Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Differentierende chondrocytter fra perifert blodafledte humane inducerede pluripotente stamceller

Published: July 18, 2017 doi: 10.3791/55722
Automatic Translation
2, 1, 3, 1
1Department of Orthopedics, Beijing Chao-Yang Hospital, Capital Medical University, 2Key Laboratory of Genomic and Precision Medicine, Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences, 3Clinical and Translational Research Center of Shanghai First Maternity & Infant Hospital, School of Life Sciences and Technology, Tongji University

Summary

Vi præsenterer en protokol for at generere en chondrogen afstamning fra humant perifert blod (PB) via inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) ved hjælp af en integrationsfri metode, der omfatter embryoidlegem (EB) dannelse, ekspansion af fibroblast celler og chondrogen induktion.

Abstract

I dette studie anvendte vi perifere blodlegemer (PBC'er) som frøceller til fremstilling af chondrocytter via inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er) i en integrationsfri metode. Efter dannelse af embryoidkrop (EB) og fibroblastisk celleudvidelse induceres iPSC'erne til chondrogen differentiering i 21 dage under serumfrie og xenofri betingelser. Efter chondrocytinduktion evalueres fænotyperne af cellerne ved morfologiske, immunhistokemiske og biokemiske analyser, såvel som ved den kvantitative realtids PCR-undersøgelse af chondrogene differentieringsmarkører. De kondrogeniske pellets viser positiv alcianblåt og toluidinblåt farvning. Immunohistokemien af ​​kollagen II og X farvning er også positiv. Det sulfaterede glycosaminoglycan-indhold (sGAG) og de chondrogene differentieringsmarkører COLLAGEN 2 ( COL2 ), COLLAGEN 10 ( COL10 ), SOX9 og AGGRECAN er signifikant opreguleret i chondRogeniske pellets sammenlignet med hiPSC'er og fibroblastiske celler. Disse resultater tyder på, at PBC'er kan anvendes som frøceller til at generere iPSC'er til bruskreparation, som er patientspecifik og omkostningseffektiv.

Introduction

Bruskvæv har en meget dårlig kapacitet til selvreparation og regenerering. Forskellige kirurgiske indgreb og biologiske behandlinger bruges til at genoprette brusk og ledfunktion med utilfredsstillende resultater. Den nylige udvikling af stamcelle teknologi kan ændre hele brusk reparationsfelt 1 . Forskellige stamceller er blevet undersøgt som frøceller, men humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSC'er) synes at være det mest lovende valg, da de kan tilvejebringe mange typer af patientspecifikke celler uden at forårsage afvisningsreaktioner 2 . Desuden kan de overvinde de voksne cellers begrænsede proliferative karakter og opretholde deres selvfornyelse og pluripotente evner. Desuden kan genmålretning anvendes til at ændre genotypen for at opnå specifikke typer chondrocytter.

Fibroblaster har været meget anvendt til at generere iPSCs, fordi deres omprogrammeringspotentialer også er blevet godt undersøgt.Der er dog stadig nogle begrænsninger, der skal overvindes, såsom smertefulde biopsi fra patienter og behovet for in vitro ekspansion af fibroblasterne, hvilket kan resultere i genmutationer 3 . For nylig viste PBC'er sig at være fordelagtige til omprogrammering 4 ; Desuden blev de almindeligt udnyttet og rigeligt opbevaret. Det er muligt, at de kan omdirigere studiefokus fra huden. Men efter vores bedste viden er der få rapporter om PBC omprogrammering efterfulgt af differentiering i chondrocytter.

I den nuværende undersøgelse udnytter vi PBC'er som en alternativ kilde ved at omprogrammere dem til iPSC'er og derefter differentiere iPSC'erne i chondrogene linjer gennem et pelletkultursystem for at efterligne chondrocytdannelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollen til generering af hiPSC'er fra PBC'er findes i vores tidligere undersøgelse 5 . Undersøgelsen blev godkendt af institutionens institutionelle undersøgelsesråd.

