Hier presenteren we een stereologische methode, de optische fractionator, gebruikt om de vorming van nieuwe neuronen te kwantificeren, en hun overleving, in de rathippocampus na elektroconvulsieve stimulatie. Bij correcte implementatie zorgt de gevoeligheid en efficiëntie van stereologische methoden voor een nauwkeurige schatting met een vaste en vooraf bepaalde precisie.
Stereologische methoden zijn ontworpen om kwantitatieve parameters te beschrijven zonder aannames te maken over grootte, vorm, oriëntatie en verspreiding van cellen of structuren. Deze methoden zijn revolutionair voor kwantitatieve analyse van de zoogdierbrein waarin volumetrische celpopulaties te hoog zijn om handmatig te tellen. Stereologie is nu de techniek van keuze wanneer schattingen van driedimensionale hoeveelheden moeten worden geëxtraheerd uit metingen op tweedimensionale secties. Alle stereologische methoden zijn in principe onbevooroordeeld; Zij vertrouwen echter op goede kennis over de structuur van belang en de eigenschappen van het weefsel. Stereologie is gebaseerd op Systematische Uniform Random Sampling (SURS), met aanpassing van de steekproef naar het meest efficiënte niveau met betrekking tot precisie, waardoor betrouwbare, kwantitatieve informatie over de gehele structuur van belang wordt verstrekt. Hier presenteren wij de optische fractionator in combinatie met BrdU immunohistochemie tO schatten de productie en overleving van nieuw gevormde neuronen in de granulaircellaag (inclusief de subgranulêre zone) van de rathippocampus na elektroconvulsieve stimulatie, die een van de meest krachtige stimulanten van neurogenese is. De optische fractioneringstechniek is ontworpen om schattingen van het totale aantal cellen te geven uit dikke secties die uit de volledige structuur worden bemonsterd. Dikke secties bieden de mogelijkheid om cellen in hun volledige 3-D-mate te waarnemen en zorgen dus voor een eenvoudige en robuuste celclassificatie op basis van morfologische criteria. Wanneer het correct geïmplementeerd is, biedt de gevoeligheid en efficiëntie van de optische fractionator nauwkeurige schattingen met een vaste en vooraf bepaalde precisie.
Kwantificering van cellen in een driedimensionale (3-D) structuur kan nodig hebben om schattingen op basis van onpartijdige principes te verkrijgen. Tegenwoordig gebruiken studies vaak tweedimensionale (2-D) methoden om gegevens van 3-D structuren te melden. Deze methoden beschouwen echter niet de heterogene aard van de structuur in termen van vorm en verspreiding van cellen, wat resulteert in methodische beperkingen; Ze maken aannames over de 3-D-structuur van belang en de resultaten verwijzen niet naar de volledige structuur. Deze beperkingen verminderen de gevoeligheid en nauwkeurigheid van de methoden en verhogen het risico op fouten 1 .
Bias in celtelling kan vermeden worden door toepassing van design-gebaseerde stereologie, die van algemeen belang is voor het verkrijgen van kwantitatieve informatie over het aantal cellen in een gegeven weefsel of structuur. Terwijl stereologie eerder een zeer tijdrovende methode is geweest, is de vooruitgang in procedures zachtWare en beeldvorming, heeft het veel efficiënter en veel toepasbaar geworden. Stereologie houdt in dat statistische bemonsteringsprincipes en stochastische geometrische theorie efficiënt zijn voor het schatten van volume, oppervlakte, lengte en aantal objecten in een 3-D structuur door middel van steekproeven in 2-D secties 2 . Zo laat stereologie toe om onbevooroordeelde kwantitatieve gegevens te verkrijgen over structurele veranderingen in weefselafdelingen, die gemiddelde schattingen van de echte getallen geven, zonder uitputtende analyse 1 . Stereologie wordt gedefinieerd als de statistische inferentie van geometrische parameters uit bemonsterde informatie. Dit kan bereikt worden door middel van onbevooroordeelde bemonstering, dat wil zeggen systematische willekeurige steekproeven, van secties en tellen regels die ervoor zorgen dat alle objecten gelijke waarschijnlijkheden hebben om te worden geteld 3 . Terwijl stereologische resultaten verschillende mate van nauwkeurigheid kunnen hebben, zoals aangegeven door de foutfactor (CE), kan dit ad zijnAangepast aan de inherente biologische variantie (variabele coëfficiënt) (CV)) door de hoeveelheid monsterneming aan te passen zoals vereist 4 , 5 . Enkele eerdere stereologische studies hebben de korte effecten van elektroconvulsieve stimulatie (ECS) op hippocampale plasticiteit bij knaagdieren 6,7 onderzocht. Gegevens uit deze studies tonen een initiële toename in het totale aantal neuronen, evenals verhoogde synaptische differentiatie na herhaalde ECS. Deze studies schatten echter geen directe neurogenese aan, aangezien zij geen specifieke markers voor cel proliferatie gebruiken.
