Aqui, apresentamos um método estereológico, o fraccionador óptico, usado para quantificar a formação de novos neurônios e sua sobrevivência, no hipocampo do rato após a estimulação eletroconvulsiva. Quando implementado corretamente, a sensibilidade e a eficiência dos métodos estereológicos garantem estimativas precisas com uma precisão fixa e predeterminada.
Métodos estereológicos são projetados para descrever parâmetros quantitativos sem fazer suposições sobre tamanho, forma, orientação e distribuição de células ou estruturas. Esses métodos têm sido revolucionários para a análise quantitativa do cérebro de mamífero, em que as populações de células volumétricas são muito altas para contar manualmente e a estereologia é agora a técnica de escolha sempre que as estimativas de quantidades tridimensionais precisam ser extraídas das medidas em duas dimensões Seções. Todos os métodos estereológicos são, em princípio, imparciais; No entanto, eles confiam no conhecimento adequado sobre a estrutura de interesse e as características do tecido. A estereologia é baseada em amostras aleatoriamente aleatórias sistemáticas (SURS), com ajuste de amostragem para o nível mais eficiente em relação à precisão, fornecendo informações confiáveis e quantitativas sobre toda a estrutura de interesse. Aqui apresentamos o fracionador óptico em conjunto com a imuno-histoquímica BrdU tO estimar a produção e sobrevivência de neurônios recém-formados na camada de células granulares (incluindo a zona subgranular) do hipocampo de rato após a estimulação eletroconvulsiva, que está entre os estimuladores mais potentes da neurogênese. A técnica do fraccionador óptico foi projetada para fornecer estimativas do número total de células de seções grossas amostradas da estrutura completa. Seções grossas proporcionam a oportunidade de observar as células em sua extensão total de 3-D e, portanto, permitir uma classificação celular fácil e robusta com base em critérios morfológicos. Quando implementado corretamente, a sensibilidade e a eficiência do fracionador óptico fornecem estimativas precisas com uma precisão fixa e predeterminada.
A quantificação de células em uma estrutura tridimensional (3-D) pode exigir a obtenção de estimativas com base em princípios imparcial. Ainda hoje, estudos freqüentemente usam métodos bidimensionais (2-D) para relatar dados de estruturas 3-D. No entanto, esses métodos não consideram a natureza heterogênea da estrutura em termos de forma e distribuição de células resultando em limitações metódicas; Eles fazem suposições sobre a estrutura 3-D de interesse e os resultados não se referem à estrutura completa. Essas limitações reduzem a sensibilidade e precisão dos métodos, além de aumentar o risco de erros 1 .
O desvio na contagem de células pode ser evitado pela aplicação da estereologia baseada em design, que é de importância geral para obter informações quantitativas sobre o número de células em um determinado tecido ou estrutura. Embora a estereologia tenha sido um método muito demorado, avanços em procedimentos, softWare e imagens, tornou-se muito mais eficiente e amplamente aplicável. A estereologia implica princípios de amostragem estatística e teoria geométrica estocástica para fornecer ferramentas eficientes para estimativa de volume, área de superfície, comprimento e número de objetos em uma estrutura 3-D por amostragem em seções 2 -D 2 . Assim, a estereologia permite obter dados quantitativos imparciais em mudanças estruturais em seções de tecido, que dão estimativas médias dos números verdadeiros, sem análise exaustiva 1 . A estereologia é definida como a inferência estatística de parâmetros geométricos a partir de informações amostradas. Isso pode ser alcançado por meio de amostragem imparcial, ou seja, amostragem aleatória sistemática, de seções, bem como regras de contagem que asseguram que todos os objetos tenham iguais probabilidades de serem contados 3 . Enquanto os resultados estereológicos podem ter diferentes graus de precisão como indicado pelo coeficiente de erro (CE), isso pode ser o anúncioAjustado para se adequar à variância biológica inerente (coeficiente de variância (CV)), ajustando a quantidade de amostragem conforme necessário 4 , 5 . Alguns estudos estereológicos anteriores examinaram os efeitos a curto prazo da estimulação eletroconvulsiva (ECS) na plasticidade do hipocampo em roedores 6,7 . Os dados desses estudos mostram um aumento inicial no número total de neurônios, bem como a diferenciação sináptica elevada após ECS repetido. No entanto, esses estudos não estimam a neurogênese diretamente, pois não usam marcadores específicos para a proliferação celular.
