כאן, אנו מציגים שיטה סטריאולוגית, fractionator אופטי, המשמש לכימות היווצרות של נוירונים חדשים, ואת ההישרדות שלהם, בהיפוקמפוס חולדה בעקבות גירוי electroconvulsive. כאשר מיושמים כראוי, את הרגישות והיעילות של שיטות stereological מבטיח הערכות מדויקות עם קבוע מראש קבוע מראש.
שיטות סטריאולוגיות נועדו לתאר פרמטרים כמותיים מבלי לבצע הנחות לגבי גודל, צורה, כיוון והפצה של תאים או מבנים. שיטות אלה היו מהפכניות עבור ניתוח כמותי של המוח היונקים, שבו אוכלוסיות תאים volumetric גבוהים מדי כדי לספור באופן ידני, ו stereology עכשיו את הטכניקה של בחירה בכל פעם הערכות של כמויות תלת מימדיות צריך להיות מופק מדידות על דו מימדי סעיפים. כל השיטות הסטריאולוגיות אינן משוחדות כלל; עם זאת, הם מסתמכים על הידע הנכון על מבנה העניין ואת המאפיינים של הרקמה. הסטריאולוגיה מבוססת על דגימה אקראית אחידה שיטתית (SURS), תוך התאמה של הדגימה לרמה היעילה ביותר ביחס לדיוק, תוך מתן מידע אמין וכמותי על כל מבנה העניין. כאן אנו מציגים את fractionator אופטי בשיתוף עם אימונוהיסטוכימיה BrdU לאO להעריך את הייצור ואת ההישרדות של נוירונים שזה עתה נוצרו בשכבת התא גרגר (כולל אזור משנה גרגרי) של היפוקמפוס חולדה בעקבות גירוי אלקטרו, אשר הוא בין הממריצים החזקים ביותר של neurogenesis. הטכניקה Fractator אופטי נועד לספק הערכות של המספר הכולל של תאים מקטעים עבים שנדגמו מן המבנה המלא. חלקים עבים מספקים את ההזדמנות כדי לצפות בתאים שלהם מלא 3-D היקף ובכך, לאפשר סיווג תא קל וחזק מבוסס על קריטריונים מורפולוגיים. כאשר מיושם כראוי, את הרגישות והיעילות של Fractator אופטי מספק הערכות מדויקות עם דיוק קבוע מראש.
כימות תאים במבנה תלת מימדי (3-D) עשוי לדרוש קבלת אומדנים המבוססים על עקרונות בלתי מוטים. גם כיום, מחקרים לעיתים קרובות להשתמש דו מימדי (2-D) שיטות לדווח על נתונים של מבנים 3-D. עם זאת, שיטות אלה לא רואים את האופי הטרוגני של המבנה במונחים של צורה והפצה של תאים וכתוצאה מכך מגבלות שיטתי; הם עושים הנחות על מבנה 3-D של עניין והתוצאות לא מתייחסים המבנה המלא. מגבלות אלה מקטינות את הרגישות והדיוק של השיטות וכן מגבירות את הסיכון לטעויות 1 .
הטיה בספירת תאים ניתן להימנע על ידי יישום של עיצוב מבוסס stereology, אשר הוא בעל חשיבות כללית לקבלת מידע כמותי על מספר התאים ברקמות או מבנה נתון. בעוד stereology בעבר היה מאוד זמן רב, ההתקדמות נהלים, רךו הדמיה, הפך אותו להיות הרבה יותר יעיל ויישומי נרחב. הסטריאולוגיה כרוכה בעקרונות הדגימה הסטטיסטיים ובתאוריה הגיאומטרית הסטוכסטית על מנת לספק כלים יעילים להערכת נפח, שטח פני השטח, אורך ומספר אובייקטים במבנה תלת-ממדי על ידי דגימה בסעיפים 2-D. לפיכך, stereology מאפשר אחד כדי לקבל נתונים כמותיים משוחדת על שינויים מבניים בסעיפים רקמות, אשר נותנים הערכות הממוצע של המספרים האמיתיים, ללא ניתוח ממצה 1 . הסטריאולוגיה מוגדרת כהפרש סטטיסטי של פרמטרים גיאומטריים ממידע שנדגם. זה יכול להיות מושגת על ידי הדגימה משוחדת, כלומר דגימה אקראית שיטתית, של סעיפים, כמו גם ספירת כללים להבטיח כי לכל האובייקטים יש הסתברויות שוות להיות נספר 3 . בעוד תוצאות סטריאולוגיות יכולות להיות דרגות שונות של דיוק כפי שצוין על ידי מקדם השגיאה (CE), זה יכול להיות המודעהרק כדי להתאים את השונות הביולוגית הטבועה (מקדם השונות (CV)) על ידי התאמת כמות הדגימה כנדרש 4 , 5 . כמה מחקרים קודמים בסטריאולוגיה בחנו את ההשפעות קצרות הטווח של גירוי אלקטרו-פולסיבי (ECS) על הפלסטיות בהיפוקמפוס במכרסמים 6,7 . נתונים ממחקרים אלה מראים עלייה ראשונית במספר הכולל של נוירונים, כמו גם בידול סינפטי מוגבר בעקבות ECS חוזרת. עם זאת, מחקרים אלה לא מעריכים neurogenesis ישירות, שכן הם אינם משתמשים סמנים ספציפיים עבור התפשטות תאים.