Hier presenteren we een toepassing van een stereologische methode, de optische fractioneringstechniek 8 , 9 , voor het kwantificeren van het totaal aantal nieuw gevormde neuronen in de rat-hippocampale granulaatcellaag (GCL), inclusief de subgranulêre zone (SGZ) Als hun lange termijn sUrvival 10 , 11 . Wij hebben ratten onderworpen aan een klinisch relevant schema van ECS (driemaal per week gedurende 3 weken), die een van de meest krachtige stimulanten van neurogenese 12 is . Controle dieren werden behandeld onder toepassing van dezelfde procedure, maar zonder stroom door te geven. Op elk van de 21 dagen van de proefneming werden alle ratten intraperitoneaal geïnjecteerd met 5-broom-2'-deoxyuridine (BrdU) die in DNA in plaats van thymidine in celdeling 13 omvat . Na het experimenteren werden de ratten gehandhaafd voor vier verschillende perioden (24 uur, 3 maanden, 6 maanden en 12 maanden). Met behulp van het fractionatorprincipe kregen we een bekende fractie van de hippocampus door middel van uniforme willekeurige steekproeven van secties, en toegepaste optische disectors (3-D probes) aan de bemonsterde en immunostained dikke weefselsecties. Het is vooral opgemerkt dat bevroren delen meestal in de z-as tijdens het proces vallenEn dat optische disectors gebaseerd op de getalgewogen gemiddelde doorsnede dikte in dit specifieke geval 14 dienen te worden gebruikt. Aangezien het brandpuntsvlak van de optische disectors een bekende afstand door de sectie werd verplaatst, werden BrdU-positieve neuronen geteld toen hun kenmerk van belang duidelijk werd herkend. Op het gebied van stereologie is er een debat over het totale aantal deeltjes dat moet worden geteld 15 ; Typisch 150-200 neuronen worden geteld in de structuur van belang om voldoende precisie te verkrijgen, dwz een coëfficiënt van 7-8% 8 . De BrdU-positieve neuronale tellingen werden afgerond met behulp van stereologische software met beeldvorming door middel van een standaardmicroscoop uitgerust met camera en de volgende doelstellingen: 2X, 4X en 10X, evenals een 100x olie-onderdompeling (numerieke diafragma = 1,40) en een gemotoriseerde fase . Bewegingen in de z-richting werden gemeten met een digitale microcator. De laatste vergrotingWas 3000X.
Met behulp van ECS als een methode om neurogenese te veroorzaken, vinden we een onmiddellijke toename van 260% bij de vorming van nieuwe BrdU-positieve neuronen in de hippocampus. In dit pool van acuut gegenereerde neuronen vonden we 40% afvoer van dag 1 tot 3 maanden, waarbij bijna 50% van de nieuw gevormde neuronen over 12 maanden na de behandeling 10 , 11 overleefden. Het tellen van BrdU-gemerkte neuronen volgde een strikte bemonsteringsschema, waarbij de gehele hippocampus werd gesneden in 80 μm dikke secties gevolgd door subsampling van elke 5de sectie met een willekeurig bemonsteringsstart tussen sectie een en sectie vijf. Het verschaffen van deze secties wordt op systematische willekeurige wijze gekozen, dit is aantoonbaar een uitstekende methode om de variantie van het eindresultaat te verminderen, zonder uitputtend tellen 1 . Met dit bemonsteringsschema kunnen we BrdU-positieve neuronen tellen in gemiddeld 12 (8-16) hippocampenAl secties in elke ratbrein, met een laatste precisie van 9-11%.
