在这里,我们提出了一种立体学方法,光学分级器,用于量化新的神经元的形成,以及它们的生存,在大脑海马中的电惊厥刺激。当正确实施时,立体感方法的灵敏度和效率确保了具有固定和预定精度的精确估计。
设计立体方法来描述定量参数,而不对细胞或结构的大小,形状,取向和分布进行假设。这些方法对于哺乳动物脑的定量分析是革命性的,其中体积细胞群体太高而不能手动计数,立体定向是当需要从二维测量中提取三维量的估计时的选择技术部分。所有的立体观念原则上都是无偏见的;然而,它们依赖于关于感兴趣结构和组织特征的适当知识。立体学是基于系统统一随机抽样(SURS),将抽样调整到精确度最有效的水平,提供关于整个兴趣结构的可靠的定量信息。在这里,我们提供光学分级器与BrdU免疫组织化学t结合o估计电惊厥刺激后大鼠海马颗粒细胞层(包括亚颗粒区)中新形成的神经元的生成和存活,这是神经发生最有效的刺激物。光学分馏器技术被设计为提供从全部结构采样的厚部分中的细胞总数的估计。厚部分提供了观察细胞在其3-D范围内的机会,从而允许基于形态学标准的容易和鲁棒的细胞分类。当正确实施时,光学分馏器的灵敏度和效率提供了固定和预定精度的精确估计。
三维(3-D)结构中的细胞的定量可能需要基于无偏的原理获得估计。即使在今天,研究也经常使用二维(2-D)方法来报告三维结构的数据。然而,这些方法在细胞的形状和分布方面不考虑结构的异质性,导致有限的限制;他们对3-D兴趣结构做出假设,结果并不是指完整的结构。这些限制降低了方法的灵敏度和准确性,并增加了错误的风险1 。
细胞计数中的偏差可以通过应用基于设计的立体学来避免,这对于获得关于给定组织或结构中的细胞数量的定量信息是非常重要的。 虽然立体学以前是一个非常耗时的方法,程序的进步,软器具和成像,使其变得更加高效和广泛适用。立体学需要统计抽样原理和随机几何理论,以提供有效的工具,用于通过2维部分2中的抽样来估计三维结构中的体积,表面积,长度和物体数量。因此,立体学允许人们获得关于组织切片结构变化的无偏量化数据,这些数据给出了真实数据的平均估计,无需详尽的分析1 。立体学定义为采样信息中几何参数的统计推断。这可以通过公正的抽样来实现,也就是说系统的随机抽样,以及计数规则,确保所有对象具有相等的概率被计算3 。虽然立体结果可能具有不同程度的精度,如误差系数(CE)所示,这可以是广告通过根据需要调整采样量4,5 ,适合于固有生物方差(方差系数(CV))。以前的几个立体学研究已经研究了电惊厥刺激(ECS)对啮齿动物的海马可塑性的短期影响。来自这些研究的数据显示,在重复的ECS之后神经元总数以及突触分化升高的初始增加。然而,这些研究不直接估计神经发生,因为它们不使用特异性标志物进行细胞增殖。
在这里,我们提出一种立体方法的应用,光学分级技术8,9用于量化大鼠海马颗粒细胞层(GCL)中新形成的神经元的总数,包括亚颗粒区(SGZ)以及作为他们的长期urvival 10,11 。我们对大鼠进行ECS临床相关时间表(每周三次,持续3周),这是神经发生最有效的刺激物之一12 。使用相同的程序治疗对照动物,但不通过电流。在21天的实验中,在细胞分裂期间,将所有大鼠腹膜内注射5-溴-2'-脱氧尿苷(BrdU),其中并入DNA以代替胸苷。实验后,将大鼠保持四个不同的时间段(24小时,3个月,6个月和12个月)。使用分馏塔原理,我们通过对各部分进行均匀随机取样并将光学隔离器(3-D探针)应用于采样和免疫染色的厚组织切片,从而获得海马的已知部分。特别值得注意的是,冻结部分通常在加工过程中在z轴上塌陷在这种特殊情况下应使用基于加权平均截面厚度的光学隔离层14 。当光学障碍物的焦平面向下移动已知距离时,BrdU阳性神经元被计数,当感兴趣的特征被清楚地识别。在立体学领域,有一些关于应该计算的粒子总数的争论15 ;通常在感兴趣的结构中计算150-200个神经元以获得足够的精度, 即 7-8%的系数8 。 BrdU阳性神经元计数使用具有摄像机的标准显微镜成像的立体软件完成,并且具有以下目的:2X,4X和10X以及100X油浸物镜(数值孔径= 1.40),以及电动阶段。用数字微量扫描器测量z方向的运动。最终放大倍数是3000X。
使用ECS作为诱导神经发生的方法,我们发现海马中新的BrdU阳性神经元的形成立即增加了260%。在这个急性产生的神经元池中,我们发现从第1天到第三个月有40%的磨损,近10%的新形成的神经元在治疗后至少12个月存活10,11 。 BrdU标记的神经元的计数遵循严格的采样方案,其中整个海马被切成80μm厚的部分,然后每第 5 个部分进行亚采样,随机抽样开始于第一部分和第五部分之间。提供这些部分是以系统随机的方式进行选择的,这显然是减少最终结果的差异的极好方法,没有详尽的计数1 。该采样方案允许我们平均计数12(8-16)个海马中的BrdU阳性神经元每个大鼠脑中的切片,最终精度为9-11%。
当使用分馏器方法时,必须知道进行计数的区段高度的分数,因为组织收缩和变形在组织学处理期间经常发生14 。实际上,我们在这项研究中看到了厚度的大幅收缩。此外,应该注意的是,可能会发生差异组织收缩,如Dorph-Petersen等人然而,只要感兴趣的完整结构可用于分析,这些限制不会导致颗粒总数即 BrdU阳性神经元的偏差。在组织收缩是一个特殊问题的研究中,应该总是指出,结果是在变形的组织中获得的。在这项研究中,我们计算出一个10毫米的检测器高度。本研究的部分最终平均厚度为26μm,为5μm顶部的防护区域和该部分底部的11-μm(平均)防护区域。这些参数是可以接受的,因为防护区域应近似为采样颗粒的直径。
在划定GCL / SGZ后,各界人士均匀地随机放置在划定区域内。分隔器应以固定的步长定位,优化采样和计数,以有效地获得由调查员确定的精度的估计。通常通过在感兴趣的结构5中计数多达150-200个细胞来实现最佳精度。在本研究中,我们计算了每只大鼠海马中平均133(33-372)BrdU阳性神经元。由于一些对照动物中的细胞数量较少,我们的BrdU阳性神经元计数低于获得合适精度所需的细胞数量,这导致了相对较高的CE值。 H不过,由于我们获得的CV值低于CV值的一半(见代表性结果部分),因此不需要额外的抽样和计数。高CV值表明观察到的变化的最大贡献来源于生物学变化。实际上,我们可能认为本研究中计数的BrdU阳性神经元的平均数量高于必需。例如,在一组老鼠中,我们获得了9%的CE值,观察到CV值为43%。在这种特殊情况下,我们可以瞄准精度约20%。总之,本研究中BrdU阳性神经元总数的精确度足以证明实际治疗效果对真实粒子数的影响。由于某些动物群体的相当大的生物学变化,可以以可接受的精度获得相同的估计,尽管努力的支出更少。组内只有高生物差异通过增加动物的数量来补偿。
人们可能会认为,获得精确细胞数量的黄金标准需要穷举所有感兴趣的物体。然而,在大脑的大多数研究中,这不是由于大量细胞的可能性。尽管比穷尽细胞计数效率更高,但是与单细胞数差异的简单筛选相比,任选的分馏器相对来说是相当耗时的,如果精确数目的细胞不是必需的,则是优选的。根据我们的经验,纯粹通过筛选程序可以检测到超过20-30%的差异。
如果正确执行,使用基于设计的体视学进行采样可以有效地提供无偏差和精确的估计1 。体现的不偏不倚的属性产生的估计,当被复制时,近似真实的群体平均值,并提高重现性估计21 。最初,必须获得感兴趣的整个结构的代表性样本(在本研究中是海胆GCL / SGZ),允许在第4节的统计学有效子集中进行估计。为了获得适当数量的部分和计数探针,我们应用SURS,与随机抽样相比减少方差8 。此外,SURS确保结构内的感兴趣的粒子以相同的概率进行采样,而与结构中的尺寸,形状,取向和分布无关。在获得精确和无偏估计时,强烈推荐这样的立体观点是项目的核心方面。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢SusanneSørensen的技术帮助。这项工作得到了Velux基金会的资助;茉莉花基金会Aase和Ejnar Danielsens基金会;哈特曼兄弟基金会导演Jacob Madsen和妻子Olga Madsens基金会;医生Sofus Carl Emil Friis和妻子Doris Friis的信任; 1870年的基础; Torben和爱丽丝Frimodts基金会和神经研究基金会。手稿编辑由英格伍德生物医学编辑执行。
Materials | |||
5'-bromo-2'deoxyuridine – BrdU | Sigma-Aldrich | 19-160 | |
Cresyl Violet | Sigma-Aldrich | C5042 | Contains the following materials for 1 L: 0.2 g cresyl violet; 2.0 g sodiumacetate, 3 H2O; 3 ml glacial acetic acid; 1000 ml destilled water |
Cryoprotectant | Capital Region Pharmacy, DK | 861334 | Contains the following materials: Sucrose; polyvinylpyrrolidon PVP 40; sodiumphosphatebuffer (0.2 M); ethylenglycol; demineralized water. |
dH2O | Capital Region Pharmacy, DK | 817205 | |
Diaminobenzidine – DAB | Sigma-Aldrich | D5637 | |
Envision-HRP | DAKO | K4001 | Peroxidase labeled polymer conjugated to goat anti-mouse immunoglobulins |
Ethanol – 70 % | Plum A/S | 201098 | |
Ethanol – 96 % | Plum A/S | 201104 | |
Ethanol – 99.9 % | Plum A/S | 201111 | |
Fetal Bovine Serum | In Vitro | BI-04-003-1A | |
H2O2 30% | Capital Region Pharmacy, DK | 896456 | |
HCl | J. T. Baker | 6081 | |
Mounting medium | Sakura | 4583 | Tissue Tek |
Mouse-anti-BrdU | Becton-Dickinson | 347580 | |
PBS buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 853436 | pH = 7.4 |
PFA | VWR | 28,794,295 | pH = 7.4 |
Phosphate buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 866533 | 0.1 mol/l, pH 7.4 |
Rapid drying mounting medium | Histolab Products AB | 801 | Pertex |
Sodium Tetraborate | Merck A/S | 1,063,080,500 | |
Sucrose | Merck A/S | 1,076,515,000 | |
Triton X-100 | Merck A/S | 1,086,031,000 | |
Xylene | VWR | 28,973,363 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Cover slips | Menzel-Gläser | 24×50 mm #0 | |
Cryostat | Leica | CM1860 | |
Digital Microcator | Heidenhain | VRZ 401 | |
Glass dishes | Brain Resaerch Laboratories | 1256 | |
Microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
Microscope camera | Olympus | DP72 | |
Microscope slides | VWR | 48311-703 | SuperFrost+ |
Motorized stage | Prior | H101A | |
Multidish Containers | Sigma-Aldrich | D6315-1CS | Nuclon 12-wells |
New-Cast software | Visiopharm | ver. 4.5.6.440 | |
Objective 2x | Nikon | CFI Plan UW 2X | |
Objective 4x | Nikon | CFI Plan Fluor 4X | |
Objective 10x | Nikon | CFI Plan Fluor 10X | |
Objective 100x oil immersion | Nikon | CFI Plan Apo Lambda DM 100X Oil | Numerical aperture 1.40 |
Orbital shaker | Gemini BV | CM-9 | Sarstedt |
Slide rack | Sakura | 4465 | |
Slide staining dishes | Sakura | 4457 | Tissue-Tek |
Specimen disc | Leica | 14037008637 | |
Staining nets | Brain Research Laboratories | 2512 | 25-wells |