de condrócitos e reter os fenótipos condrogênicos. Para substituir os componentes animais do FBS, atualizamos a concentração de ITS para 10%, o que foi provado Para promover eficientementeDiferenciação de condrócitos 7 .Uma cultura celular de alta densidade é outro fator essencial para a diferenciação condrogênica. Existem muitos outros métodos de cultura celular que podem ser utilizados para induzir diferenciação condrogênica, como cultura de micromassa, co-cultura com outras células, cultura baseada em biomateriais e manipulação genética 1 , 19 , 15 . A cultura de pelotização 3D em nosso estudo, que resulta em alta densidade celular e alta interação célula-célula, é mais fácil de realizar sem outras células ou materiais. Uma vez que é realizada nos tubos de centrífuga de 15 mL, uma limitação é que ele só pode ser usado em um ensaio de diferenciação condrogênica em pequena escala. No entanto, placas de 96 poços com fundos redondos podem ser usadas como uma alternativa promissora 7 . Por conseguinte, outras melhorias nos métodos de cultura poderiam promover a eficiência dos resíduos condrogénicosDiferenciação in vitro . Em nosso estudo, a indução condrogênica durante até 21 dias foi realizada sob condição isenta de soro e sem xeno, durante a qual todos os componentes relacionados com animais foram removidos. Portanto, o procedimento em nosso estudo é adaptável para futuras aplicações clínicas.
Acredita-se que as células-tronco autólogas sejam a escolha ideal para o reparo da cartilagem, pois podem não apenas diminuir a rejeição, mas também obter a regeneração do tecido, aproveitando o curso natural do desenvolvimento embrionário 20 , 21 . Contudo, verificou-se que eles têm potencial proliferativo limitado in vitro 22 . Portanto, um método livre de integração para gerar condrócitos de PBCs via iPSCs pode ser uma abordagem mais promissora para engenharia de tecido de cartilagem. Com o nosso método, 2 mL de sangue podem ser suficientes para induzir os condrócitos específicos do paciente necessários para a defecção da cartilagemTs. Além disso, também usamos hMSCs como um controle positivo para comparar com células diferenciadas de iPSCs, o que sugeriu que os iPSCs possuem bons potenciais de diferenciação condrogênica.
Em conclusão, este estudo provou que os PBCs podem ser usados como candidatos para a regeneração de condrócitos. Isso poderia refletir ainda uma direção futura para gerar células de sementes para o reparo da cartilagem em uma abordagem específica do paciente e econômica para a medicina regenerativa.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Os autores desejam agradecer Xiaobin Zhang pelo seu plasmídeo. Também agradecemos Shaorong Gao e Qianfei Wang por sua amável ajuda durante o experimento. Este estudo é apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No.81101346, 81271963, 81100331), o projeto de talento de alto nível de Pequim 215 (No.2014-3-025) e o Fundo Hospitalar Beijing Chao-Yang (Não . CYXX-2017-01) e a Associação de Promoção da Inovação Juvenil da Academia Chinesa de Ciências (YL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829018 | Basal medium used for hiPSC culture and EB formation medium |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Invitrogen | 10828028 | A more defined, FBS-free medium supplement used for hiPSC culture and EB formation medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | sh30070.03 | Used for hiPSC culture and EB formation medium,offers excellent value for cell culture |
| Nonessential amino acids | Chemicon | TMS-001-C | Used as a growth supplement in all the cell culture medium, to increase cell growth and viability |
| L-glutamine | Invitrogen | TMS-002-C | An amino acid required for cell culture |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B | A cytokine used for sustaining the pluripotency and self-renewal of hiPSCs |
| Dispase | Invitrogen | 17105041 | Used for hiPSC dissociation for subculture |
| DMEM | Gibco | C11960 | Basal medium used for MSC culture medium |
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | Used for cell attachment onto the dishes |
| 0.25% trypsin/EDTA | Gibco | 25200072 | Used for cell dissociation |
| DPBS | Gibco | 14190250 | A balanced salt solution used for cell wash or reagent preparing |
| 2-mercaptoethanol | invitrogen | 21985023 | Used as a growth supplement in all the cell culture medium. |
| ITS | invitrogen | 41400045 | Insulin, Transferrin, Selenium Solution.Used for chondrogenic differentiation. |
| Ascorbic acid | Sigma | 4403 | Known as vitamin C. It helps in active growth and has antioxidant property. |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | Added to cell culture medium as an energy source in addition to glucose. |
| Transforming growth factor-beta 1 | Peprotech | AF-100-21C | A cytokine that regulate cell proliferation, growth and chondrogenic differentiation. |
| Rabbit polyclonal antibodies against Collagen II | Abcam | ab34712 | This antibody reacts with Type II collagens,which is specific for cartilaginous tissues. |
| Mouse monoclonal antibodies to Collagen X | Abcam | ab49945 | This antibody reacts with Type X collagen,which is a product of hyperthrophic chondrotocytes. |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | For mounting and long-term storage of slides |
| Toluidine blue | Sigma | 89640 | Used for proteoglycans detection. |
| Alcian blue | Amresco | #0298 | Used for glucosaminoglycans detection. |
| Papain | Sigma | P4762-25MG | Used to digest chondrogenic pellets. |
| Dimethylmethylene blue | Sigma | 341088-1G | Used to quantitate glycosaminoglyans |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma | C4384-250MG | Used to draw the standard curve for sGAG content measurement. |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 (100) | Used to determine DNA content |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | Used for RNA isolation from cells |
| Reverse Transcriptase System | Promega | A3500 | Used to convert RNA into cDNA |
| SYBR FAST qPCR kit Master Mix | Kapa | KK4601 | Used for Real-time PCR |
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