Bij het gebruik van de fractioneringsmethode is het essentieel om de fractie van de sectiehoogte te kennen waarin tellen worden uitgevoerd, aangezien weefselkrimp en vervorming vaak voorkomt tijdens histologische verwerking 14 . Inderdaad zagen we in deze studie een aanzienlijke daling van de dikte. Verder dient te worden opgemerkt dat verschil- lende weefselkrimp kan optreden, zoals gepresenteerd in Dorph-Petersen et al. 2001. Zolang de volledige structuur van belang voor analyse beschikbaar is, resulteren deze beperkingen niet in een vooroordeel van het totale aantal deeltjes, dwz BrdU-positieve neuronen. In studies waarbij weefselkrimping een bepaald probleem is, moet er altijd worden gezegd dat de resultaten verkregen worden in vervormd weefsel. In deze studie tellen we in een disectorhoogte van 10 μm. De secties van de huidige studie hadden een uiteindelijke gemiddelde dikte van 26 μm, een 5 μmBeschermzone aan de bovenkant en een 11 μm (gemiddelde) bewakingszone onderaan het gedeelte. Deze parameters zijn aanvaardbaar, aangezien de bewakingszones ongeveer de diameter van de bemonsterde deeltjes moeten zijn.
Na afbakening van de GCL / SGZ werden disectors uniform willekeurig in het afgebakende gebied geplaatst. De disectors moeten gepositioneerd worden met een vaste staplengte die de bemonstering en het tellen optimaliseert om efficiënt schattingen te verkrijgen met een nauwkeurigheid die door de onderzoeker is vastgesteld. Optimale precisie wordt typisch bereikt door tot 150-200 cellen in elke structuur van belang 5 te tellen. In de huidige studie telden we een gemiddelde van 133 (bereik 33-372) BrdU-positieve neuronen in elke rathippocampus. Door een lage cijfers in sommige controledieren viel onze tellingen van BrdU-positieve neuronen onder het algemeen aanvaardbare aantal cellen dat nodig was om een geschikte precisie te verkrijgen, wat resulteerde in relatief hoge CE-waarden voor die gevallen. HOwever, aangezien we CE-waarden van minder dan de helft van de CV-waarden behaald hebben (zie representatieve resultaat sectie) was aanvullende bemonstering en tellen niet nodig. De hoge cv-waarden laten zien dat de grootste bijdrage aan de waargenomen variatie afkomstig is van de biologische variatie. In feite kunnen we stellen dat het gemiddelde aantal BrdU-positieve neuronen die in de huidige studie werd geteld, hoger was dan nodig was. Bijvoorbeeld, in een groep ratten behaalden we een CE-waarde van 9% en viel een cv-waarde van 43% op. In dit specifieke geval zouden we kunnen richten op een precisie van ongeveer 20%. Samengevat is de precisie van het totale aantal BrdU-positieve neuronen in de huidige studie voldoende omdat het echte behandelingseffecten op het echte aantal deeltjes vastlegt. Vanwege de vrij grote biologische variatie in bepaalde groepen dieren kunnen dezelfde schattingen zijn verkregen met een aanvaardbare precisie, ondanks minder inspanningen. Hoge biologische afwijkingen binnen groepen kunnen alleenGecompenseerd door het aantal dieren te verhogen.
Men zou kunnen stellen dat de gouden standaard voor het verkrijgen van exacte cijfers een uitputtende telling van alle voorwerpen van belang inhoudt. In de meeste studies van de hersenen is dit echter niet mogelijk door het grote aantal cellen. Hoewel veel efficiënter dan uitputtende celtelling is, is de optionele fractionator relatief tijdrovend in vergelijking met simpel screening van verschillen in cijfers die de voorkeur hebben als het nauwkeurige aantal cellen niet essentieel is. Het is onze ervaring dat verschillen van meer dan 20-30% alleen door middel van screeningsprocedures kunnen worden gedetecteerd.