1. Embryoid Body (EB) Formation

  1. Lav 50 ml hiPSC-medium: Knockout Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) suppleret med 15% knockout serum erstatning (KSR), 5% føtalt bovint serum (FBS), 1 x ikke-essentielle aminosyrer, 55 μM 2-mercaptoethanol, 2 mM L Glutamin og 8 ng / ml basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF).
  2. Lav 50 ml EB formationsmedium: DMEM suppleret med 15% KSR, 5% FBS, 1x ikke-essentielle aminosyrer, 55 μM 2-mercaptoethanol og 2 mM L-glutamin.
  3. Lav 50 ml basalt dyrkningsmedium: DMEM suppleret med 20% FBS, 1 x ikke-essentielle aminosyrer, 55 μM 2-mercaptoethanol og 2 mM L-glutamin.
  4. Forbered 10 ml dispasopløsning, 1 mg / ml ved uddrivning af DMEM.
  5. cultuRe hiPSC'er på 60 mm vævskulturskåle med føderceller ( dvs. et monolag af bestrålede musembryoniske fibroblastceller). Når cellerne er 80-90% konfluente, disassocierer cellerne med dispase og passerer hiPSCs 1: 3 hver 4-5 dage. Placere cellerne i en 37 ° C og 5% CO2 inkubator.
  6. Dissect de udifferentiated hiPSC kolonier i mindre stykker (omkring 50-100 μm i diameter) ved hjælp af en ildtrukne glasnål når iPSCs er 80-90% sammenflydende. Brug i almindelighed hiPSC kolonier i en 60 mm skål til at generere EB'er i en 100 mm petriskål.
    1. Kultur mindre end 100 små stykker af kolonier i en 100 mm ikke-adhærerende petriskål indeholdende 10 ml EB formationsmedium. Læg opvasken i en 37 ° C og 5% CO 2 inkubator.
  7. Udskift ca. 25% af det oprindelige medium med en lige stor mængde af det basale dyrkningsmedium hver anden dag. Kant skålen for at lade EB'erne bosætte sig. Fjern forsigtigt 3 mlAf øvre medium og tilsæt 4 ml frisk basalt dyrkningsmedium. Forstyr ikke EB'erne.
    BEMÆRK: EB'erne er morfologisk karakteriseret ved kolonistykkerne og tager et rundt udseende med glatte grænser under mikroskopet.
  8. Efter 10 dages dyrkning i den ikke-adhærente petriskål, belægge en ny 100 mm vævskulturskål med 4 ml 0,1% gelatine i 30 minutter ved 37 ° C før brug.
  9. Overfør mediet plus EB'er fra en 100 mm, ikke-klæbende petriskål til et 15 ml konisk rør. Lad EB-sedimentet i 4-5 min. Aspirer supernatanten omhyggeligt og lad mindre end 0,5 ml medium plus EB'er
  10. Sæd mindre end 100 EB'er på en 100 mm gelatinecoated vævskulturskål med 10 ml basalt dyrkningsmedium. Læg opvasken i en 37 ° C og 5% CO 2 inkubator.

2. Cellpelletdannelse og chondrocytdifferentiering

  1. Lav 10 ml 0,25% trypsin / ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA). Lav 80 ml basAlkulturmedium: DMEM suppleret med 20% FBS, 1x ikke-essentielle aminosyrer, 55 μM 2-mercaptoethanol og 2 mM L-glutamin.
  2. Lav 10 ml chondrogen differentieringsmedium: DMEM (høj glucose) suppleret med 10% insulin-transferrin-selen opløsning (ITS), 0,1 μM dexamethason, 1 mM ascorbinsyre, 1% natriumpyruvat og 10 ng / ml transformerende vækstfaktor- Beta 1 (TGF-β1).
  3. Opdater mediet med 10 ml basalt dyrkningsmedium efter 48 timer. Derefter opfriskes mediet hver tredje dag med 10 ml basalt dyrkningsmedium.
    BEMÆRK: Efter 10 dage i dyrkning, bør fibroblastiske celleudvækst have udvidet fra EB'erne.
    1. Coat 100 mm skålene med 4 ml 0,1% gelatine i 30 minutter ved 37 ° C før brug. Kassér cellesupernatanten og vask cellerne med Dulbeccos fosfatbuffede saltvand (DPBS) en gang.
    2. Fordøj cellerne med 3 ml 0,25% trypsin / EDTA ved 37 ° C i 5 minutter og neutraliser med 4 mL af basalt dyrkningsmedium.
  4. Dissocier cellerne i enkeltceller ved at pipettere op og ned 5-10 gange og passere dem gennem et 70 μm nylonnet. Centrifuge cellesuspensionen ved 200 xg i 5 minutter. Omsæt cellerne på en ny 100 mm gelatinecoated vævskulturskål med 10 ml basalt dyrkningsmedium.
  5. Opdater mediet med 10 ml basalt dyrkningsmedium efter 48 timer. Derefter opfriskes mediet hver tredje dag med 10 ml basalt dyrkningsmedium.
    BEMÆRK: Cellerne erhverver en homogen, fibroblastlignende morfologi.
  6. Når ~ 90-100% konfluens er nået ( dvs. ca. 5-7 dage), høst cellerne med 3 ml 0,25% trypsin / EDTA ved 37 ° C i 5 minutter. Neutraliseres med 4 ml basalt dyrkningsmedium. Dissocier cellerne i enkeltceller ved at pipettere op og ned 5 gange. Brug et hæmocytometer til at tælle celle nummer.
    1. Anbring 3 x 10 5 celler i et 15 ml polypropylenrør. Centrifuge ved 200 xgI 5 minutter ved stuetemperatur (RT). Suspender cellerne i 1 ml chondrogen differentieringsmedium.
  7. Centrifugere cellerne igen ved 300 xg i 3 minutter og opretholde cellerne i lille pelletform. Sætte røret ind i 37 ° C og 5% CO2 inkubator i 21 dage. Undgå at skrue låget fast og lad gasen udskifte.
  8. Udskift 3/4 af dyrkningsmediet hver tredje dag med frisk chondrogenisk differentieringsmedium.
    BEMÆRK: Efter 21 dages dyrkning skulle hiPSC-chondrogenpellets (hiPSC-Chon) have dannet sig. Humane mesenkymale stamceller (MSC'er), som en positiv kontrol, opsamles og dyrkes også i det kondrogeniske differentieringsmedium i 21 dage for at danne chondrogenpellets (hMSC-Chon).