Aqui apresentamos uma aplicação de um método estereológico, a técnica de fracionamento óptico 8 , 9 , para quantificar o número total de neurônios recém-formados na camada celular de grânulo do hipocampo de rato (GCL), incluindo a zona subgranular (SGZ) também Como a longo prazoUrvival 10 , 11 . Nós submetimos os ratos a um cronograma clínico relevante de ECS (três vezes por semana durante 3 semanas), que é um dos estimuladores mais potentes da neurogênese 12 . Os animais de controle foram tratados usando o mesmo procedimento, mas sem passagem de corrente. Em cada um dos 21 dias de experimentação, todos os ratos foram injetados intraperitonealmente com 5-bromo-2 '-desoxiuridina (BrdU) que incorpora em DNA em lugar de timidina durante a divisão celular 13 . Após a experimentação, os ratos foram mantidos por quatro períodos diferentes (24 horas, 3 meses, 6 meses e 12 meses). Usando o princípio do fraccionador, obtivemos uma fração conhecida do hipocampo através de amostragem aleatória uniforme de seções, e disjuntores ópticos aplicados (sondas 3-D) às seções de tecido grosso amostrado e imunossinado. Observa-se especialmente que as seções congeladas geralmente se colapsam no eixo z durante o processoIng, e que os disectores ópticos com base na espessura média da seção ponderada em número devem ser usados neste caso particular 14 . À medida que o plano focal dos disjuntores ópticos foi movido para uma distância conhecida para baixo através da seção, os neurônios negativos de BrdU foram contados quando sua característica de interesse foi claramente reconhecida. No campo da estereologia há algum debate sobre o número total de partículas que devem ser contadas 15 ; Tipicamente 150-200 neurônios são contados na estrutura de interesse para obter uma precisão adequada, ou seja, um coeficiente de 7-8% 8 . As contagens neuronais positivas para BrdU foram completadas usando software estereologico com imagens por um microscópio padrão equipado com câmera e os seguintes objetivos: 2X, 4X e 10X, bem como um objetivo de imersão em óleo 100X (abertura numérica = 1.40) e um estágio motorizado . Os movimentos na direção z foram medidos com um microcator digital. A ampliação finalEra 3000X.
Usando ECS como uma metodologia para induzir neurogênese, encontramos um aumento imediato de 260% na formação de novos neurônios BrdU positivos no hipocampo. Neste grupo de neurônios gerados agudamente, encontramos 40% de atrito desde o dia 1 até três meses, com quase 50% dos neurônios recém formados sobrevivendo pelo menos 12 meses após o tratamento 10 , 11 . A contagem de neurônios marcados com BrdU seguiu um esquema de amostragem rigoroso, pelo qual todo o hipocampo foi cortado em seções de 80 μm de espessura seguido de sub-amostragem de cada 5ª seção com um começo de amostragem aleatório entre a seção um e a seção cinco. Fornecer estas seções são escolhidas de maneira aleatória e sistemática, isto é, demonstravelmente, um método excelente para reduzir a variância do resultado final, sem contagem exaustiva 1 . Este esquema de amostragem nos permitiu contar os neurônios negativos de BrdU em uma média de 12 (8-16) hipocampoEm cada cérebro de ratos, com uma precisão final de 9-11%.
