Summary
Embriyodik vücut (EB) oluşumu, fibroblastik hücrelerin genişlemesi ve kondrojenik indüksiyonu içeren entegrasyonsuz bir yöntem kullanarak, indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) yoluyla insan periferik kandan (PB) bir kondrojenik soy oluşturmak için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Bu çalışmada, entegrasyonsuz bir yöntemle indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) yoluyla kondrosit üretmek için tohum hücreleri olarak periferik kan hücreleri (PBC'ler) kullandık. Embriyodik vücut (EB) oluşumu ve fibroblastik hücre genişlemesini takiben, iPSC'ler, serumsuz ve xeno içermeyen koşullar altında 21 gün süreyle kondrojenik farklılaşma için indüklenir. Kondrosit indüksiyonundan sonra, hücrelerin fenotipleri morfolojik, immünohistokimyasal ve biyokimyasal analizler ile kondrojenik farklılaşma belirteçlerinin kantitatif gerçek zamanlı PCR muayenesi ile değerlendirilir. Kondrojenik peletler pozitif alsi mavisi ve toluidin mavisi boyaması gösterir. Kolajen II ve X boyamasının immünohistokimyası da pozitiftir. Sülfatlanmış glikozaminoglikan (sGAG) içeriği ve kondrojenik farklılaşma belirteçleri COLLAGEN 2 ( COL2 ), COLLAGEN 10 ( COL10 ), SOX9 ve AGGRECAN , chondHiPSC'ler ve fibroblastik hücrelere kıyasla pıhtılaşmış peletler. Bu sonuçlar, PBC'lerin hastaya özgü ve maliyet-etkin olan kıkırdaklar onarımı için iPSC'ler üretmek üzere tohum hücreleri olarak kullanılabileceğini düşündürmektedir.
Introduction
Kıkırdak dokusu kendi kendine onarım ve rejenerasyon için çok zayıf bir kapasiteye sahiptir. Çeşitli cerrahi müdahaleler ve biyolojik tedaviler, kıkırdağı ve eklem işlevini yerine getirmekte, tatmin edici sonuçlarla birlikte kullanılmamaktadır. Kök hücre teknolojisinin son zamanlardaki gelişimi tüm kıkırdak onarım alanını değiştirebilir 1 . Çeşitli kök hücreleri, tohum hücre olarak incelenmiştir, ancak red reaksiyonları 2 neden olmaksızın hastanın spesifik hücrelerin çok çeşitli sağlayabilir insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSCs), en çok umut verici bir seçim olarak görünmektedir. Dahası, yetişkin hücrelerin sınırlı proliferatif özelliklerini yenebilir ve kendi kendini yenileme ve pluripotent yeteneklerini sürdürebilirler. Dahası, gen hedefleme, belirli kondrosit tiplerini elde etmek için genotipi değiştirmek için kullanılabilir.
Yeniden programlama potansiyelleri de iyi çalışıldığından, fibroblastlar iPSC'ler üretmek için yaygın olarak kullanılmaktadır.Bununla birlikte, hastalardan gelen acılı biyopsi ve fibroblastların in vitro genişlemesine duyulan ihtiyaç gibi, gen mutasyonları ile sonuçlanabilecek bazı sınırlamalar hala mevcut 3 . Son zamanlarda, PBC'lerin yeniden programlama 4 için avantajlı olduğu bulunmuştur; Dahası, bunlar sıklıkla kullanılmakta ve bol miktarda depolanmaktadır. Çalışma odağını cilden yeniden yönlendirebilirler. Bununla birlikte, en iyi bilgimize göre, kondrositlere ayrışmayı takiben PBC yeniden programlama hakkında birkaç rapor bulunmaktadır.
Mevcut çalışmada, iPSC'lere yeniden programlayarak ve daha sonra kondrosit oluşumunu taklit etmek için iPSC'leri bir pelet kültür sistemi aracılığıyla kondrojenik soyla ayırarak alternatif bir kaynak olarak PBC'leri kullanıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
PBC'lerden hiPSC üretimi için protokol önceki çalışmamızda bulunabilir 5 . Çalışma, kurumumuzun Kurumsal Değerlendirme Kurulu tarafından onaylandı.
1. Embriyoid Gövde (EB) Oluşumu
- 50 ml hiPSC ortamı yapın:% 15 nakavt serum replasmanı (KSR),% 5 sığır fetüsü serumu (FBS), 1 x gerekli olmayan amino asitler, 55 uM 2-merkaptoetanol, 2 mM L (2 mM L) içeren takviyeli Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) -glutamin ve 8 ng / mL'lik bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF).
- 50 mL EB oluşum ortamı yapın:% 15 KSR,% 5 FBS, 1x esansiyel olmayan amino asitler, 55 uM 2-merkaptoetanol ve 2 mM L-glutamin ile takviye edilmiş DMEM.
- 50 mL bazal kültür ortamı yapın:% 20 FBS, 1 x gerekli olmayan amino asitler, 55 uM 2-merkaptoetanol ve 2 mM L-glutamin ile takviye edilmiş DMEM.