3. Analyse af chondrogen differentiering

  1. Tilbered 10 ml 10% neutralbufret formalin.
  2. Fremstil 50 ml 0,1% alcianblue reagens og 50 ml 1% toluidinblåt reagens.
  3. prEpare 1 ml af de primære antistoffer: kaninpolyklonale antistoffer mod collagen II (1:50) eller musmonoklonale antistoffer mod collagen X (1:50). Forbered også anti-kanin eller mus sekundære antistoffer.
  4. Lav 1 ml papainopløsning: 10 U / ml i PBS med 0,1 M natriumacetat, 2,4 mM EDTA og 5 mM L-cystein.
  5. Lav 100 ml dimethylmethylenblåt (DMMB) farvestofopløsning: 100 μl 16 mg / l 1,9-dimethylmethylenblåt, 40 mM glycin, 40 mM NaCI og 9,5 mM HCI; PH 3,0.
  6. Bedøm chondrogen differentiering af alcianblå og toluidinblåt pletter af pelletsektionerne.
    1. Fastgør en hiPSC-Chon-pellet eller hMSC-Chon-pellet i 1 ml 10% neutralbufret formalin i 24 timer.
    2. Overfør pelleten til 1 ml 70% ethanol i H2O Dehydrer pelleten med 1 ml af en serie graduerede ethanolopløsninger (dvs. 25, 50, 75, 90, 95, 100, og 100%, 3 min hver).
    3. Klargør pellet i 1 ml 100% xylen tre gange. InfiltratE pelleten med paraffin i 1 time i en 65 ° C ovn. Embed pelleten i paraffinblokke med en 7 x 7 x 5 mm 3 basestøbe, efter rutinemæssige histologiske procedurer 6 .
    4. Lav tilstødende sektioner med mikrotome med en tykkelse på ca. 4 μm 7 . Hold sektionerne på glasskinner.
    5. Tør gliderne i 2 timer ved 60 ° C i en ovn. Deparaffiniser sektionerne i tre cykler (3 min hver) ved hjælp af 100% xylen.
    6. Anvende en aftagende alkohol serie for rehydrering (dvs. 100, 100, 95, 95, 70, 50, og 25% i H2O, 3 min hver) og derefter udføre en sidste skylning med deioniseret vand i 5 minutter.
    7. Sæt sektionerne med 0,1% alcianblue reagens eller 1% toluidinblåt farvning i 4-5 timer og skyll dem derefter med destilleret vand.
    8. Dehydreres med en klassificeret ethanolserie ( dvs. 25, 50, 75, 90, 95, 100 og 100%, 3 minutter hver) efterfulgt af tre på hinanden følgende stEps af præcisering i 100% xylen. Monter lysbillederne og visualiser dem under et mikroskop.
  7. Udfør immunhistokemi.
    BEMÆRK: Yderligere pelletsektioner vurderes yderligere ved immunhistokemi.
    1. Efter deparaffinisering og rehydrering bringes gliderne i kog i 1 mM EDTA, pH 8,0 (vandtæt i vand kogt af autoklav). Lad dem sidde i 8 minutter ved en underkogningstemperatur og lad derefter gliderne afkøle ved RT.
    2. Skyl diaserne med deioniseret vand 3 gange. Inkubere sektionerne i 3% H2O 2-opløsning i methanol ved stuetemperatur i 15 minutter for at blokere endogen peroxidaseaktivitet.
    3. Skyl lysrørene med deioniseret vand og dypp dem i DPBS i 5 minutter. Påfør 50-100 μl passende fortyndet (1:50) primært antistof til sektionerne på diasene og inkuber dem derefter i et befugtet kammer ved stuetemperatur i 1 time.
    4. Vask diaserne 3 gange (5 min hver) med DPBS. Inkubere saMples med de tilsvarende sekundære antistoffer ( dvs. anti-kanin eller mus) i 15 minutter ved stuetemperatur.
    5. Vask diaserne 3 gange (i 5 min hver) med DPBS. Udfør DAB-detektion under et mikroskop.
    6. Vask diaserne med DPBS 3 gange (2 min hver). Modstå cellekernerne ved at nedsænke diasene i hæmatoxylin i 1-2 minutter. Dehydratiseres med en klassificeret ethanolserie (25, 50, 75, 90, 95, 100 og 100%; 3 minutter hver) efterfulgt af tre på hinanden følgende trin med afklaring med xylen. Endelig montere diasene og visualisere dem under mikroskopet.