Als correct uitgevoerd, biedt bemonsteren met behulp van design-gebaseerde stereologie onbevooroordeelde en nauwkeurige schattingen op een efficiënte manier 1 . De onbevooroordeelde eigenschap van stereologie produceert schattingen die, wanneer gerepliceerd, het ware populatiegemiddelde benaderen en de reproduceerbaarheid van deSchatting 21 . In eerste instantie moet een representatieve steekproef van de gehele structuur van belang (in deze studie de hippocampale GCL / SGZ) worden verkregen, zodat schatting mogelijk is in een statistisch geldige subset van secties 4 . Om een passend aantal secties te verkrijgen en probes te tellen, passen we SURS toe, die de variantie verlaagt in vergelijking met willekeurige steekproefneming 8 . Bovendien zorgt SURS ervoor dat de deeltjes van belang in de structuur met dezelfde waarschijnlijkheden worden bemonsterd, onafhankelijk van hun grootte, vorm, oriëntatie en verdeling in de structuur. Als zodanig is stereologie sterk aanbevolen bij het verkrijgen van nauwkeurige en onpartijdige schattingen is een centraal onderdeel van het project.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Susanne Sørensen voor de technische assistentie. Dit werk werd ondersteund door subsidies van The Velux Foundation; De Jascha Foundation; Aase en Ejnar Danielsens Stichting; Hartmann Brothers Foundation; Directeur Jacob Madsen en vrouw Olga Madsens Foundation; Dokter Sofus Carl Emil Friis en vrouw Doris Friis 'Trust; De stichting van 1870; Torben en Alice Frimodts Foundation en de Stichting voor Neurologisch Onderzoek. Manuscript editing werd uitgevoerd door Inglewood Biomedical Editing.
Materials | |||
5'-bromo-2'deoxyuridine – BrdU | Sigma-Aldrich | 19-160 | |
Cresyl Violet | Sigma-Aldrich | C5042 | Contains the following materials for 1 L: 0.2 g cresyl violet; 2.0 g sodiumacetate, 3 H2O; 3 ml glacial acetic acid; 1000 ml destilled water |
Cryoprotectant | Capital Region Pharmacy, DK | 861334 | Contains the following materials: Sucrose; polyvinylpyrrolidon PVP 40; sodiumphosphatebuffer (0.2 M); ethylenglycol; demineralized water. |
dH2O | Capital Region Pharmacy, DK | 817205 | |
Diaminobenzidine – DAB | Sigma-Aldrich | D5637 | |
Envision-HRP | DAKO | K4001 | Peroxidase labeled polymer conjugated to goat anti-mouse immunoglobulins |
Ethanol – 70 % | Plum A/S | 201098 | |
Ethanol – 96 % | Plum A/S | 201104 | |
Ethanol – 99.9 % | Plum A/S | 201111 | |
Fetal Bovine Serum | In Vitro | BI-04-003-1A | |
H2O2 30% | Capital Region Pharmacy, DK | 896456 | |
HCl | J. T. Baker | 6081 | |
Mounting medium | Sakura | 4583 | Tissue Tek |
Mouse-anti-BrdU | Becton-Dickinson | 347580 | |
PBS buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 853436 | pH = 7.4 |
PFA | VWR | 28,794,295 | pH = 7.4 |
Phosphate buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 866533 | 0.1 mol/l, pH 7.4 |
Rapid drying mounting medium | Histolab Products AB | 801 | Pertex |
Sodium Tetraborate | Merck A/S | 1,063,080,500 | |
Sucrose | Merck A/S | 1,076,515,000 | |
Triton X-100 | Merck A/S | 1,086,031,000 | |
Xylene | VWR | 28,973,363 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Cover slips | Menzel-Gläser | 24×50 mm #0 | |
Cryostat | Leica | CM1860 | |
Digital Microcator | Heidenhain | VRZ 401 | |
Glass dishes | Brain Resaerch Laboratories | 1256 | |
Microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
Microscope camera | Olympus | DP72 | |
Microscope slides | VWR | 48311-703 | SuperFrost+ |
Motorized stage | Prior | H101A | |
Multidish Containers | Sigma-Aldrich | D6315-1CS | Nuclon 12-wells |
New-Cast software | Visiopharm | ver. 4.5.6.440 | |
Objective 2x | Nikon | CFI Plan UW 2X | |
Objective 4x | Nikon | CFI Plan Fluor 4X | |
Objective 10x | Nikon | CFI Plan Fluor 10X | |
Objective 100x oil immersion | Nikon | CFI Plan Apo Lambda DM 100X Oil | Numerical aperture 1.40 |
Orbital shaker | Gemini BV | CM-9 | Sarstedt |
Slide rack | Sakura | 4465 | |
Slide staining dishes | Sakura | 4457 | Tissue-Tek |
Specimen disc | Leica | 14037008637 | |
Staining nets | Brain Research Laboratories | 2512 | 25-wells |