- Nakavt DMEM'de 10 mL dispase solüsyonu, 1 mg / mL hazırlayın.
- CultuBesleyici hücrelerle ( yani, ışınlanmış fare embriyonik fibroblast hücrelerinin tek katmanı) 60 mm'lik doku kültürü yemekleri üzerine hiPSC'ler yerleştirin. Hücreler% 80-90 oranında birleştiğinde, hücreleri disperse ile ayırın ve 4-5 günde bir hiPSCs 1: 3'ü geçin. 37 ° C ve% 5 CO 2 inkübatör içine hücreleri yerleştirin.
- İPSC'ler% 80-90 oranında birleştiğinde ateşlenmemiş bir cam iğne kullanarak, farklılaşmamış hiPSC kolonilerini daha küçük parçalara (çap olarak yaklaşık 50-100 μm) ayırın. Genellikle, 100 mm'lik bir Petri kabında EB'ler oluşturmak için 60 mm'lik bir çanakta hiPSC kolonileri kullanın.
- 10 mL EB oluşum ortamı içeren 100 mm'lik, yapışkan olmayan bir Petri kabındaki 100'den küçük küçük koloni parçaları kültürü. 37 ° C ve% 5 CO2 inkübatör içine yemekler yerleştirin.
- Başlangıç ortamının yaklaşık% 25'ini, her 2 günde bir eşit miktarda bazal kültür ortamı ile değiştirin. EB'lerin yerleşmesine izin vermek için çanağı eğin. 3 mL dikkatle çıkarınÜst ortamdan alınır ve 4 mL taze bazal kültür ortamı ilave edilir. EB'leri rahatsız etmeyin.
NOT: EB'ler morfolojik olarak koloniler tarafından karakterize edilir, mikroskop altında pürüzsüz sınırlarla yuvarlak bir görünüm alır. - Yapışık olmayan Petri kabındaki 10 günlük kültürden sonra, kullanımdan önce 37 ° C'de 30 dakika boyunca% 0.1 jelatinli 4 mL'lik yeni bir 100 mm'lik doku kültürü kabı kaplayın.
- Orta artı EB'ler, 100 mm'lik yapışkan olmayan bir Petri kabından 15 mL'lik konik bir boruya aktarın. EB'lerin 4-5 dakika tortulmasına izin verin. Süpernatantı dikkatli bir şekilde aspire edin ve 0.5 mL'den daha az orta artı EBs bırakın
- 10 mL bazal kültür ortamı ile 100 mm, jelatin kaplı doku kültürü çanağına 100 EB'den az tohum ekildi. 37 ° C ve% 5 CO2 inkübatör içine yemekler yerleştirin.
2. Hücre Pelet Oluşumu ve Kondrosit Farklılaşması
- 10 mL% 0.25 tripsin / etilendiaminetetraasetik asit (EDTA) yapın. 80 mL bas hazırlayınAl kültür ortamı:% 20 FBS, 1x esansiyel olmayan amino asitler, 55 uM 2-merkaptoetanol ve 2 mM L-glutamin ile takviye edilmiş DMEM.
- 10 mL kondrojenik farklılaşma ortamı yapın:% 10 insülin-transferrin-selenyum çözeltisi (ITS), 0.1 uM deksametazon, 1 mM askorbik asit,% 1 sodyum piruvat ve 10 ng / mL dönüştürücü büyüme faktörü-2 ile desteklenmiş DMEM (yüksek glikoz) Beta 1 (TGF-β1).
- Ortamı, 48 saat sonra 10 mL bazal kültür ortamıyla yenileyin. Bundan sonra, ortamı her üç günde 10 mL bazal kültür ortamıyla yenileyin.
NOT: Kültürde 10 gün sonra, fibroblastik hücre büyümeleri EB'lerden genişlemiş olmalıdır.- 100 mm yemekleri, kullanımdan önce 37 ° C'de 30 dakika boyunca% 4 jelatinli 4 mL ile kaplayın. Hücrenin süpernatantını atın ve hücreleri Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzu (DPBS) ile bir kez yıkayın.
- Hücreleri 3 mL% 0.25 tripsin / EDTA ile 37 ° C'de 5 dakika boyunca sindirin ve 4 m ile nötrleştirinL bazal kültür ortamı.
- 5-10 kez pipetleme ve 70 μm'lik bir naylon örgü vasıtasıyla geçirerek hücreleri tek hücrelere ayırın. 5 dakika 200 xg'de hücre süspansiyonu santrifüjleyin. Hücreleri yeni bir 100 mm, jelatin kaplı doku kültürü çanağına, 10 mL bazal kültür ortamı ile tekrar tohumlayın.
- Ortamı, 48 saat sonra 10 mL bazal kültür ortamıyla yenileyin. Bundan sonra, ortamı her üç günde 10 mL bazal kültür ortamıyla yenileyin.