  8. Opdag sGAG indhold.
    1. Fordøj chondrogenpellets i papainopløsning ved 60 ° C i 2 timer.
    2. Bestem DNA-indholdet ved hjælp af dsDNA assay kit og fluorometer system. Mål sGAG-indholdet ved at blande det med DMMB-farvestofopløsning under måleabsorbans ved 525 nm 8 .
    3. Beregn koncentrationen af ​​sGAG mod en standardkurve påHaj chondroitinsulfat.
  9. Udfør realtids-PCR-analysen af ​​de chondrogeniske differentieringsmarkører i hiPSC-Chon-pellets.
    1. Harvest 3-4 af de samme chondrogenpellets ved at tilsætte 500 μl iskold ekstraktionsreagens til et rør. Vortex grundigt. Inkuber prøven i 5 minutter ved stuetemperatur.
    2. Tilsæt 0,1 ml chloroform. Vortex prøven i 15 s og inkuber den ved stuetemperatur i 3 minutter. Centrifuger prøven i 15 minutter ved 12.000 xg og 4 ° C. Overfør den øvre vandige fase (ca. 250 μl) i et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør.
    3. Tilsæt 25 μl natriumacetat og 1 μl glycogen til prøven. Præcipiter RNA'et ved at blande det med 250 μl isopropylalkohol. Bland grundigt. Inkuber prøven ved stuetemperatur i 10 minutter.
    4. Centrifuge i 10 minutter ved 12.000 xg og 4 ° C. Fjern supernatanten fuldstændigt. Vask RNA-pellet to gange med 500 μl 75% ethanol.
    5. Centrifuge i 5 minVed 7.500 xg og 4 ° C. Fjern alle rester af ethanol og lufttør RNA pellet i 5-10 minutter. Opløs RNA'en i 10 μl nukleasefrit vand.
    6. Konverter RNA'et til cDNA ved anvendelse af et revers transkriptase system. Emner cDNA-prøverne til realtid PCR ved hjælp af qPCR kit master mix (2x) og et realtids PCR-system 9 .
      BEMÆRK: Primersekvenserne er:
      H AGGRECAN -F: TCGAGGACAGCGAGGCC;
      H AGGRECAN -R: TCGAGGGTGTAGCGTGTAGAGA;
      Hβ-ACTIN- F: TTTGAATGATGAGCCTTCGTCCCC;
      Hβ-ACTIN- R: GGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAAGC;
      H COL2 -F: TGGACGATCAGGCGAAACC;
      H COL2- R: GCTGCGGATGCTCTCAATCT;
      H SOX9- F: AGCGAACGCACATCAAGAC;
      H SOX9 -R: CTGTAGGCGATCTGTTGGGG;
      H COL10 -F: ATGCTGCCACAAATACCCTTT;
      H COL10- R: GGTAGTGGGCCTTTTATGCCT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Chondrogen Differentiering af hiPSC'er:

EB-dannelsesmedium og basalt dyrkningsmedium blev anvendt til at differentiere hiPSC'erne i mesenkymalien. En multi-trin kultur metode blev brugt ( figur 1 ). For det første differentieredes hiPSC'erne spontant via EB-dannelse i 10 dage (D10; Figur 2A ). For det andet udbrød cellerne fra EB'erne i yderligere 10 dage (D10 + 10). Under disse to trin mistede iPSC'erne gradvist deres oprindelige morfologier og opnåede spindelformede morfologier ( figur 2B ), som derefter ændrede sig til en fibroblastisk form efter passage. For det tredje blev celler ekspanderet i monolag efter subkultur ( figur 2C ). Resterende udifferentierede celler blev udelukket under dette trin. Derefter blev cellerne ekspanderet og forpligtet til fibroblastisk-lignende celler efter5-7 dage i monolagskultur (D10 + 10 + 7). For det fjerde, når hiPSC-fibroblastisk-lignende celler (hiPSC-F) nåede ca. 90% sammenflydelse, blev de induceret til at differentiere i chondrocytter via en 3D-pelletskultur ( figur 2D ) 10 .

