Her præsenterer vi en stereologisk metode, den optiske fraktionator, der bruges til at kvantificere dannelsen af nye neuroner og deres overlevelse i rottehippocampus efter elektrokonvulsiv stimulering. Ved korrekt implementering sikrer følsomheden og effektiviteten af stereologiske metoder nøjagtige estimater med en fast og forudbestemt præcision.
Stereologiske metoder er designet til at beskrive kvantitative parametre uden at antage størrelser, form, orientering og distribution af celler eller strukturer. Disse metoder har været revolutionerende til kvantitativ analyse af pattedyrshjerne, hvor volumetriske cellepopulationer er for høje til at tælle manuelt, og stereologi er nu den valgte teknik, når estimater af tredimensionelle mængder skal udvindes fra målinger på todimensionale sektioner. Alle stereologiske metoder er i princippet upartiske; De er dog afhængige af korrekt viden om interessestrukturen og vævets egenskaber. Stereologi er baseret på systematisk ensartet tilfældig prøveudtagning (SURS) med justering af prøveudtagning til det mest effektive niveau med hensyn til præcision, der giver pålidelig, kvantitativ information om hele strukturen af interesse. Her præsenterer vi den optiske fraktionator i forbindelse med BrdU immunhistokemi tO estimere produktion og overlevelse af nydannede neuroner i granulacellelaget (herunder den undergranulære zone) af rottehippocampus efter elektrokonvulsiv stimulering, som er blandt de mest potente stimulatorer af neurogenese. Den optiske fraktioneringsteknik er designet til at tilvejebringe estimater af det totale antal celler fra tykke sektioner, der er samplet fra den fulde struktur. Tykke sektioner giver mulighed for at observere celler i deres fulde 3-D-udstrækning og dermed muliggøre let og robust celleklassificering baseret på morfologiske kriterier. Når korrekt implementeret giver følsomheden og effektiviteten af den optiske fraktionator præcise estimater med en fast og forudbestemt præcision.
Kvantificering af celler i en tredimensionel (3-D) struktur kan kræve opnåelse af estimater baseret på upartiske principper. Selv i dag bruger studier ofte todimensionale (2-D) metoder til at rapportere data om 3-D strukturer. Imidlertid anser disse metoder ikke strukturens heterogene karakter hvad angår form og distribution af celler, der resulterer i metodiske begrænsninger; De gør antagelser om 3-D-strukturen af interesse, og resultaterne henviser ikke til den komplette struktur. Disse begrænsninger reducerer følsomheden og nøjagtigheden af metoderne samt øger risikoen for fejl 1 .
Bias i celletælling kan undgås ved anvendelse af designbaseret stereologi, hvilket er af generel betydning for opnåelse af kvantitativ information om antallet af celler i et givet væv eller en struktur. Mens stereologi tidligere har været en meget tidskrævende metode, fremskridt i procedurer, blødWare og billeddannelse, har gjort det til at blive meget mere effektivt og bredt anvendeligt. Stereologi indebærer statistiske prøvetagningsprincipper og stokastisk geometrisk teori for at tilvejebringe effektive værktøjer til estimering af volumen, overfladeareal, længde og antal objekter i en 3-D struktur ved prøveudtagning i 2-D sektioner 2 . Således giver stereologi en mulighed for at opnå upartiske kvantitative data om strukturelle ændringer i vævssektioner, hvilket giver gennemsnitlige estimeringer af de sande tal uden udtømmende analyse 1 . Stereologi defineres som den statistiske indledning af geometriske parametre fra samplet information. Dette kan opnås ved upartisk prøveudtagning, det vil sige systematisk stikprøveudtagning, af sektioner samt tælleregler, der sikrer, at alle objekter har lige sandsynligheder for at blive talt 3 . Mens stereologiske resultater kan have varierende grader af præcision som angivet ved fejlkoefficienten (CE), kan dette være annonceJusteret for at passe til den iboende biologiske varians (varianskoefficienten) ved at justere mængden af prøveudtagning som krævet 4 , 5 . Nogle tidligere stereologiske undersøgelser har undersøgt de kortvarige virkninger af elektrokonvulsiv stimulering (ECS) på hippocampal plasticitet hos gnavere 6,7 . Data fra disse undersøgelser viser en initial stigning i det totale antal neuroner såvel som forhøjet synaptisk differentiering efter gentagen ECS. Disse undersøgelser estimerer imidlertid ikke neurogenese direkte, da de ikke bruger specifikke markører til celleproliferation.