NOT: Hücreler homojen, fibroblast benzeri bir morfoloji kazanırlar. - ~% 90-100 (yani, yaklaşık 5-7 gün), 5 dakika boyunca 37 ° C'de% 0.25 tripsin / EDTA, 3 mL olan hücreler hasat ulaşıldığında. 4 mL bazal kültür ortamı ile nötralize edin. Beş kez yukarı ve aşağı pipetleme ile hücreleri tek hücrelere ayırın. Hücre sayısını saymak için bir hemositometre kullanın.
- 15 mL polipropilen tüp içine 3 x 10 5 hücre yerleştirin. 200 xg'de santrifüjleyinOda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca. Hücreleri 1 mL kondrojenik farklılaşma ortamında yeniden süspanse edin.
- Hücreleri 300 xg'de 3 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin ve hücreleri küçük pelet formunda muhafaza edin. Boruyu 37 gün ° C'de ve% 5 CO 2 inkübatöre 21 gün boyunca yerleştirin. Kapağı sıkıca vidalamayın ve gaz değişimine izin verin.
- Kültür ortamının 3 / 4'ünü her üç günde bir taze kondrojenik farklılaşma ortamı ile değiştirin.
NOT: Kültürde 21 gün sonra, hiPSC-kondrojenik pelletler (hiPSC-Chon) oluşmuş olmalıdır. Pozitif bir kontrol olarak insan mezenşimal kök hücreleri (MSC'ler) de toplanır ve kondrojenik pelet (hMSC-Chon) oluşturmak için 21 gün süreyle kondrojenik farklılaşma ortamında kültürlenir.
3. Kondrojenik Farklılaşmanın Analizi
- 10 mL% 10 nötr tamponlu formalin hazırlayın.
- 50 mL% 0.1 alcian mavi reaktif ve 50 mL% 1 toluidin mavi reaktif hazırlayın.
- PrBirincil antikorların 1 mL'si: Kollajen II'ye (1:50) karşı tavşan poliklonal antikorları veya kollajene X (1:50) karşı fare monoklonal antikorları. Ayrıca, anti-tavşan veya fare ikincil antikorları hazırlayın.
- 1 mL papain solüsyonu yapın: 0.1 M sodyum asetat, 2.4 mM EDTA ve 5 mM L-sistein ile PBS içerisinde 10 U / mL.
- 100 mL dimetilmetilen mavisi (DMMB) boya çözeltisi yapın: 100 mg 16 mg / L 1,9-dimetilmetilen mavisi, 40 mM glisin, 40 mM NaCI ve 9.5 mM HC1; PH 3.0.
- Pelet bölümlerinin alsian blue ve toluidine blue lekeleri ile kondrojenik farklılaşmayı değerlendirin.
- Bir hiPSC-Chon pelet veya hMSC-Chon pelletini 1 mL% 10 nötr tamponlu formalinde 24 saat fikse edin.
- H 2 O'de% 70 etanol 1 mL'ye pelet aktarın. Pelleti 1 mL dereceli bir etanol serisi ile ( yani, 25, 50, 75, 90, 95, 100 ve% 100, her biri 3 dakika) kurutun.
- Pelleti 1 mL% 100 ksilen içinde üç kez açıklayın. infiltreE pelet 65 ° C'lik bir fırında 1 saat boyunca parafinle yıkayın. Rutin histolojik prosedürler izlenerek pelet 7 x 7 x 5 mm 3 taban kalıp ile parafin bloklarına yerleştirilir 6 .
- Yaklaşık 4 μm'lik bir kalınlığa sahip 7 bitişik kesitleri mikrotom ile yapın. Kesitleri cam slaytlara yapıştırın.
- Slaytları fırında 60 ° C'de 2 saat boyunca kurutun. Kesitleri üç döngüde (her biri 3 dakika)% 100 ksilen kullanarak deparafinize edin.
- Rehidrasyon için azalan bir alkol serisi kullanın ( örn., H 2 O içinde 100, 100, 95, 95, 70, 50 ve 25%, her biri 3 dak.) Ve daha sonra deiyonize suyla 5 dakika boyunca son durulamayı gerçekleştirin.
- Bölümleri% 0.1 alcian mavi reaktif veya% 1 toluidin mavi boyama ile 4-5 saat boyayın ve daha sonra damıtılmış suyla yıkayın.
- Kademeli bir etanol serisi ( yani 25, 50, 75, 90, 95, 100 ve 100%, her biri 3 dak.) Ile kurutun ardından üç ardışık stEps% 100 ksilen içinde berraklaştırma. Slaytları monte edin ve onları mikroskop altında görselleştirin.
- İmmünohistokimya yapın.
NOT: Ek pellet bölümleri, immünohistokimyasal olarak daha da değerlendirilir.- Deparaffinizasyon ve rehidrasyon işleminden sonra, slaytlar 1 mM EDTA, pH 8.0'da kaynatılır (otoklav ile kaynatılan suda su geçirmezdir). Kaynama sıcaklığında 8 dakika bekletin ve slaytların oda sıcaklığında soğumasına izin verin.
- Slaytları 3 kez deiyonize su ile durulayın. Endojen peroksidaz aktivitesini bloke etmek için bölümleri oda sıcaklığında RT'de 15 dakika boyunca% 3 H 2 O 2 solüsyonunda inkübe edin.