Karakterisering af hiPSC-Chon-pellets:

HiPSC-F blev dyrket i 15 ml polypropylenrør i pellet i 21 dage. Kondrogenceller kan samle in vitro og producere en karakteristisk ekstracellulær matrix, når de anvendes i høj densitetskultur. I slutningen af ​​kulturen kunne vi se et tæt, brusklignende aggregat, hiPSC-Chon-pellet, som var op til 2-3 mm langt og 3 mm tykt ( figur 2D ). Cellerne var positive for alcianblåt ( figur 3A ) og toluidinblåt ( figur 3B ) farvning, hvilket indikerede succesfasenUl chondrogen differentiering af hiPSC pellets. Immunohistokemianalyse for kollagen II ( figur 3C ) og kollagen X ( figur 3D ) viste yderligere, at hiPSC-Chon-pellets havde udviklet en chondrocytlignende fænotype. Negative kontroller af immunhistokemi for kollagen II og kollagen X blev udført for bedre at bevise den positive farvning (data ikke vist) 5 .

SGAG-analyse blev også udført efter chondrogen differentiering ( figur 3E ). SGAG-indholdet blev detekteret i hiPSC-Chon-pellets, hiPSC-F, EB'er og de utifferentierede hiPSC'er. SGAG-indholdet blev signifikant opreguleret i hiPSC-Chon-pellets end i de andre grupper ( P <0,05). I den positive kontrol af hMSC-Chon blev sGAG-indholdet også signifikant opreguleret ( P <0,05) sammenlignet med hMSC'er. Imidlertid er indholdet sGAGMellem hMSC-pellets og hiPSC-Chon-pellets viste ingen forskel ( P > 0,05).

Genekspression af chondrogene differentieringsmarkører:

Genekspression af differentieringsmarkørerne for chondro-progenitor-afstamningen ( SOX9 og COL2 ) og fuldt differentierede chondrocytter ( AGGRECAN og COL10 ) blev anvendt til at karakterisere fænotypen af ​​de kondrogeniske pellets ( figur 4 ). I sammenligninger mellem hiPSCs, hiPSC-F og hiPSC-Chon-pellets blev udtrykkene COL2 , COL10 , SOX9 og AGGRECAN signifikant opreguleret i hiPSC-Chon end i de andre grupper ( P <0,05). I den positive kontrol af hMSC-Chon blev ekspressionen af ​​disse markører også signifikant opreguleret end i hMSC'er ( P <0,05). Imidlertid er genekspression mellem hMSC-pellets og hiPSC-Chon-pellets viste ingen forskelle ( P > 0,05). I alt tyder disse resultater på en succesfuld kondrogene differentieringsproces fra humane iPSC'er.

figur 1
Figur 1: Skematisk oversigt over protokollen. En multi-trins kulturmetode, der anvendes til at differentiere humane iPSC'er til chondrocytter, herunder : 1) spontan differentiering via EB-dannelse, 2) celleudvækst fra EB'er, 3) monolagscellekultur efter subkultur og 4) 3D-pelletkultur. Chondrocytfænotypen vurderes ved histologisk analyse, biokemisk analyse og chondrogen genekspression. Klik her for at se en større version af denne figur.