Her præsenterer vi en anvendelse af en stereologisk metode, den optiske fraktioneringsteknik 8 , 9 , til kvantificering af det samlede antal nydannede neuroner i rottehippocampalt granulacellag (GCL), herunder også den undergranulære zone (SGZ) Som deres langsigtede sUrvival 10 , 11 . Vi udsatte rotter til en klinisk relevant tidsplan for ECS (tre gange om ugen i 3 uger), som er en af de mest potente stimulatorer af neurogenese 12 . Kontroldyr blev behandlet under anvendelse af samme fremgangsmåde, men uden at passere strøm. På hver af de 21 dages forsøg blev alle rotter injiceret intraperitonealt med 5-brom-2'-deoxyuridin (BrdU), der inkorporerer i DNA i stedet for thymidin under celledeling 13 . Efterfølgende forsøg blev rotterne opretholdt i fire forskellige tidsperioder (24 timer, 3 måneder, 6 måneder og 12 måneder). Ved anvendelse af fraktioneringsprincippet opnåede vi en kendt fraktion af hippocampuset gennem ensartet tilfældig prøveudtagning af sektioner og anvendte optiske disektorer (3-D-prober) til de samplede og immunfarvede tykke vævssektioner. Det er især bemærket, at frosne sektioner normalt falder sammen i z-aksen under processenOg at optiske disektorer baseret på den talvægtede gennemsnitssektionstykkelse skal anvendes i dette særlige tilfælde 14 . Som brændpunktsplanet for de optiske disektorer blev flyttet en kendt afstand ned gennem sektionen, blev BrdU-positive neuroner talt, da deres egenskab af interesse blev klart genkendt. Inden for stereologien er der noget debat om det samlede antal partikler, der skal tælles 15 ; Typisk 150-200 neuroner tælles i strukturen af interesse for at opnå tilstrækkelig præcision dvs. en koefficient på 7-8% 8 . De BrdU-positive neurontællinger blev afsluttet ved hjælp af stereologisk software med billeddannelse ved hjælp af et standardmikroskop udstyret med kamera og følgende mål: 2X, 4X og 10X samt et 100X olieinddrivningsmål (numerisk blænde = 1,40) og et motoriseret trin . Bevægelser i z-retningen blev målt med en digital mikrocator. Den endelige forstørrelseVar 3000X.
Ved hjælp af ECS som metode til at fremkalde neurogenese finder vi en øjeblikkelig stigning på 260% i dannelsen af nye BrdU-positive neuroner i hippocampus. I denne pulje af akut genererede neuroner fandt vi 40% afgang fra dag 1 til 3 måneder, med næsten 50% af de nydannede neuroner overlevende mindst 12 måneder efter behandling 10 , 11 . Tællingen af BrdU-mærkede neuroner fulgte et strikt prøveudtagningsskema, hvorved hele hippocampus blev skåret i 80 μm tykke sektioner efterfulgt af undersampling af hver 5. sektion med en tilfældig prøveudtagning mellem sektion 1 og sektion fem. Forudsat at disse sektioner vælges systematisk, er dette påviseligt en glimrende metode til at reducere slutresultatets varians uden udtømmende tælling 1 . Dette prøveudtagningssystem tillod os at tælle BrdU-positive neuroner i et gennemsnit på 12 (8-16) hippocampAl sektioner i hver rottehjerne med en endelig præcision på 9-11%.