- Slaytları deiyonize suyla durulayın ve 5 dakika süreyle DPBS'ye daldırın. Slaytlardaki kısımlara uygun şekilde seyreltilmiş (1:50) birincil antikor 50-100 μL uygulayın ve daha sonra oda sıcaklığında 1 saat boyunca nemlendirilmiş bir bölmede inkübe edin.
- Slaytları DPBS ile 3 kez (her biri 5 dakika) yıkayın. Sa'yı inkübe edinRT'de 15 dakika süreyle karşılık gelen ikincil antikorlarla ( yani, anti-tavşan veya fare) bağlantı kurun.
- Slaytları DPBS ile 3 kez (her biri 5 dakika süreyle) yıkayın. DAB algılamasını bir mikroskop altında yapın.
- Slaytları 3 kez (her biri 2 dakika) DPBS ile yıkayın. Slaytları 1-2 dakika boyunca hematoksilen içine batırarak hücre çekirdeğini karşı koyun. Kademeli bir etanol serisi (her biri 25, 50, 75, 90, 95, 100 ve% 100; her biri 3 dak.) Ile kurutun ve ardından ksilen ile üç ardışık saflaştırma aşaması uygulayın. Son olarak, slaytları monte edin ve onları mikroskop altında görün.
- SGAG içeriğini algıla.
- Papillon solüsyonunda 60 ° C'de 2 saat süreyle kondrojenik pelletleri özümleyin.
- DNA içeriğini dsDNA test kiti ve florometre sistemi kullanarak belirleyin. 525 nm'de 8 emme ölçümü altında DMG boya çözeltisi ile karıştırılarak sGAG içeriğini ölçün.
- SGAG konsantrasyonunu standart bir eğriye karşı hesaplayınKöpek balığı kondroitin sülfat.
- HiPSC-Chon pelletlerinde kondrojenik farklılaşma belirteçlerinin gerçek zamanlı PCR analizini yapın.
- Aynı kondrojenik pelletlerin 3-4'ünü, bir tüpe 500 μL buz soğukluğunda ekstraksiyon reaktifi ilave ederek hasat edin. Harca iyice girdap. Numuneyi oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
- 0.1 mL kloroform ilave edin. Numuneyi 15 saniye vorteksleyin ve oda sıcaklığında 3 dakika inkübe edin. Numuneyi 12,000 xg ve 4 ° C'de 15 dakika santrifüjleyin. Üst sulu fazı (yaklaşık 250 uL) yeni bir 1.5 mL'lik mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- Numuneye 25 μL sodyum asetat ve 1 μL glikojen ekleyin. RNA 250 μL izopropil alkol ile karıştırılarak çökeltilir. Iyice karıştırın. Numuneyi oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
- 12,000 xg'de ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı tamamen çıkarın. RNA topak iki kez% 75 etanol 500 mcL ile yıkayın.
- 5 dakika boyunca santrifüjleyin7,500 xg ve 4 ° C'de. Artık etanolü çıkarın ve RNA pelletini 5-10 dakika havayla kurutun. RNA 10 uL nükleaz içermeyen suda eritilir.
- Bir ters transkriptaz sistemi kullanarak RNA'yı cDNA'ya dönüştürün. CDNA örneklerini qPCR kit master karışımı (2x) ve gerçek zamanlı PCR sistemi 9 kullanarak gerçek zamanlı PCR'ye tabi tutun.
NOT: Primer sekanslar:
H AGGRECAN- F: TCGAGGACAGCGAGGCC;
H AGGRECAN -R: TCGAGGGTGTAGCGTGTAGAGA;
H β-ACTIN- F: TTTGAATGATGAGCCTTCGTCCCC;
H β-ACTIN -R: GGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAAGC;
H COL2 -F: TGGACGATCAGGCGAAACC;
H COL2 -R: GCTGCGGATGCTCTCAATCT;
H SOX9- F: AGCGAACGCACATCAAGAC;
H SOX9 -R: CTGTAGGCGATCTGTTGGGG;
H COL10- F: ATGCTGCCACAAATACCCTTT;
H COL10 -R: GGTAGTGGGCCTTTTATGCCT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HiPSC'lerin Kondrojenik Farklılaşması:
EB oluşum ortamı ve bazal kültür ortamı hiPSC'leri mezenkimal soy içine ayırmak için kullanıldı. Çok aşamalı bir kültür yöntemi kullanıldı ( Şekil 1 ). Birincisi, hiPSC'ler 10 gün boyunca EB oluşumu yoluyla spontan olarak ayırt edildi (D10; Şekil 2A ). İkincisi, hücreler EB'lerden 10 gün daha geriler (D10 + 10). Bu iki aşamada, iPSC'ler kademeli olarak orijinal morfolojilerini kaybetti ve iğ biçiminde morfolojiler elde etti ( Şekil 2B ), daha sonra geçişten sonra fibroblastik bir şekle dönüştü. Üçüncü olarak, hücreler, altkültürden sonra tek tabaka halinde genişletildi ( Şekil 2C ). Bu aşamada kalıntı undifferentiatlı hücreler hariç tutuldu. Ardından, hücreler genişletildi ve sonra fibroblastik benzeri hücrelere adanmıştı.Tek katmanlı kültürde 5-7 gün (D10 + 10 + 7). Dördüncülük, hiPSC-fibroblastik benzeri hücreler (hiPSC-F) yaklaşık% 90 birleşmeye ulaştığında, 3D pelet kültürü ( Şekil 2D ) 10 aracılığıyla kondrositlere ayrım yapmak üzere indüklendi.