"Figur Figur 2: Generering af chondrocytter fra hiPSC'er. ( A ) EB-dannelse på D10. Skalestang = 100 μm. ( B ) Celleudvæksten fra EB'er på D10 + 10. Skalestang = 100 μm. ( C ) monolagscellekultur på D10 + 10 + 7. Skalestang = 100 μm. ( D ) 3D-pelletskultur. Dette tal er blevet ændret fra vores tidligere undersøgelse 5 . Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3
Figur 3: Karakterisering af hiPSC-Chon-pellets. ( A ) Alcian blå farvning og ( B ) toluidinblåt farvning af glycosaminoglycaner og proteoglycaner. Skalestang = 100 μm. ( C og D ) Immunohistokemi for kollagen II og kollagen X. Skalestang = 100 μm. ( E ) Biokemisk karakterisering af hiPSC-Chon-pellets versus hiPSC'er, EB'er og hiPSC-F sammenlignet med hMSC-Chon versus hMSC'er. SGAG pr. DNA. Linjen repræsenterer middel ± SEM. N = 3, * P <0,05. Dette tal er blevet ændret fra vores tidligere undersøgelse 5 . Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4
Figur 4: Gene-ekspressionsanalyse. RT-qPCR-genekspressionanalyse af chondrogene differentieringsmarkører ( COL2 , COL10 , SOX9 og AGGRECAN ) i hiPSC-Chon versus hiPSC'er og hiPSCF sammenlignet med hMSC-Chon versus hMSCs. Linjen repræsenterer middel ± SEM. N = 3, * P <0,05. Dette tal er blevet ændret fra vores tidligere undersøgelse 5 . Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her giver vi en protokol til at generere chondrocytter fra PBC'er via iPSCs. Fordi PBC er mere almindeligt og bredt anvendt på det kliniske område, er de præsenteret som et potentielt alternativ til omprogrammering. I denne undersøgelse blev episomale vektorer (EV) brugt til omprogrammering af PBC'er i iPSC'er efter fremgangsmåden etableret af Zhang et al. 11 . Denne integrationsfri tilgang indebærer ikke integration af virusassocieret genotoksicitet, som antages at have en bred virkning på klinisk område 12 , 13 . Omprogrammeringseffektiviteten ved at generere integrationsfrie iPSC'er fra blodceller i dette studie var tilfreds. Mere end 30 iPSC'er kunne produceres fra 2 ml perifert blod. Derfor har PBCer potentialet til at være frøcellerne, der anvendes til at generere iPSC'er til bruskeknik og andre kliniske anvendelser.

De vigtigste trin af chondrogen differeNtiation fra hiPSC'er inkluderet: EB dannelse, celleudvækst fra EB'er, monolagskultur og 3D-pelletkultur. Ikke-differentierede hiPSC kolonier dissekeres i mindre stykker ved hjælp af en ildtrukne glasnål. Den mekaniske metode, selv om den er mere teknisk, er bedre end enzymatisk fordøjelse (såsom dispase eller collagenase) på grund af den reducerede skade og den specifikke størrelse (50-100 μm i diameter) ved anskaffelse. Desuden kan mekanisk fordøjelse manuelt bortskaffe fødercellerne, hvilket vil undertrykke hiPSC-differentieringen. HiPSC'er differentieres spontant til at danne EB'er, som er karakteriseret som de tredimensionale, multicellulære aggregater med glatte grænser. Flere EB'er kan klynge sammen for at danne uregelmæssige former. For at opretholde EB'erne under gode betingelser dyrkes mindre end 100 EB'er i en 100 mm non-adherent petriskål med 10 ml EB formationsmedium. Ca. 50 EB i en 100 mm skål anses for at være den bedste koncentration. EB'er er så podet på Til 10 cm gelatine-coatede retter med basalt dyrkningsmedium. Tætheden af ​​fordelingen af ​​EB'er er vigtig for den tilstrækkelige udbredelse af EB'er. Mindre end 100 EB'er dyrkes på en 100 mm skål. Inden for 10 dage efter dyrkning bliver fibroblastiske celler gradvist vokset og ekspanderet fra EB'erne. Monolagstrinnet udføres for at udelukke resterende udifferentierede celler, der er til stede i EB'erne, såvel som for at udvide celler forpligtet til mesenkymalien. 0,5-1 x 106 celler er podet i en 100 mm skål til monolagscellekultur. Ekspressionen af ​​celleoverflademarkører på hiPSC-F blev analyseret ved flowcytometrisk analyse i vores tidligere undersøgelse 5 . Resultaterne viste, at størstedelen af ​​hiPSC-F udtrykte CD73 (81,81 ± 2,05%) og CD105 (endoglin: 81,90 ± 1,61%), der vides at være de positive humane mesenkymmarkører. Desuden er seks forskellige iPSC'er og en human embryonal stamcelle (ESC) blevet anvendt til at reproducere disse metoder.

Ve_content "> Den inducerede chondrogene differentiering af pluripotente celler er også en kompleks nøgleproces. I lyset af dette blev klassisk chondrogen medium anvendt til induktion af chondrogenese fra hiPSC'er. TGF-beta1 og dexamethason tilsættes i pellets kulturmedium. Har vist sig at have en signifikant indflydelse på chondrogene potentielle evner 14. En anden forskel fra andre protokoller var koncentrationen på 10% ITS, hvilket er meget højere end den typisk rapporterede 1% ITS 15 , 16. 1% ITS plus 10% FBS forbedret Bruskdannelse i andre metoder 17 , 18. ITS som en serum-substituent kan fremme chondrocytproliferation og dannelse og bibeholde de chondrogeniske fænotyper. For at erstatte dyrekomponenterne i FBS, opgraderede vi koncentrationen af ​​ITS til 10%, hvilket er blevet bevist Til effektivt promoTe chondrocyt differentiering 7 .