Ved anvendelse af fraktionsmetoden er det vigtigt at kende den brøkdel af sektionshøjden, hvori tællingen udføres, da vævskrumpning og deformation ofte forekommer under histologisk behandling 14 . Faktisk så vi en betydelig krympning af tykkelsen i denne undersøgelse. Det skal endvidere bemærkes, at forskelligt vævskrumpning kan forekomme, som præsenteret i Dorph-Petersen et al. 2001. Så længe den samlede interesseinteresse er tilgængelig til analyse, resulterer disse begrænsninger ikke i en bias af det samlede antal partikler, det vil sige BrdU-positive neuroner. I undersøgelser, hvor vævskrumpning er et bestemt problem, skal det altid angives, at resultaterne opnås i deformeret væv. I denne undersøgelse tælles vi i en disektorhøjde på 10 μm. Afsnittene i den foreliggende undersøgelse havde en endelig middeltykkelse på 26 μm, en 5 μmVagtzone øverst og en 11 μm (middel) vagtzone nederst i sektionen. Disse parametre er acceptable, da beskyttelseszoner skal være ca. diameteren af de samplede partikler.
Efter afgrænsning af GCL / SGZ blev disektorer ensartet tilfældigt placeret inden for afgrænset område. Disektorerne skal placeres med en fast trinlængde, der optimerer prøveudtagning og tælling for effektivt at opnå estimater med en præcision bestemt af efterforskeren. Optimal præcision opnås typisk ved at tælle op til 150-200 celler i hver interessestruktur 5 . I den foreliggende undersøgelse tællede vi et gennemsnit på 133 (række 33-372) BrdU-positive neuroner i hver rottehippocampus. På grund af et lavt celleantal i nogle af kontroldyrene faldt vores antal BrdU-positive neuroner under det generelt acceptable antal celler, der var nødvendige for at opnå en passende præcision, hvilket resulterede i relativt høje CE-værdier for disse tilfælde. HOwever, da vi opnåede CE-værdier på mindre end halvdelen af CV-værdierne (se repræsentativ resultatafsnit) var der ikke behov for yderligere prøveudtagning og tælling. De høje CV-værdier viser, at den største bidragyder til den observerede variation stammer fra den biologiske variation. Faktisk kan vi hævde, at det gennemsnitlige antal BrdU-positive neuroner, der tælles i den foreliggende undersøgelse, var højere end nødvendigt. For eksempel opnåede vi i en gruppe rotter en CE-værdi på 9% og observerede en CV-værdi på 43%. I dette særlige tilfælde kunne vi have rettet mod en præcision på ca. 20%. Sammenfattende er præcisionen af det samlede antal BrdU-positive neuroner i den foreliggende undersøgelse tilstrækkeligt, idet det fanger reelle behandlingseffekter på det sande antal partikler. På grund af den ret store biologiske variation i visse grupper af dyr kunne de samme skøn have været opnået med en acceptabel præcision, på trods af mindre indsatsbesparelser. Høje biologiske afvigelser inden for grupper kan kunKompenseres ved at øge antallet af dyr.
Man kan argumentere for, at guldstandarden til opnåelse af nøjagtige celle tal indebærer udtømmende tælling af alle genstande af interesse. Men i de fleste hjernestudier er det ikke en mulighed på grund af det store antal celler. Selv om det er meget mere effektivt end udtømmende celletælling, er den valgfrie fraktionator relativt tidskrævende i sammenligning med simpel screening af forskelle i celleantal, som er foretrukket, hvis det nøjagtige antal celler ikke er essentielt. Det er vores erfaring, at forskelle på mere end 20-30% kan detekteres udelukkende ved screeningsprocedurer.