Ao usar o método do fraccionador, é essencial conhecer a fração da altura da seção em que a contagem é realizada, uma vez que o encolhimento e a deformação do tecido ocorrem freqüentemente durante o processamento histológico 14 . De fato, vimos um encolhimento substancial da espessura neste estudo. Além disso, deve notar-se que pode ocorrer encolhimento diferencial do tecido, conforme apresentado em Dorph-Petersen et al. 2001. No entanto, desde que a estrutura completa de interesse esteja disponível para análise, essas limitações não resultam em uma polarização do número total de partículas, isto é , neurônios positivos a BrdU. Em estudos em que o encolhimento de tecido é uma questão particular, deve sempre ser afirmado que os resultados são obtidos em tecido deformado. Neste estudo, contamos com uma altura de um detetor de 10 μm. As seções do presente estudo tiveram uma espessura média final de 26 μm, um 5 μmZona de guarda na parte superior e uma zona de proteção de 11 μm (média) na parte inferior da seção. Esses parâmetros são aceitáveis, uma vez que as zonas de proteção devem ser aproximadamente o diâmetro das partículas amostradas.
Após a delimitação da GCL / SGZ, os setores foram uniformemente colocados aleatoriamente dentro da área delineada. Os disectores devem ser posicionados com um comprimento de passo fixo que otimize a amostragem e a contagem para obtenção eficiente de estimativas com uma precisão determinada pelo investigador. A precisão ideal geralmente é alcançada contando até 150-200 células em cada estrutura de interesse 5 . No presente estudo, contamos uma média de 133 (intervalo 33-372) neurônios BrdU positivos em cada hipocampo de ratos. Devido a um baixo número de células em alguns dos animais de controle, nossas contagens de neurônios negativos de BrdU caíram abaixo do número geralmente aceitável de células necessárias para obter uma precisão adequada, o que resultou em valores CE relativamente altos para esses casos. HNo entanto, como obtivemos valores CE de menos de metade dos valores de CV (ver seção de resultado representativo) não era necessária amostragem e contagem adicionais. Os altos valores de CV mostram que o maior contribuinte para a variação observada é originado pela variação biológica. Na verdade, podemos afirmar que o número médio de neurônios positivos a BrdU contados no presente estudo foi maior do que o necessário. Por exemplo, em um grupo de ratos, alcançamos um valor de CE de 9% e observamos um CV de 43%. Neste caso particular, poderíamos ter apontado para uma precisão de aproximadamente 20%. Em resumo, a precisão do número total de neurônios positivos a BrdU no presente estudo é suficiente na medida em que ele captura efeitos reais sobre o verdadeiro número de partículas. Devido à variação biológica bastante grande em certos grupos de animais, as mesmas estimativas poderiam ter sido obtidas com uma precisão aceitável, apesar de menos gastos de esforço. As altas variações biológicas dentro dos grupos só podemSer compensado pelo aumento do número de animais.
Pode-se argumentar que o padrão-ouro para a obtenção de números de células exatas implica uma contagem exaustiva de todos os objetos de interesse. No entanto, na maioria dos estudos do cérebro, isso não é uma possibilidade devido ao grande número de células. Embora seja muito mais eficiente do que a contagem de células exaustivas, o fraccionador opcional é relativamente demorado em comparação com o rastreio simples das diferenças nos números de células, o que é preferido se o número exato de células não for essencial. É nossa experiência que as diferenças de mais de 20-30% podem ser detectadas puramente por procedimentos de triagem.
Se realizada corretamente, a amostragem usando estereologia baseada em design fornece estimativas imparciais e precisas de maneira eficiente 1 . A propriedade imparcial da estereologia produz estimativas que, quando replicadas, aproximam-se da população real, e melhoram a reprodutibilidade daEstimativa 21 . Inicialmente, uma amostra representativa de toda a estrutura de interesse (neste estudo o GCL / SGZ do hipocampo) deve ser obtida, permitindo uma estimativa em um subconjunto estatisticamente válido das seções 4 . Para obter um número adequado de seções e sondas de contagem, aplicamos SURS, o que reduz a variância em comparação com a amostragem aleatória 8 . Além disso, o SURS garante que as partículas de interesse dentro da estrutura sejam amostradas com as mesmas probabilidades, independentemente do tamanho, forma, orientação e distribuição na estrutura. Como tal, a estereologia deve ser altamente recomendada ao obter estimativas precisas e imparciais é um aspecto central do projeto.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Susanne Sørensen pela habilitada assistência técnica. Este trabalho foi apoiado por bolsas da The Velux Foundation; Fundação Jascha; Fundação Aase e Ejnar Danielsens; Fundação Hartmann Brothers; Diretor Jacob Madsen e esposa Olga Madsens Foundation; Doutor Sofus Carl Emil Friis e esposa Doris Friis 'Trust; A Fundação de 1870; Torben e Alice Frimodts Foundation e The Foundation for Neurological Research. A edição de manuscrito foi realizada pela Inglewood Biomedical Editing.
Materials | |||
5'-bromo-2'deoxyuridine – BrdU | Sigma-Aldrich | 19-160 | |
Cresyl Violet | Sigma-Aldrich | C5042 | Contains the following materials for 1 L: 0.2 g cresyl violet; 2.0 g sodiumacetate, 3 H2O; 3 ml glacial acetic acid; 1000 ml destilled water |
Cryoprotectant | Capital Region Pharmacy, DK | 861334 | Contains the following materials: Sucrose; polyvinylpyrrolidon PVP 40; sodiumphosphatebuffer (0.2 M); ethylenglycol; demineralized water. |
dH2O | Capital Region Pharmacy, DK | 817205 | |
Diaminobenzidine – DAB | Sigma-Aldrich | D5637 | |
Envision-HRP | DAKO | K4001 | Peroxidase labeled polymer conjugated to goat anti-mouse immunoglobulins |
Ethanol – 70 % | Plum A/S | 201098 | |
Ethanol – 96 % | Plum A/S | 201104 | |
Ethanol – 99.9 % | Plum A/S | 201111 | |
Fetal Bovine Serum | In Vitro | BI-04-003-1A | |
H2O2 30% | Capital Region Pharmacy, DK | 896456 | |
HCl | J. T. Baker | 6081 | |
Mounting medium | Sakura | 4583 | Tissue Tek |
Mouse-anti-BrdU | Becton-Dickinson | 347580 | |
PBS buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 853436 | pH = 7.4 |
PFA | VWR | 28,794,295 | pH = 7.4 |
Phosphate buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 866533 | 0.1 mol/l, pH 7.4 |
Rapid drying mounting medium | Histolab Products AB | 801 | Pertex |
Sodium Tetraborate | Merck A/S | 1,063,080,500 | |
Sucrose | Merck A/S | 1,076,515,000 | |
Triton X-100 | Merck A/S | 1,086,031,000 | |
Xylene | VWR | 28,973,363 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Cover slips | Menzel-Gläser | 24×50 mm #0 | |
Cryostat | Leica | CM1860 | |
Digital Microcator | Heidenhain | VRZ 401 | |
Glass dishes | Brain Resaerch Laboratories | 1256 | |
Microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
Microscope camera | Olympus | DP72 | |
Microscope slides | VWR | 48311-703 | SuperFrost+ |
Motorized stage | Prior | H101A | |
Multidish Containers | Sigma-Aldrich | D6315-1CS | Nuclon 12-wells |
New-Cast software | Visiopharm | ver. 4.5.6.440 | |
Objective 2x | Nikon | CFI Plan UW 2X | |
Objective 4x | Nikon | CFI Plan Fluor 4X | |
Objective 10x | Nikon | CFI Plan Fluor 10X | |
Objective 100x oil immersion | Nikon | CFI Plan Apo Lambda DM 100X Oil | Numerical aperture 1.40 |
Orbital shaker | Gemini BV | CM-9 | Sarstedt |
Slide rack | Sakura | 4465 | |
Slide staining dishes | Sakura | 4457 | Tissue-Tek |
Specimen disc | Leica | 14037008637 | |
Staining nets | Brain Research Laboratories | 2512 | 25-wells |