En højdensitetscellekultur er en anden vigtig faktor for chondrogen differentiering. Der er mange andre cellekulturmetoder, der kan anvendes til at fremkalde chondrogen differentiering, såsom mikromassekultur, co-kultur med andre celler, biomaterialebaseret kultur og genetisk manipulation 1 , 19 , 15 . 3D-pelletskulturen i vores undersøgelse, som resulterer i en højcelletæthed og høj celle-celleinteraktion, er lettere at udføre uden andre celler eller materialer. Da det udføres i 15 ml centrifugerørene, er en begrænsning, at den kun kan anvendes i et lilleskala chondrogenisk differentieringsassay. 96-brøndsplader med runde bundflader kan dog bruges som et lovende alternativ 7 . Derfor kan anden forbedring af dyrkningsmetoderne fremme effektiviteten af ​​kondrogenDifferentiering in vitro . I vores undersøgelse blev den chondrogene induktion i så lang som 21 dage udført under serumfri og xenofri tilstand, hvor alle animalske relaterede komponenter blev fjernet. Derfor er proceduren i vores undersøgelse tilpasningsbar til fremtidige kliniske applikationer.

Det antages, at autologe stamceller ville være det ideelle valg til brusk reparation, da de ikke kun kan reducere afstødning, men også opnå vævregenerering ved at udnytte den naturlige udvikling af embryonal udvikling 20 , 21 . Imidlertid viste de sig at have begrænset proliferativt potentiale in vitro 22 . Derfor kan en integrationsfri metode til dannelse af chondrocytter fra PBC'er via iPSC'er være en mere lovende tilgang til bruskvævsteknik. Med vores metode kan 2 ml blod være tilstrækkeligt til at inducere de patientspecifikke chondrocytter, der er nødvendige for brusk defekts. Desuden anvendte vi også hMSC'er som en positiv kontrol til at sammenligne med celler differentieret fra iPSCs, hvilket tyder på, at iPSCs har gode chondrogene differentieringspotentialer.

