Hier stellen wir eine stereologische Methode vor, die optische Fraktionierung, die zur Quantifizierung der Bildung neuer Neuronen und ihres Überlebens im Rattenhippocampus nach der elektrokonvulsiven Stimulation verwendet wird. Bei korrekter Umsetzung gewährleistet die Empfindlichkeit und Effizienz von stereologischen Methoden genaue Schätzungen mit einer festen und vorgegebenen Präzision.
Stereologische Methoden sind entworfen, um quantitative Parameter zu beschreiben, ohne Annahmen über Größe, Form, Orientierung und Verteilung von Zellen oder Strukturen zu machen. Diese Methoden sind revolutionär für die quantitative Analyse des Säugetier-Gehirns, in denen volumetrische Zellpopulationen zu hoch sind, um manuell zu zählen, und Stereologie ist nun die Technik der Wahl, wenn Schätzungen von dreidimensionalen Mengen aus Messungen auf zweidimensionalen extrahiert werden müssen Abschnitte Alle stereologischen Methoden sind grundsätzlich unvoreingenommen; Sie beruhen jedoch auf dem richtigen Wissen über die Struktur des Interesses und die Eigenschaften des Gewebes. Stereologie basiert auf systematischer gleichmäßiger Stichprobe (SURS), mit der Anpassung der Probenahme auf das effizienteste Niveau in Bezug auf Präzision und liefert zuverlässige, quantitative Informationen über die gesamte Struktur von Interesse. Hier stellen wir den optischen Fraktionierer in Verbindung mit der BrdU Immunhistochemie t vorO schätzen die Produktion und das Überleben von neu gebildeten Neuronen in der Körnchenzellschicht (einschließlich der subkörnigen Zone) des Rattenhippocampus nach der elektrokonvulsiven Stimulation, die zu den stärksten Stimulatoren der Neurogenese gehört. Die optische Fraktionierungstechnik ist so ausgelegt, dass sie Schätzungen der Gesamtzahl der Zellen aus dicken Abschnitten liefert, die aus der Vollstruktur abgetastet wurden. Dichte Abschnitte bieten die Möglichkeit, Zellen in ihrer vollen 3-D-Ausdehnung zu beobachten und somit eine einfache und robuste Zellklassifizierung auf der Grundlage morphologischer Kriterien zu ermöglichen. Bei korrekter Umsetzung liefert die Empfindlichkeit und Effizienz des optischen Fraktionators genaue Schätzungen mit einer festen und vorgegebenen Präzision.
Die Quantifizierung von Zellen in einer dreidimensionalen (3-D) -Struktur kann das Erhalten von Schätzungen auf der Grundlage von unvoreingenommenen Prinzipien erfordern. Noch heute verwenden Studien häufig zweidimensionale (2-D) Methoden, um Daten von 3-D-Strukturen zu melden. Diese Verfahren berücksichtigen jedoch nicht die heterogene Natur der Struktur hinsichtlich der Form und Verteilung der Zellen, was zu methodischen Einschränkungen führt; Sie nehmen Annahmen über die 3-D-Struktur von Interesse und die Ergebnisse beziehen sich nicht auf die gesamte Struktur. Diese Einschränkungen reduzieren die Empfindlichkeit und Genauigkeit der Methoden sowie erhöhen das Risiko von Fehlern 1 .
Bias in der Zellzählung kann durch die Anwendung der designbasierten Stereologie vermieden werden, was von allgemeiner Bedeutung ist, um quantitative Informationen über die Anzahl der Zellen in einem gegebenen Gewebe oder einer Struktur zu erhalten. Während Stereologie früher eine sehr zeitaufwändige Methode war, Fortschritte in Prozeduren, weichWare und Imaging, hat es viel effizienter und weit verbreitet. Stereologie beinhaltet statistische Stichprobenprinzipien und stochastische geometrische Theorie, um effiziente Werkzeuge zur Schätzung von Volumen, Fläche, Länge und Anzahl von Objekten in einer 3D-Struktur durch Probenahme in 2-D-Abschnitten 2 bereitzustellen. So erlaubt die Stereologie, objektive, quantitative Daten über strukturelle Veränderungen in Gewebeschnitten zu erhalten, die durchschnittliche Schätzungen der wahren Zahlen ohne erschöpfende Analyse ergeben. Stereologie ist definiert als die statistische Schlussfolgerung von geometrischen Parametern aus abgetasteten Informationen. Dies kann durch eine unvoreingenommene Abtastung, dh systematische Stichproben, von Abschnitten sowie Zählregeln erreicht werden, die sicherstellen, dass alle Objekte gleiche Wahrscheinlichkeiten haben, gezählt zu werden 3 . Während stereologische Ergebnisse unterschiedliche Grade der Genauigkeit haben können, wie durch den Fehlerkoeffizienten (CE) angegeben, kann dies ad seinUm die inhärente biologische Varianz (Variationskoeffizient (CV)) anzupassen, indem man die Menge der Probenahme nach Bedarf 4 , 5 anpasst. Einige frühere stereologische Studien haben die kurzfristigen Effekte der elektrokonvulsiven Stimulation (ECS) auf die hippocampale Plastizität bei Nagetieren 6,7 untersucht . Daten aus diesen Studien zeigen eine anfängliche Zunahme der Gesamtzahl der Neuronen sowie erhöhte synaptische Differenzierung nach wiederholtem ECS. Allerdings schätzen diese Studien die Neurogenese nicht direkt, da sie keine spezifischen Marker für die Zellproliferation verwenden.
Hier stellen wir eine Anwendung eines stereologischen Verfahrens, der optischen Fraktionatortechnik 8 , 9 , zur Quantifizierung der Gesamtzahl der neu gebildeten Neuronen in der Ratten-Hippocampus-Granulatzellschicht (GCL) einschließlich der Subkörnchenzone (SGZ) vor Als ihre langfristigen sUrvival 10 , 11 Wir haben Ratten einem klinisch relevanten Zeitplan von ECS (dreimal pro Woche für 3 Wochen) unterzogen, was einer der stärksten Stimulatoren der Neurogenese ist 12 . Kontrolltiere wurden nach dem gleichen Verfahren behandelt, aber ohne Strom zu überschreiten. Bei jedem der 21 Tage des Experimentierens wurden alle Ratten intraperitoneal mit 5-Brom-2-deoxyuridin (BrdU) injiziert, das anstelle von Thymidin während der Zellteilung 13 in die DNA eindringt. Nach dem Experimentieren wurden die Ratten für vier verschiedene Zeiträume (24 Stunden, 3 Monate, 6 Monate und 12 Monate) aufrechterhalten. Unter Verwendung des Fraktionierprinzips erhielten wir eine bekannte Fraktion des Hippocampus durch eine gleichmäßige Zufallsabtastung von Abschnitten und applizierte optische Sektoren (3-D-Sonden) an die abgetasteten und immunfärbten dicken Gewebeschnitten. Es wird besonders darauf hingewiesen, dass gefrorene Abschnitte in der z-Achse während des Prozesses üblicherweise zusammenfallenUnd dass optische Sektoren, die auf der nummergewichteten mittleren Schnittdicke basieren, in diesem speziellen Fall verwendet werden sollten 14 . Als die Brennebene der optischen Erkrankungen eine bekannte Distanz durch den Abschnitt verschoben wurde, wurden BrdU-positive Neuronen gezählt, als ihr Merkmal von Interesse deutlich erkannt wurde. Auf dem Gebiet der Stereologie gibt es eine Debatte über die Gesamtzahl der Teilchen, die gezählt werden sollten 15 ; Typischerweise werden 150-200 Neuronen in der Struktur von Interesse gezählt, um eine ausreichende Genauigkeit zu erhalten, dh einen Koeffizienten von 7-8% 8 . Die BrdU-positiven neuronalen Zählungen wurden mit stereologischer Software mit Imaging durch ein mit der Kamera ausgerüstetes Standardmikroskop und die folgenden Ziele vervollständigt: 2X, 4X und 10X sowie ein 100faches Öl-Immersions-Objektiv (numerische Blende = 1,40) und eine motorisierte Bühne . Bewegungen in der z-Richtung wurden mit einem digitalen Mikrocator gemessen. Die endgültige VergrößerungWar 3000x.
Mit ECS als Methodik zur Neurogenese zu induzieren, finden wir einen sofortigen Anstieg von 260% bei der Bildung neuer BrdU-positiver Neuronen im Hippocampus. In diesem Pool von akut erzeugten Neuronen fanden wir 40% Abrieb von Tag 1 bis drei Monaten, wobei fast 50% der neu gebildeten Neuronen mindestens 12 Monate nach der Behandlung 10 , 11 überleben. Das Zählen von BrdU-markierten Neuronen folgte einem strengen Probenahme-Schema, wobei der gesamte Hippocampus in 80-μm-dicke Abschnitte geschnitten wurde, gefolgt von einer Unterabtastung jedes fünften Abschnitts mit einem zufälligen Stichprobenanfang zwischen dem ersten und dem fünften Abschnitt. Die Bereitstellung dieser Abschnitte wird systematisch zufällig gewählt, dies ist nachweislich eine hervorragende Methode, um die Varianz des Endergebnisses ohne erschöpfendes Zählen zu reduzieren. Dieses Stichprobenverfahren erlaubte uns, BrdU-positive Neuronen in einem Durchschnitt von 12 (8-16) Hippocamp zu zählenAl Abschnitte in jedem Rattenhirn, mit einer endgültigen Präzision von 9-11%.
Bei der Verwendung des Fraktionierverfahrens ist es notwendig, den Bruchteil der Querschnittshöhe zu kennen, in der das Zählen durchgeführt wird, da während der histologischen Verarbeitung häufig Gewebeschrumpfung und -verformung auftreten. In der Tat sahen wir in dieser Studie erhebliche Schrumpfung der Dicke. Weiterhin ist anzumerken, dass eine differentielle Gewebeschrumpfung auftreten kann, wie sie in Dorph-Petersen et al. 2001. Solange jedoch die vollständige Struktur von Interesse für die Analyse zur Verfügung steht, führen diese Einschränkungen nicht zu einer Vorspannung der Gesamtzahl der Teilchen, dh BrdU-positiven Neuronen. In Studien, in denen Gewebeschrumpfung ein besonderes Thema ist, sollte immer gesagt werden, dass die Ergebnisse in deformiertem Gewebe erhalten werden. In dieser Studie zählten wir in einer Störungshöhe von 10 μm. Die Abschnitte der vorliegenden Studie hatten eine endgültige mittlere Dicke von 26 μm, eine 5 μmSchutzzone an der Oberseite und eine 11 μm (mittlere) Schutzzone am Boden des Abschnitts. Diese Parameter sind akzeptabel, da die Schutzzonen etwa der Durchmesser der abgetasteten Partikel sein sollten.
Nach der Abgrenzung des GCL / SGZ wurden die Ärzte gleichmäßig zufällig in den abgegrenzten Bereich versetzt. Die Schmerzen sollten mit einer festen Schrittlänge positioniert werden, die die Probenahme und das Zählen optimiert, um Schätzungen mit einer vom Forscher bestimmten Präzision effizient zu erhalten. Eine optimale Präzision wird typischerweise durch Zählen von bis zu 150-200 Zellen in jeder interessierenden Struktur 5 erreicht . In der vorliegenden Studie zählten wir einen Mittelwert von 133 (Bereich 33-372) BrdU-positiven Neuronen in jedem Ratten-Hippocampus. Aufgrund einer niedrigen Zellzahl in einigen der Kontrolltiere fielen unsere Zählungen von BrdU-positiven Neuronen unter die allgemein akzeptable Anzahl von Zellen, die erforderlich waren, um eine geeignete Präzision zu erhalten, was zu relativ hohen CE-Werten für diese Fälle führte. HOwever, da wir CE-Werte von weniger als der Hälfte der CV-Werte erhielten (siehe repräsentative Ergebnis-Sektion), wurden zusätzliche Probenahme und Zählung nicht benötigt. Die hohen CV-Werte zeigen, dass der größte Beitrag zur beobachteten Variation aus der biologischen Variation entspringt. In der Tat könnten wir behaupten, dass die durchschnittliche Anzahl der BrdU-positiven Neuronen, die in der vorliegenden Studie gezählt wurden, höher war als notwendig. Zum Beispiel erreichten wir in einer Gruppe von Ratten einen CE-Wert von 9% und beobachteten einen CV-Wert von 43%. In diesem speziellen Fall hätten wir eine Präzision von etwa 20% anstreben können. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Genauigkeit der Gesamtzahl der BrdU-positiven Neuronen in der vorliegenden Studie ausreichend ist, da sie reale Behandlungswirkungen auf die wahre Anzahl von Partikeln einfängt. Wegen der ziemlich großen biologischen Variation bei bestimmten Gruppen von Tieren konnten die gleichen Schätzungen mit einer akzeptablen Präzision erhalten werden, trotz weniger Aufwand an Aufwand. Hohe biologische Abweichungen innerhalb der Gruppen können nurDurch die Erhöhung der Zahl der Tiere kompensiert werden.
Man könnte argumentieren, dass der Goldstandard für die Erlangung genauer Zellzahlen eine abschließende Zählung aller interessanten Objekte mit sich bringt. Allerdings ist in den meisten Studien des Gehirns dies keine Möglichkeit aufgrund der großen Anzahl von Zellen. Obwohl viel effizienter als eine abschließende Zellzählung ist, ist der optionale Fraktionierer relativ zeitaufwendig im Vergleich zu einem einfachen Screening von Unterschieden in Zellzahlen, was bevorzugt ist, wenn die genaue Anzahl von Zellen nicht wesentlich ist. Es ist unsere Erfahrung, dass Unterschiede von mehr als 20-30% nur durch Screening-Verfahren erkannt werden können.
Wenn sie korrekt durchgeführt wird, liefert die Probenahme mit der designbasierten Stereologie in einer effizienten Weise unvoreingenommene und präzise Schätzungen. Die objektive Eigenschaft der Stereologie erzeugt Schätzungen, die, wenn sie repliziert werden, die wahren Populationsmittel annähern und die Reproduzierbarkeit derSchätzung 21 Zunächst muss eine repräsentative Stichprobe der gesamten interessierenden Struktur (in dieser Studie der Hippocampal GCL / SGZ) erhalten werden, die eine Schätzung in einer statistisch gültigen Teilmenge der Abschnitte 4 ermöglicht . Um eine entsprechende Anzahl von Abschnitten und Zählsonden zu erhalten, wenden wir SURS an, was die Varianz im Vergleich zur Stichprobe 8 reduziert. Darüber hinaus sorgt SURS dafür, dass die interessierenden Partikel innerhalb der Struktur mit den gleichen Wahrscheinlichkeiten unabhängig von ihrer Größe, Form, Orientierung und Verteilung in der Struktur abgetastet werden. Als solche Stereologie ist sehr zu empfehlen, wenn genaue und unvoreingenommene Schätzungen ist ein zentraler Aspekt des Projekts.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Susanne Sørensen für die geschickte technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch Stipendien der Velux-Stiftung unterstützt; Die Jascha-Stiftung; Aase und Ejnar Danielsens Stiftung; Hartmann-Brüder-Stiftung; Direktor Jacob Madsen und Frau Olga Madsens Stiftung; Doktor Sofus Carl Emil Friis und Frau Doris Friis 'Vertrauen; Die Stiftung von 1870; Torben und Alice Frimodts Foundation und die Stiftung für Neurologische Forschung. Manuskriptbearbeitung wurde von Inglewood Biomedical Editing durchgeführt.
Materials | |||
5'-bromo-2'deoxyuridine – BrdU | Sigma-Aldrich | 19-160 | |
Cresyl Violet | Sigma-Aldrich | C5042 | Contains the following materials for 1 L: 0.2 g cresyl violet; 2.0 g sodiumacetate, 3 H2O; 3 ml glacial acetic acid; 1000 ml destilled water |
Cryoprotectant | Capital Region Pharmacy, DK | 861334 | Contains the following materials: Sucrose; polyvinylpyrrolidon PVP 40; sodiumphosphatebuffer (0.2 M); ethylenglycol; demineralized water. |
dH2O | Capital Region Pharmacy, DK | 817205 | |
Diaminobenzidine – DAB | Sigma-Aldrich | D5637 | |
Envision-HRP | DAKO | K4001 | Peroxidase labeled polymer conjugated to goat anti-mouse immunoglobulins |
Ethanol – 70 % | Plum A/S | 201098 | |
Ethanol – 96 % | Plum A/S | 201104 | |
Ethanol – 99.9 % | Plum A/S | 201111 | |
Fetal Bovine Serum | In Vitro | BI-04-003-1A | |
H2O2 30% | Capital Region Pharmacy, DK | 896456 | |
HCl | J. T. Baker | 6081 | |
Mounting medium | Sakura | 4583 | Tissue Tek |
Mouse-anti-BrdU | Becton-Dickinson | 347580 | |
PBS buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 853436 | pH = 7.4 |
PFA | VWR | 28,794,295 | pH = 7.4 |
Phosphate buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 866533 | 0.1 mol/l, pH 7.4 |
Rapid drying mounting medium | Histolab Products AB | 801 | Pertex |
Sodium Tetraborate | Merck A/S | 1,063,080,500 | |
Sucrose | Merck A/S | 1,076,515,000 | |
Triton X-100 | Merck A/S | 1,086,031,000 | |
Xylene | VWR | 28,973,363 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Cover slips | Menzel-Gläser | 24×50 mm #0 | |
Cryostat | Leica | CM1860 | |
Digital Microcator | Heidenhain | VRZ 401 | |
Glass dishes | Brain Resaerch Laboratories | 1256 | |
Microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
Microscope camera | Olympus | DP72 | |
Microscope slides | VWR | 48311-703 | SuperFrost+ |
Motorized stage | Prior | H101A | |
Multidish Containers | Sigma-Aldrich | D6315-1CS | Nuclon 12-wells |
New-Cast software | Visiopharm | ver. 4.5.6.440 | |
Objective 2x | Nikon | CFI Plan UW 2X | |
Objective 4x | Nikon | CFI Plan Fluor 4X | |
Objective 10x | Nikon | CFI Plan Fluor 10X | |
Objective 100x oil immersion | Nikon | CFI Plan Apo Lambda DM 100X Oil | Numerical aperture 1.40 |
Orbital shaker | Gemini BV | CM-9 | Sarstedt |
Slide rack | Sakura | 4465 | |
Slide staining dishes | Sakura | 4457 | Tissue-Tek |
Specimen disc | Leica | 14037008637 | |
Staining nets | Brain Research Laboratories | 2512 | 25-wells |