Hvis det udføres korrekt, giver prøveudtagning ved hjælp af designbaseret stereologi upartiske og præcise estimater på en effektiv måde 1 . Sterilologiens upartiske egenskab frembringer estimater, at når de replikeres, tilnærmelsesvis den sande populationsmiddel og forøge reproducerbarheden afSkøn 21 . I første omgang skal en repræsentativ prøve af hele strukturen af interesse (i dette studie hippocampal GCL / SGZ) opnås, hvilket giver mulighed for estimering i en statistisk gyldig delmængde af sektioner 4 . For at opnå et passende antal sektioner og tælleprober bruger vi SURS, hvilket reducerer variansen i forhold til tilfældig prøveudtagning 8 . Desuden sikrer SURS at partikler af interesse inden for strukturen samples med de samme sandsynligheder uafhængigt af deres størrelse, form, orientering og fordeling i strukturen. Som sådan er stereologien stærkt anbefales, når man opnår præcise og upartiske estimater er et centralt aspekt af projektet.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Susanne Sørensen for den dygtige tekniske assistance. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra The Velux Foundation; The Jascha Foundation; Aase og Ejnar Danielsens Fond; Hartmann Brothers Foundation; Direktør Jacob Madsen og kone Olga Madsens Foundation; Læge Sofus Carl Emil Friis og Hustru Doris Friis 'Trust; Stiftelsen 1870; Torben og Alice Frimodts Foundation og Stiftelsen for Neurologisk Forskning. Manuskriptredigering blev udført af Inglewood Biomedical Editing.
Materials | |||
5'-bromo-2'deoxyuridine – BrdU | Sigma-Aldrich | 19-160 | |
Cresyl Violet | Sigma-Aldrich | C5042 | Contains the following materials for 1 L: 0.2 g cresyl violet; 2.0 g sodiumacetate, 3 H2O; 3 ml glacial acetic acid; 1000 ml destilled water |
Cryoprotectant | Capital Region Pharmacy, DK | 861334 | Contains the following materials: Sucrose; polyvinylpyrrolidon PVP 40; sodiumphosphatebuffer (0.2 M); ethylenglycol; demineralized water. |
dH2O | Capital Region Pharmacy, DK | 817205 | |
Diaminobenzidine – DAB | Sigma-Aldrich | D5637 | |
Envision-HRP | DAKO | K4001 | Peroxidase labeled polymer conjugated to goat anti-mouse immunoglobulins |
Ethanol – 70 % | Plum A/S | 201098 | |
Ethanol – 96 % | Plum A/S | 201104 | |
Ethanol – 99.9 % | Plum A/S | 201111 | |
Fetal Bovine Serum | In Vitro | BI-04-003-1A | |
H2O2 30% | Capital Region Pharmacy, DK | 896456 | |
HCl | J. T. Baker | 6081 | |
Mounting medium | Sakura | 4583 | Tissue Tek |
Mouse-anti-BrdU | Becton-Dickinson | 347580 | |
PBS buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 853436 | pH = 7.4 |
PFA | VWR | 28,794,295 | pH = 7.4 |
Phosphate buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 866533 | 0.1 mol/l, pH 7.4 |
Rapid drying mounting medium | Histolab Products AB | 801 | Pertex |
Sodium Tetraborate | Merck A/S | 1,063,080,500 | |
Sucrose | Merck A/S | 1,076,515,000 | |
Triton X-100 | Merck A/S | 1,086,031,000 | |
Xylene | VWR | 28,973,363 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Cover slips | Menzel-Gläser | 24×50 mm #0 | |
Cryostat | Leica | CM1860 | |
Digital Microcator | Heidenhain | VRZ 401 | |
Glass dishes | Brain Resaerch Laboratories | 1256 | |
Microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
Microscope camera | Olympus | DP72 | |
Microscope slides | VWR | 48311-703 | SuperFrost+ |
Motorized stage | Prior | H101A | |
Multidish Containers | Sigma-Aldrich | D6315-1CS | Nuclon 12-wells |
New-Cast software | Visiopharm | ver. 4.5.6.440 | |
Objective 2x | Nikon | CFI Plan UW 2X | |
Objective 4x | Nikon | CFI Plan Fluor 4X | |
Objective 10x | Nikon | CFI Plan Fluor 10X | |
Objective 100x oil immersion | Nikon | CFI Plan Apo Lambda DM 100X Oil | Numerical aperture 1.40 |
Orbital shaker | Gemini BV | CM-9 | Sarstedt |
Slide rack | Sakura | 4465 | |
Slide staining dishes | Sakura | 4457 | Tissue-Tek |
Specimen disc | Leica | 14037008637 | |
Staining nets | Brain Research Laboratories | 2512 | 25-wells |