Sammenfattende viste denne undersøgelse, at PBC'er kan anvendes som kandidater til chondrocytregenerering. Dette kunne yderligere afspejle en fremtidig retning for at generere frøceller til bruskreparation i en patientspecifik og omkostningseffektiv tilgang til regenerativ medicin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker at takke Xiaobin Zhang for sit plasmid. Vi takker også Shaorong Gao og Qianfei Wang for deres venlige hjælp under eksperimentet. Denne undersøgelse støttes af National Natural Science Foundation of China (No.81101346, 81271963, 81100331), Beijing 215 højtstående talentprojekt (nr.2014-3-025) og Beijing Chao-Yang Hospital Fund (nr. . CYXX-2017-01) og Youth Innovation Promotion Association af Det Kinesiske Videnskabsakademi (YL).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Knockout DMEM Invitrogen 10829018 Basal medium used for hiPSC culture and EB formation medium
Knockout Serum Replacement (KSR) Invitrogen 10828028 A more defined, FBS-free medium supplement used for hiPSC culture and EB formation medium
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone sh30070.03 Used for hiPSC culture and EB formation medium,offers excellent value for cell culture
Nonessential amino acids Chemicon TMS-001-C Used as a growth supplement in all the cell culture medium, to increase cell growth and viability
L-glutamine Invitrogen TMS-002-C An amino acid required for cell culture
Basic fibroblast growth factor (bFGF) Peprotech 100-18B A cytokine used for sustaining the pluripotency and self-renewal of hiPSCs
Dispase Invitrogen 17105041 Used for hiPSC dissociation for subculture
DMEM Gibco C11960 Basal medium used for MSC culture medium
0.1% gelatin Millipore ES-006-B Used for cell attachment onto the dishes
0.25% trypsin/EDTA Gibco 25200072 Used for cell dissociation
DPBS Gibco 14190250 A balanced salt solution used for cell wash or reagent preparing
2-mercaptoethanol invitrogen 21985023 Used as a growth supplement in all the cell culture medium.
ITS invitrogen 41400045 Insulin, Transferrin, Selenium Solution.Used for chondrogenic differentiation.
Ascorbic acid Sigma 4403 Known as vitamin C. It helps in active growth and has antioxidant property.
Sodium pyruvate Gibco 11360070 Added to cell culture medium as an energy source in addition to glucose.
Transforming growth factor-beta 1 Peprotech AF-100-21C A cytokine that regulate cell proliferation, growth and chondrogenic differentiation.
Rabbit polyclonal antibodies against Collagen II Abcam ab34712 This antibody reacts with Type II collagens,which is specific for cartilaginous tissues.
Mouse monoclonal antibodies to Collagen X Abcam ab49945 This antibody reacts with Type X collagen,which is a product of hyperthrophic chondrotocytes.
Permount Fisher Scientific SP15-100 For mounting and long-term storage of slides
Toluidine blue Sigma 89640 Used for proteoglycans detection.
Alcian blue Amresco #0298 Used for glucosaminoglycans detection.
Papain Sigma P4762-25MG Used to digest chondrogenic pellets.
Dimethylmethylene blue Sigma 341088-1G Used to quantitate glycosaminoglyans
Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage Sigma C4384-250MG Used to draw the standard curve for sGAG content measurement.
Qubit dsDNA HS assay kit Invitrogen Q32851 (100) Used to determine DNA content
TRIzol Invitrogen 15596018 Used for RNA isolation from cells
Reverse Transcriptase System Promega A3500 Used to convert RNA into cDNA
SYBR FAST qPCR kit Master Mix Kapa KK4601 Used for Real-time PCR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Diekman, B. O., et al. Cartilage tissue engineering using differentiated and purified induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (47), 19172-19177 (2012).
  2. Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
  3. Loh, Y. H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood. Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).
  4. Zhang, X. B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (5), 264-274 (2013).
  5. Li, Y., et al. Reprogramming of blood cells into induced pluripotent stem cells as a new cell source for cartilage repair. Stem Cell Res Ther. 7 (31), (2016).
  6. Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods Enzymol. 533, 225-233 (2013).
  7. Solchaga, L. A., Penick, K. J., Welter, J. F. Chondrogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells: tips and tricks. Methods Mol Biol. 698, 253-278 (2011).
  8. Oldershaw, R. A., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells toward chondrocytes. Nat Biotechnol. 28 (11), 1187-1194 (2010).
  9. Monje, L., Varayoud, J., Luque, E. H., Ramos, J. G. Neonatal exposure to bisphenol A modifies the abundance of estrogen receptor alpha transcripts with alternative 5'-untranslated regions in the female rat preoptic area. J Endocrinol. 194 (1), 201-212 (2007).
  10. Teramura, T., et al. Induction of mesenchymal progenitor cells with chondrogenic property from mouse-induced pluripotent stem cells. Cell Reprogram. 12 (3), 249-261 (2010).
  11. Su, R. J., et al. Efficient generation of integration-free ips cells from human adult peripheral blood using BCL-XL together with Yamanaka factors. PLoS One. 8 (5), e64496 (2013).
  12. Carey, B. W., et al. Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 588-598 (2011).
  13. Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31 (3), 458-466 (2013).
  14. Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
  15. Qu, C., et al. Chondrogenic differentiation of human pluripotent stem cells in chondrocyte co-culture. Int J Biochem Cell Biol. 45 (8), 1802-1812 (2013).
  16. Guzzo, R. M., Gibson, J., Xu, R. H., Lee, F. Y., Drissi, H. Efficient differentiation of human iPSC-derived mesenchymal stem cells to chondroprogenitor cells. J Cell Biochem. 114 (2), 480-490 (2013).
  17. Koyama, N., et al. Human induced pluripotent stem cells differentiated into chondrogenic lineage via generation of mesenchymal progenitor cells. Stem Cells Dev. 22 (1), 102-113 (2013).
  18. Liu, X., et al. Role of insulin-transferrin-selenium in auricular chondrocyte proliferation and engineered cartilage formation in vitro. Int J Mol Sci. 15 (1), 1525-1537 (2014).
  19. Guzzo, R. M., Scanlon, V., Sanjay, A., Xu, R. H., Drissi, H. Establishment of human cell type-specific iPS cells with enhanced chondrogenic potential. Stem Cell Rev. 10 (6), 820-829 (2014).
  20. Goepfert, C., Slobodianski, A., Schilling, A. F., Adamietz, P., Portner, R. Cartilage engineering from mesenchymal stem cells. Adv Biochem Eng Biotechnol. 123, 163-200 (2010).
  21. Ingber, D. E., et al. Tissue engineering and developmental biology: going biomimetic. Tissue Eng. 12 (12), 3265-3283 (2006).
  22. Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).

Tags

Udviklingsbiologi udgave 125 inducerede pluripotente stamceller perifert blod differentiering embryoidkrop fibroblastiske celler chondrocyt
Differentierende chondrocytter fra perifert blodafledte humane inducerede pluripotente stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, Y., Hai, Y., Chen, J., Liu, T.… More

Li, Y., Hai, Y., Chen, J., Liu, T. Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (125), e55722, doi:10.3791/55722 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter