다중 전극 어레이에서 배양 된 마우스 신경 세포는 전기적 자극 후 반응의 증가를 나타낸다. 이 프로토콜은 뉴런을 배양하는 방법, 활동을 기록하는 방법, 자극 패턴에 반응하도록 네트워크를 훈련시키는 프로토콜을 수립하는 방법을 보여줍니다.
마이크로 전극 배열 (MEAs)은 약물 독성, 차세대 맞춤 의학을위한 디자인 패러다임을 연구하고, 연결 문화에서 네트워크 역학을 연구하는데 사용될 수 있습니다. 단일 세포에서 활동 만 기록 할 수있는 패치 클램핑과 같은 기존의 방법과 달리 MEA는 각 전극을 개별적으로 배치하는 힘든 작업을 수행하지 않고도 네트워크의 여러 사이트에서 동시에 기록 할 수 있습니다. 더욱이, 수많은 제어 및 자극 구성을 동일한 실험 설정 내에서 쉽게 적용 할 수 있으므로 광범위한 역학을 탐구 할 수 있습니다. 이러한 시험 관내 연구에 대한 주요 역학 중 하나는 배양 된 네트워크가 학습을 나타내는 특성을 나타내는 범위였습니다. MEA에서 배양 된 마우스의 신경 세포는 전기적 자극에 의해 유도 된 훈련 후 반응의 증가를 나타낸다. 이 프로토콜은 MEA에서 신경 세포를 배양하는 방법을 보여줍니다. 성공적으로 다시도금 된 접시의 95 % 이상에서 코드; 자극 패턴에 반응하도록 네트워크를 훈련시키는 프로토콜을 수립한다. 그러한 실험의 결과를 정렬, 플롯 및 해석합니다. 신경 세포 배양을 자극하고 기록하기위한 독점 시스템의 사용이 입증되었습니다. 소프트웨어 패키지는 또한 연결 단위를 정렬하는 데 사용됩니다. 맞춤형 그래픽 사용자 인터페이스는 자극 후 시간 히스토그램, 인터 버스트 간격 및 버스트 지속 시간을 시각화하고 훈련 프로토콜 전후의 자극에 대한 세포 반응을 비교하는 데 사용됩니다. 마지막으로,이 연구 노력의 대표 결과 및 향후 방향에 대해 논의한다.
Micro-electrode arrays (MEAs)는 약물 독성, 차세대 맞춤 의학을위한 디자인 패러다임을 연구하고, 연결 문화에서 네트워크 역학을 연구하는 데 사용할 수 있습니다 1 . 단일 세포에서의 활동 만 기록 할 수있는 패치 클램핑 (patch-clamping)과 단일 장소에서 전극을 둘러싸고있는 뉴런의 세포 외 반응을 기록 할 수있는 유리 피펫으로 필드 기록 (record recording)과 같은 전통적인 방법과 대조적으로 MEA는 동시에 각 전극을 개별적으로 배치하는 힘든 작업을하지 않고도 세포 배양의 여러 사이트에서 기록 할 수 있습니다. 이를 통해 해당 문화권 내에서 네트워크를 형성하는 세포 그룹 간의 동적 상호 작용을 연구 할 수 있습니다. 또한, 네트워크 소성 패턴 2 , 3 , 4 , 5 및 네트워크 제어 6 에 대한 전기 자극의 효과 </ sup>는 잘 설명되어 있으며, 동일한 실험 설정 내에서 다양한 전기 자극 및 제어 구성을 쉽게 적용 할 수 있으므로 광범위한 시공간 역학을 탐구 할 수 있습니다.
이러한 시험 관내 연구에 대한 주요 역학 중 하나는 배양 된 네트워크가 학습 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13을 나타내는 속성을 나타내는 정도였습니다. Peixoto Lab은 이전에 Ruaro et al. 에 설명 된대로 고주파 훈련 신호의 영향을 조사했습니다 . 14 , microelectrode 배열에 도금 마우스 뉴런의 네트워크에. 이 실험에서 네트워크는 응답의 증가g 전기 자극에 의해 유발 된 훈련. 증가 된 반응은 자극 인식을 통한 학습의 한 형태로 간주되어 네트워크가 특정 자극 ( 예 : 훈련) 프로토콜을 적용한 후 자극의 변화에 일관된 방식으로 응답했습니다.
이 프로토콜은 MEA에서 연결 세포를 배양하고 도금 된 접시의 95 % 이상에서 성공적으로 기록하고, 자극 패턴, 단일 단위 활동 정렬, 플롯 히스토그램에 응답하도록 네트워크를 훈련하는 프로토콜을 확립하고 결과를 해석하는 방법을 보여줍니다. 그러한 실험. 신경 세포 배양의 자극과 기록을위한 독점 시스템 ( Table of Materials 참조)의 사용뿐만 아니라 소프트웨어 패키지 ( Table of Materials 참조)를 사용하여 신경 단위를 분류 할 수 있습니다. 맞춤형 그래픽 사용자 인터페이스 (재료 표 참조)를 사용하여 포스트 S를 시각화합니다.시간 간격 히스토그램, 인터 – 버스트 간격 및 버스트 지속 시간뿐만 아니라 훈련 프로토콜 전후에 자극에 대한 세포 반응을 비교할 수 있습니다.
이 프로토콜에 설명 된 단계는 초보자가 MEA에서 자신의 연결 문화를 판명하고 네트워크 활동을 기록 할 수 있도록 충분한 세부 정보를 제공합니다. 이 프로토콜은 문화가 전극 배열 위에 세포의 양탄자 층을 형성하고, 건강을 유지하고 몇 달 동안 오염 물질이 없도록 적절하게 부착하는 것을 보장합니다.
프로토콜의 모든 부분을 준수하는 것이 가장 좋지만 성공적인 결과에 중요한 단계가 프로세스 전반에 걸쳐 있습니다. 배양 물이 오염되는 것을 막기 위해서는 전체 공정에 걸쳐 무균 기술을 사용해야합니다. 프로토콜에 설명 된대로 새로운 MEA를 친수성으로 만들어야합니다. 그렇지 않으면 세포 접착력이 떨어집니다. 가혹한 피펫 팅을 피하고 해리 중에 공기 방울이 형성되면 손상된 세포의 수가 줄어들어 더 높고 더 건강한 수율로 이어질 것입니다. 첫 번째 이후 DMEM 5/5에서 DMEM +로 전환먹이는 것도 중요합니다. DMEM 5/5에는 말 혈청이 포함되어있어 지속적으로 사용하면 신경 교세포가 배양을 지배하게되어 문화가 건강 해 보일지라도 열악한 신경 세포 활동을 초래합니다. 예정대로 배양액을 공급하고 적절한 배양 조건에서 배양하는 것도 중요합니다.
MEA에서 세포 배양 판을 만드는 것은 최적의 결과가 아닌 결과를 가져올 수있는 많은 변수를 포함합니다. 목표가 세포의 완벽한 "양탄자"이지만, 위에 언급 된 중요한 단계를 해결하지 못하면 세포 성숙이 불량 해지거나 오염 될 수 있습니다. 가난한 세포 성숙과는 다른 세포 접착력이 나쁘다는 것도 관심사입니다. 이것은 도금 이전의 불량한 MEA 준비 또는 오래된 매체의 사용을 포함하는 여러 요인들로 인해 발생할 수 있습니다. 안정화 된 형태의 L- 글루타민과 혈청이없는 신경 세포 배양액을 함유 한 오래된 배지 ( 물질 표)가 사용되면, 세포는 처음에 붙지 만 약 2 주 후에 떠 다니게됩니다. 세균 오염이 지속적으로 문제가된다면 암피실린이나 펜 렙틴과 같은 항생제를 배지에 첨가 할 수 있습니다. 곰팡이 오염을 치료할 수있는 살균제도 있습니다. 이것들은 문화적 결과에 영향을 줄 수있는보다 일반적인 변수입니다. 시간과 경험 후에 만 만날 수있는 많은 다른 것들이 있습니다.
유리 미세 전극의 사용과 비교하여,이 기법은 네트워크 역학 및 약리학 적 반응을 연구하는데 탁월합니다. 그것은 많은 다른 시공간 자극 패턴의 사용을 가능하게하고 동시에 여러 영역에서의 신경 반응을 기록 할 수있게합니다. 이전 그룹은 여기에 설명 된 것과 유사한 프로토콜을 사용하여 흥미로운 결과를 보여주었습니다 18 . 문화가 몇 주 또는 몇 달 동안 지속되고 동일한 문화가 재사용 될 수 있기 때문에이 기술은 또한동일한 네트워크에서 여러 실험을 반복합니다.
그러나이 기술에는 한계가 있습니다. MEA는 비 침습적입니다. 따라서 패치 클램핑이나 피펫을 사용한 세포 내 기록과는 달리 세포 외 활동 만 기록 할 수 있습니다. 또한, 배열의 각 전극은 여러 개의 세포로 덮여 있기 때문에 단일 뉴런의 활동을 해결할 수 없습니다. 반대로 이것들은 시험 관내 배양 물이기 때문에 뇌에서의 네트워크의 구조적 특성을 완전히 재현 할 수는 없습니다. 또한, 세포가 pH 균형을 유지할 수 있도록 CO 2 대기를 제공하는 메커니즘없이 한 번에 30 분 이내에 만 활동을 기록 할 수 있습니다.
일단이 기술이 숙달되면, 전기 자극이 있거나없는 약리학 적 조작이 탐구 될 수 있습니다. 뉴런 네트워크에서 학습과 기억 형성을 탐색하기위한 새로운 프로토콜을 설계하고 테스트 할 수 있습니다.hippocampal 또는 척수 네트워크에 대한 rotoci. 네트워크의 자극과 훈련을위한 프로토콜은 이미 발표되었으며, 그 중 일부는 Eytan et al.이 제안한 "선택적 적응"과 같은 생체 내 프로토콜로 추가 개발 되었다. 19 . 여러 프로토콜이 테스트되었습니다. 그러나 2005 년 루아로 (Ruaro)가 제안한 파상풍 치료법을 수정 한 결과 만이 여기에 제시되어있다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 국립 과학 재단 보조금 CMMI – 1300007에 의해 재정 지원되었다. 우리는 조지 메이슨 대학교 (George Mason University)에서 이러한 프로토콜의 설계 및 문화 유지에 도움을 주신 이전 연구원들에게 감사드립니다. Joseph J. Pancrazio 박사, Hamid Charkhkar 박사, Gretchen Knaack 박사 , Franz Hamilton 박사, Michael Maquera 박사, Robert Graham 박사.
Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4403 | Make 4mg/mL aliquots |
B-27 | Invitrogen | 17504-044 | Serum-free supplement for neural cell culture. Make 1 mL aliquots and freeze |
Beakers – glass – 100 mL | VWR | 13912-160 | |
Beakers – glass – 500 mL | VWR | 10754-956 | |
Blunt-tipped thumb forceps | World Precision Instruments | 500365-G | |
Cryogenic vial – sterile, 2 mL | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
Cryogenic vial – sterile, 5 mL | Fisher Scientific | 10-500-27 | |
DMEM with Glutamax | Gibco Life Technology | 10569-010 | Cell culture media that contains a stabilized form of L-glutamine |
DNase | Worthington Biochemical | LK003172 | |
Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
Fetal bovine serum (FBS) | ATCC | 30-2030 | |
Fine-tipped thumb forceps | World Precision Instruments | 501324-G | |
Glass Pipets | VWR | 14673-010 | |
GlutaMAX — I (100X) | Gibco Life Technology | 35050-061 | A stabilized form of L-glutamine used as a suplement |
Hemocytometer chip | Fisher Scientific | 22-600-101 | |
Hibernate EB complete | BrainBits | D00118 | Ambient CO2 cell storage media |
Horse Serum | Atlanta Biologicals | S12195H | |
Laminin | Sigma Aldrich | L2020-1MG | |
MCS filter amplifier | MultiChannel System | FA60SBC | |
MCS headstage/pre-amplifier | MultiChannel System | MEA1060-INV | |
MCS microelectrode array | MultiChannel System | 60MEA200/10iR-ITO | |
MCS power supply | MultiChannel System | PS20W | |
MCS signal divider | MultiChannel System | SDMEA | |
MCS stimulus generator | MultiChannel System | STG4002 | |
MCS temperature controller | MultiChannel System | TC02 | |
Media storage bottle – glass 500 mL | VWR | 10754-818 | Autoclave |
Microcentrifuge tubes – 0.4 mL | Thermo Fisher | 3485 | Autoclave |
Microcentrifuge tubes – 2 mL | Thermo Fisher | 3434ECONO | Autoclave |
Micropipette tips – 10 uL | VWR | 37001-166 | Autoclave |
Micropipette tips – 1000 uL | VWR | 13503-464 | Autoclave |
Micropipette tips – 200 uL | VWR | 37001-596 | Autoclave |
Micropipetter – 10 uL | Thermo Fisher | 4641170N | |
Micropipetter – 1000 uL | Thermo Fisher | 4641210N | |
Micropipetter – 200 uL | Thermo Fisher | 4641230N | |
Papain – 0.22 Filtered | Worthington Biochemical | LK003178 | |
Penicillin-Streptomycin (Pen Strep) | Thermo Fisher | 15070063 | |
Petri dishes -100mm disposable | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
Petri dishes -100mm glass | VWR | 10754-788 | |
Petri dishes -35 mm | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
Phosphate buffer saline (PBS) (1X) | Corning | 21-040-CV | |
Plasma Cleaning System | Plasma Etch, Inc. | PE-50 | |
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma Aldrich | P6407-5MG | |
Polyethylene conical (centrifuge) tube -15 mL | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
Polypropylene conical (centrifuge) tube -50 mL | Falcon | 352070 | |
Procedure masks | Imco | 1530-imc | |
Pyruvate | Sigma Aldrich | P4562-5G | |
Scalpel blades | World Precision Instruments | 500237-G | |
Scissors – iris | World Precision Instruments | 14111-G | |
Scissors – large | World Precision Instruments | 14214 | |
Scissors – small surgical | World Precision Instruments | 501733-G | |
Serological pipette – sterile, 1 mL | VWR | 89130-892 | |
Serological pipette – sterile, 2 mL | VWR | 89130-894 | |
Serological pipette – sterile, 25 mL | VWR | 89130-900 | |
Serological pipette – sterile, 50 mL | VWR | 89130-902 | |
Software: Matlab GUI | Peixoto Lab | npeixoto@gmu.edu | Used to analyze .mat files. Available for free upon request. Contact npeixoto@gmu.edu to request a copy. |
Software: MCS MC_Rack | MultiChannel System | N/A | Used for data acquisition |
Software: NeuroExplorer | Plexon | http://www.plexon.com/products/neuroexplorer | Used to convert .nex files to .mat |
Software: Offline Sorter | Plexon | http://www.plexon.com/products/offline-sorter | Used to sort neural spikes and convert data files to .plx and then to .nex |
Software Manual: MCS MC_Rack | MultiChannel System | https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/MC_Rack_Manual.pdf | |
Software Manual: NeuroExplorer | Plexon | https://www.neuroexplorer.com/downloads/Nex3Manual.pdf | |
Software Manual: Offline Sorter | Plexon | www.plexon.com/system/files/downloads/Offline%20Sorter%20v2.8%20Manual.pdf | |
Spatula – small double-ended | World Precision Instruments | 503440 | |
Stericup 0.22 µm pore filter – 250 mL | Millipore | SCGVU02RE | |
Transfer pipette – large bore | Thermo Fisher | 335-1S | |
Transfer pipette – small bore | Thermo Fisher | 242-1S | |
Trypan blue | Sigma Aldrich | T8154-20ML | |
Whatman filter paper | Whatman | 1442 150 | Cut into 8 pie wedges and autoclave in a glass Petri dish |