HiPSC-Chon Peletlerinin Karakterizasyonu:
HiPSC-F, pellet içinde 15 mL polipropilen tüplerinde 21 gün süreyle kültürlendi. Kondrojenik hücreler, yüksek yoğunluklu kültürde in vitro olarak toplanabilir ve karakteristik bir hücre dışı matris üretebilir. Kültür sonunda, 2-3 mm uzunluğa ve 3 mm kalınlığa kadar olan hiPSC-Chon pelleti yoğun bir kıkırdak benzeri agregayı görebiliyorduk ( Şekil 2D ). Hücreler, alfa mavisi ( Şekil 3A ) ve toluidin mavisi ( Şekil 3B ) lekeleme için pozitifti, bu, başarıyıHiPSC pelletlerinin ul kondrojenik farklılaşması. Kollajen II ( Şekil 3C ) ve kolajen X ( Şekil 3D ) için yapılan immünohistokimyasal analiz, hiPSC-Chon pelletlerinin bir kondrosit benzeri fenotip geliştirdiğini daha da kanıtladı. Pozitif boyanmayı daha iyi kanıtlamak için kolajen II ve kollajen X için immünhistokimyasal negatif kontroller yapıldı (veriler gösterilmemiştir) ( 5) .
SGAG analizi de kondrojenik farklılaşma sonrası gerçekleştirildi ( Şekil 3E ). SGAG içeriği, hiPSC-Chon pelletleri, hiPSC-F, EBs ve farklılaşmamış hiPSC'lerde tespit edildi. SGAG içeriği, hiPSC-Chon peletlerinde diğer gruplara göre önemli derecede upregüle edilmiştir ( P <0.05). HMSC-Chon'un pozitif kontrolünde, sGAG içeriği de hMSC'lere kıyasla belirgin şekilde yükselmiştir ( P <0.05). Bununla birlikte, sGAG içeriğiHMSC peletleri ile hiPSC-Chon peletleri arasında fark görülmedi ( P > 0.05).
Kondrojenik Farklılaşma İşaretçilerinin Gen Ekspresyonu:
Kondrojenik pelletlerin fenotipini karakterize etmek için, kondro-progenitör soy ( SOX9 ve COL2 ) ve tamamen diferansiye kondrositler ( AGGRECAN ve COL10 ) için farklılaşma belirteçlerinin gen ifadesi kullanılmıştır ( Şekil 4 ). HiPSC'ler, hiPSC-F ve hiPSC-Chon pelletleri arasındaki karşılaştırmalarda, hiPSC-Chon'da COL2 , COL10 , SOX9 ve AGGRECAN ifadeleri diğer gruplara göre anlamlı derecede yükselmiştir ( P <0.05). HMSC-Chon'un pozitif kontrolünde, bu belirteçlerin ekspresyonu da hMSC'lerdekinden anlamlı derecede upregüle edilmiştir ( P <0.05). Bununla birlikte, hMSC peletleri ve hiPSC-Chon pelletleri arasında fark görülmedi ( P > 0.05). Sonuçta, bu sonuçlar, insan iPSC'lerinden başarılı kondrojenik bir farklılaşma işlemi olduğunu düşündürmektedir.
Şekil 1: Protokolün Şematik Görünümü. Alt-kültür sonrası EBS, 3) tek tabakalı hücre kültüründen EB formasyonu, 2) hücre büyümesinin ile 1) kendiliğinden farklılaşması ve 4) 3D pelet kültür: kullanılan bir çok-aşamalı kültür metodu dahil olmak üzere, kondrositlere insan iPSCs ayırt etmek. Kondrosit fenotipi histolojik analiz, biyokimyasal analiz ve kondrojenik gen ifadesi ile değerlendirilir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: hiPSC'lerden Kondrosit Üretimi. ( A ) D10 üzerinde EB oluşumu. Ölçek çubuğu = 100 μm. ( B ) EB'lerden D10 + 10'daki hücre büyümesi. Ölçek çubuğu = 100 μm. ( C ) D10 + 10 + 7'de tek katmanlı hücre kültürü. Ölçek çubuğu = 100 μm. ( D ) 3D pellet kültürü. Bu rakam önceki çalışmamızda değişiklik yapılmıştır 5 . Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: hiPSC-Chon Peletlerinin Karakterizasyonu. ( A ) Alkali mavi boyama ve ( B ) glukozaminoglikanlar ve proteinin toluidin mavisi boyamasıglikanlar. Ölçek çubuğu = 100 μm. ( C ve D ) Kollajen II ve kollajen X için immünohistokimya. Ölçek çubuğu = 100 μm. ( E ) hiPSC-Chon pelletlerinin, hMSA-Chon'la hMSC'ler karşılaştırıldığında hiPSC'ler, EB'ler ve hiPSC-F'ye karşı biyokimyasal olarak karakterizasyonu. DNA başına sGAG. Çubuk, ortalama ± SEM'i temsil eder. N = 3, * P <0.05. Bu rakam önceki çalışmamızda değişiklik yapılmıştır 5 . Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: Gen İfade Analizi. HiPSC-Chon'da hiPSC'ler ve hiPS'ler ile karşılaştırıldığında kondrojenik farklılaşma belirteçlerinin ( COL2 , COL10 , SOX9 ve AGGRECAN ) RT-qPCR gen ekspresyon analiziCF, hMSC-Chon'a karşı hMSC'lere kıyasla. Çubuk, ortalama ± SEM'i temsil eder. N = 3, * P <0.05. Bu rakam önceki çalışmamızda değişiklik yapılmıştır 5 . Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, iPSC'ler yoluyla PBC'lerden kondrosit üretmek için bir protokol sağlıyoruz. PBC'ler klinik alanda daha yaygın ve yaygın olarak kullanıldığından yeniden programlama için potansiyel bir alternatif olarak sunulmaktadır. Bu çalışmada, epidermal vektörler (EV), Zhang ve ark. Tarafından belirlenen yöntemi takiben, PBC'leri iPSC'lere yeniden programlamak için kullanıldı . 11 . Bu entegrasyon içermeyen bir yaklaşım klinik alanda 12, 13 geniş bir etkiye sahip olduğuna inanılan virüs ilişkili genotoksisiteleri, entegre içermez. Bu çalışmada kan hücrelerinden entegrasyonsuz iPSC üretmenin yeniden programlama verimliliği tatmin oldu. 2 mL periferik kandaki 30'dan fazla iPSC üretilebilir. Bu nedenle, PBC'ler, kıkırdak mühendisliği ve diğer klinik uygulamalar için iPSC'ler üretmek için kullanılan tohum hücreleri olma potansiyeline sahiptir.
Kondrojenik differe ana basamaklarıHiPSClerden kaynaklanan ntiasyon: EB oluşumu, EB'lerden hücre büyümesi, tek tabaka kültürü ve 3D pelet kültürü. Ayırt edilmemiş hiPSC kolonileri, ateşli bir cam iğne kullanılarak daha küçük parçalara ayrılır. Mekanik yöntem, daha teknik olmasına rağmen, hasarın azalması ve spesifik boyut (50 - 100 μm çap) kazanım nedeniyle enzimatik sindirimden (dispase veya kollajenaz gibi) daha iyidir. Ayrıca, mekanik sindirim hiPSC farklılaşmasını bastıracak besleyici hücreleri manuel olarak elden çıkarabilir. HiPSC'ler, pürüzsüz sınırları olan üç boyutlu, çok hücreli agregalar olarak karakterize edilen EB'leri oluşturmak için spontan olarak ayırdedilir. Birkaç EB, düzensiz şekiller oluşturmak için bir araya toplanabilir. EB'leri iyi koşullarda muhafaza etmek için, 10 mL EB oluşum ortamı ile 100 mm'den az, yapışık olmayan bir Petri kabında 100 EB'den daha az kültür yapılır. 100 mm'lik bir tabakta yaklaşık 50 EB'nin en iyi konsantrasyon olduğu düşünülmektedir. EB'ler daha sonra 10 cm, bazal kültür ortamı ile jelatin kaplı yemekler. EB'lerin dağılımının yoğunluğu, EB'lerin yeterli büyümesi için önemlidir. 100 mm'den az EB'ler 100 mm'lik bir tabla üzerine kültürlenir. Kültürden 10 gün sonra, fibroblastik hücreler aşamalı olarak büyür ve EB'lerden genişler. Tek katmanlı adım, EB'lerde bulunan artık diferansiye edilmemiş hücreleri hariç tutmak ve ayrıca mezenkimal soya bağlı hücreleri genişletmek için yapılır. 0.5-1 x 10 6 hücre tek tabakalı hücre kültürü için bir 100 mm tabak tohumlanmıştır. HiPSC-F üzerindeki hücre yüzeyi belirteçlerinin ekspresyonu önceki çalışmamızda akış-sitometrik analizle analiz edildi 5 . Sonuçlar hiPSC-F'nin çoğunluğunun, insan mezenkimal işaretçileri olarak bilinen CD73 (% 81.81 ± 2.05) ve CD105'i (endoglin;% 81.90 ± 1.61) ifade ettiğini gösterdi. Ayrıca, bu yöntemleri çoğaltmak için altı farklı iPSC ve bir insan embriyonik kök hücre (ESC) kullanılmıştır.
Ve_content "> K pluripotent hücrelerin indüklediği kondrojenik farklılaşma da karmaşık bir anahtar süreçtir Bu nedenle klasik kondrojenik ortam, hiPSC'lerden kondrojenez indüksiyonu için kullanılmıştır.TGF-beta1 ve deksametazon, pellet kültür ortamında takviye edilmiştir Bu faktörler kondrojenik potansiyel yeteneklerinin 14 üzerinde önemli bir etkiye sahip olduğu gösterilmiştir. diğer protokoller bir başka fark, 15, 16.% 1 ITS artı% 10 FBS geliştirilmiş tipik olarak rapor% 1 'den daha yüksektir,% 10 ITS konsantrasyonu, olduğu Diğer yöntemlerde kıkırdak oluşumu 17 , 18 Bir serum replasmanı olarak ITS, kondrosit çoğalmasını ve oluşumunu teşvik edebilir ve kondrojenik fenotipleri koruyabilir FBS'nin hayvan bileşenlerini değiştirmek için, ITS konsantrasyonunu% 10'a yükselttik, bu kanıtlanmıştır Etkili tanıtım yapmakKondrosit Farklılaşması 7 .Yüksek yoğunluklu bir hücre kültürü, kondrojenik farklılaşma için bir başka önemli faktördür. Mikromüzyon kültürü, diğer hücrelerle birlikte kültür, biyomalzeme esaslı kültür ve genetik manipülasyon 1 , 19 , 15 gibi kondrojenik farklılaşmayı tetiklemek için kullanılabilecek birçok hücre kültürü yöntemi vardır. Çalışmamızda yüksek hücre yoğunluğu ve yüksek hücre-hücre etkileşimi ile sonuçlanan 3D pelet kültürü, diğer hücreler veya malzemeler olmadan daha kolay gerçekleştirilebilir. 15 mL'lik santrifüj tüplerinde yapıldığı için, bir sınırlama yalnızca küçük ölçekli bir kondrojenik farklılaşma tahlilinde kullanılabilmesidir. Bununla birlikte, yuvarlak tabanları ile 96 oyuklu plakalar umut verici bir alternatif 7 olarak kullanılabilir. Bu nedenle, kültür yöntemlerine yönelik diğer iyileştirmeler, kondrojenikIn vitro farklılaşma. Çalışmamızda, 21 gün süreyle kondrojenik indüksiyon, hayvansal ilgili tüm bileşenlerin alındığı süre boyunca serumsuz ve xeno içermeyen koşullar altında yapıldı. Bu nedenle, çalışmamızdaki prosedür gelecekteki klinik uygulamalara uyarlanabilir.
Otolog kök hücreler sadece reddini azalmaz olabileceğinden kıkırdak tamiri için ideal bir seçim değil, aynı zamanda embriyonik gelişim 20, 21 doğal süreci yararlanarak doku rejenerasyonu elde edeceğini inanılmaktadır. Bununla birlikte, in vitro 22'de sınırlı proliferatif potansiyele sahip oldukları bulunmuştur. Bu nedenle, iPSC'ler yoluyla PBC'lerden kondrosit üretmek için entegrasyonsuz bir yöntem, kıkırdak doku mühendisliği için daha umut verici bir yaklaşım olabilir. Yöntemimiz ile 2 mL kan, kıkırdak defekti için gereken hastaya özgü kondrositleri indüklemek için yeterli olabilirts. Üstelik, iPSC'lerden farklı hücrelerle karşılaştırmak için hMSC'leri pozitif bir kontrol olarak kullandık ve bu da iPSC'lerin iyi kondrojenik farklılaşma potansiyelleri olduğunu düşündürdü.
Sonuç olarak, bu çalışma, PBC'lerin kondrosit yenilenmesi için aday olarak kullanılabileceğini kanıtladı. Bu, rejeneratif tıpta hastaya spesifik ve maliyet-etkin bir yaklaşımda kıkırdak tamiri için tohum hücreleri üretmek için gelecekteki bir yönü daha da yansıtabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar Xiaobin Zhang'a plasmidinden dolayı teşekkür etmek istiyorlar. Deney sırasında tür yardımları için Shaorong Gao'ya ve Qianfei Wang'a da teşekkür ediyoruz. Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81101346, 81271963, 81100331), Pekin 215 yüksek düzey yetenek projesi (No.2014-3-025) ve Pekin Chao-Yang Hastane Fonu (Yoktur) tarafından desteklenmektedir. , CYXX-2017-01) ve Çin Bilimler Akademisi (YL) Gençlik İnovasyon Tanıtım Derneği bulunmaktadır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829018 | Basal medium used for hiPSC culture and EB formation medium |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Invitrogen | 10828028 | A more defined, FBS-free medium supplement used for hiPSC culture and EB formation medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | sh30070.03 | Used for hiPSC culture and EB formation medium,offers excellent value for cell culture |
| Nonessential amino acids | Chemicon | TMS-001-C | Used as a growth supplement in all the cell culture medium, to increase cell growth and viability |
| L-glutamine | Invitrogen | TMS-002-C | An amino acid required for cell culture |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B | A cytokine used for sustaining the pluripotency and self-renewal of hiPSCs |
| Dispase | Invitrogen | 17105041 | Used for hiPSC dissociation for subculture |
| DMEM | Gibco | C11960 | Basal medium used for MSC culture medium |
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | Used for cell attachment onto the dishes |
| 0.25% trypsin/EDTA | Gibco | 25200072 | Used for cell dissociation |
| DPBS | Gibco | 14190250 | A balanced salt solution used for cell wash or reagent preparing |
| 2-mercaptoethanol | invitrogen | 21985023 | Used as a growth supplement in all the cell culture medium. |
| ITS | invitrogen | 41400045 | Insulin, Transferrin, Selenium Solution.Used for chondrogenic differentiation. |
| Ascorbic acid | Sigma | 4403 | Known as vitamin C. It helps in active growth and has antioxidant property. |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | Added to cell culture medium as an energy source in addition to glucose. |
| Transforming growth factor-beta 1 | Peprotech | AF-100-21C | A cytokine that regulate cell proliferation, growth and chondrogenic differentiation. |
| Rabbit polyclonal antibodies against Collagen II | Abcam | ab34712 | This antibody reacts with Type II collagens,which is specific for cartilaginous tissues. |
| Mouse monoclonal antibodies to Collagen X | Abcam | ab49945 | This antibody reacts with Type X collagen,which is a product of hyperthrophic chondrotocytes. |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | For mounting and long-term storage of slides |
| Toluidine blue | Sigma | 89640 | Used for proteoglycans detection. |
| Alcian blue | Amresco | #0298 | Used for glucosaminoglycans detection. |
| Papain | Sigma | P4762-25MG | Used to digest chondrogenic pellets. |
| Dimethylmethylene blue | Sigma | 341088-1G | Used to quantitate glycosaminoglyans |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma | C4384-250MG | Used to draw the standard curve for sGAG content measurement. |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 (100) | Used to determine DNA content |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | Used for RNA isolation from cells |
| Reverse Transcriptase System | Promega | A3500 | Used to convert RNA into cDNA |
| SYBR FAST qPCR kit Master Mix | Kapa | KK4601 | Used for Real-time PCR |
References
- Diekman, B. O., et al. Cartilage tissue engineering using differentiated and purified induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (47), 19172-19177 (2012).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Loh, Y. H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood. Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).
- Zhang, X. B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (5), 264-274 (2013).
- Li, Y., et al. Reprogramming of blood cells into induced pluripotent stem cells as a new cell source for cartilage repair. Stem Cell Res Ther. 7 (31), (2016).
- Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods Enzymol. 533, 225-233 (2013).
- Solchaga, L. A., Penick, K. J., Welter, J. F. Chondrogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells: tips and tricks. Methods Mol Biol. 698, 253-278 (2011).
- Oldershaw, R. A., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells toward chondrocytes. Nat Biotechnol. 28 (11), 1187-1194 (2010).
- Monje, L., Varayoud, J., Luque, E. H., Ramos, J. G. Neonatal exposure to bisphenol A modifies the abundance of estrogen receptor alpha transcripts with alternative 5'-untranslated regions in the female rat preoptic area. J Endocrinol. 194 (1), 201-212 (2007).
- Teramura, T., et al. Induction of mesenchymal progenitor cells with chondrogenic property from mouse-induced pluripotent stem cells. Cell Reprogram. 12 (3), 249-261 (2010).
- Su, R. J., et al. Efficient generation of integration-free ips cells from human adult peripheral blood using BCL-XL together with Yamanaka factors. PLoS One. 8 (5), e64496 (2013).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 588-598 (2011).
- Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31 (3), 458-466 (2013).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
- Qu, C., et al. Chondrogenic differentiation of human pluripotent stem cells in chondrocyte co-culture. Int J Biochem Cell Biol. 45 (8), 1802-1812 (2013).
- Guzzo, R. M., Gibson, J., Xu, R. H., Lee, F. Y., Drissi, H. Efficient differentiation of human iPSC-derived mesenchymal stem cells to chondroprogenitor cells. J Cell Biochem. 114 (2), 480-490 (2013).
- Koyama, N., et al. Human induced pluripotent stem cells differentiated into chondrogenic lineage via generation of mesenchymal progenitor cells. Stem Cells Dev. 22 (1), 102-113 (2013).
- Liu, X., et al. Role of insulin-transferrin-selenium in auricular chondrocyte proliferation and engineered cartilage formation in vitro. Int J Mol Sci. 15 (1), 1525-1537 (2014).
- Guzzo, R. M., Scanlon, V., Sanjay, A., Xu, R. H., Drissi, H. Establishment of human cell type-specific iPS cells with enhanced chondrogenic potential. Stem Cell Rev. 10 (6), 820-829 (2014).
- Goepfert, C., Slobodianski, A., Schilling, A. F., Adamietz, P., Portner, R. Cartilage engineering from mesenchymal stem cells. Adv Biochem Eng Biotechnol. 123, 163-200 (2010).
- Ingber, D. E., et al. Tissue engineering and developmental biology: going biomimetic. Tissue Eng. 12 (12), 3265-3283 (2006).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