כאן אנו מציגים יישום של שיטה סטריאולוגית, הטכניקה Fractator אופטי 8 , 9 , לכימות המספר הכולל של נוירונים שנוצרו לאחרונה בשכבת התא גזענית בהיפוקמפוס תא (GCL), כולל אזור משנה גרגרי (SGZ), כמו גם כמו שלהם לטווח ארוך sאורוויה 10 , 11 . ערכנו חולדות על לוח זמנים קליני רלוונטי של ECS (שלוש פעמים בשבוע במשך 3 שבועות), שהוא אחד הגירויים החזקים ביותר של neurogenesis 12 . בעלי חיים בקרה טופלו באמצעות אותו הליך, אך ללא עובר הנוכחי. בכל אחד מ -21 ימי הניסויים, כל החולדות הוזרקו intraperitoneally עם 5-bromo-2 '-deoxyuridine (BrdU) המשלבת לתוך DNA במקום תימידין במהלך חלוקת התא 13 . לאחר הניסוי נשמרו החולדות במשך ארבע תקופות זמן שונות (24 שעות, 3 חודשים, 6 חודשים ו -12 חודשים). באמצעות עקרון fractionator, השגנו חלק ידוע של ההיפוקמפוס באמצעות דגימה אקראית אחידה של סעיפים, והשתמש דיקטורים אופטיים (בדיקות 3-D) על דגימות רקמות עבה samosted ו immunostained. זה ציין במיוחד כי חלקים קפואים בדרך כלל להתמוטט ציר z במהלך התהליךIng, וכי דיקטורים אופטיים המבוססים על מספר משוקלל מתכוון מספר עובי יש להשתמש במקרה זה 14 . כאשר מטוס המוקד של הדיסקטורים האופטיים הועבר מרחק ידוע דרך החלק, נוירונים חיוביים BrdU נספרו כאשר התכונה שלהם עניין היה מוכר בבירור. בתחום הסטריאולוגיה יש ויכוח על המספר הכולל של חלקיקים שיש לספור 15 ; בדרך כלל 150-200 נוירונים נספרים במבנה של עניין כדי להשיג דיוק נאותה כלומר מקדם של 7-8% 8 . הספירות הנוירונאליות החיוביות של BrdU הושלמו באמצעות תוכנה סטריאולוגית עם הדמיה במיקרוסקופ סטנדרטי המצויד במצלמה ובמטרות הבאות: 2X, 4X ו- 10X וכן אובייקט טבילה של שמן 100X (צמצם מספרי = 1.40) ושלב ממונע . תנועות בכיוון z נמדדו בעזרת מיקרו-מקליט דיגיטלי. ההגדלה הסופיתהיה 3000X.
באמצעות ECS כמתודולוגיה כדי לגרום neurogenesis, אנו מוצאים עלייה מיידית של 260% היווצרות של נוירונים חדשים BrdU חיובי בהיפוקמפוס. בבריכה זו של נוירונים שנוצר בחריפות מצאנו 40% שחיקה מיום 1 עד 3 חודשים, עם כמעט 50% של נוירונים שזה עתה נוצרו שורדים לפחות 12 חודשים לאחר הטיפול 10 , 11 . הספירה של נוירונים שכותרתו BrdU בעקבות ערכת הדגימה קפדנית, לפיה את כל ההיפוקמפוס נחתך לתוך חלקים עבה 80 מיקרומטר ואחריו תת דגימה של כל סעיף 5 עם התחלה דגימה אקראית בין סעיף 1 לבין סעיף 5. בחירת החלקים הללו נבחרת באופן אקראי ושיטתי, זוהי דרך מצוינת להפחתת השונות של התוצאה הסופית, ללא ספירה ממצה 1 . זו ערכת הדגימה אפשרה לנו לספור נוירונים BrdU חיובי בממוצע של 12 (8-16) hippocampאל חלקים בכל מוח חולדה, עם דיוק סופי של 9-11%.
בעת שימוש בשיטה fractionator, חשוב לדעת את החלק של גובה הסעיף שבו ספירת מתבצע, מאז התכווצות רקמה דפורמציה מתרחשת לעתים קרובות במהלך עיבוד היסטולוגית 14 . ואכן, ראינו התכווצות ניכרת של עובי במחקר זה. יתר על כן, יש לציין כי הצטמקות רקמה דיפרנציאלית עשויה להתרחש, כפי שהוצג Dorph-Petersen et al. 2001. עם זאת, כל עוד המבנה המלא של הריבית זמין לניתוח, מגבלות אלה לא לגרום הטיה של המספר הכולל של חלקיקים, כלומר נוירונים BrdU חיובי. במחקרים בהם הצטמקות רקמות היא בעיה מסוימת, יש תמיד לציין כי התוצאות מתקבלות ברקמות מעוותות. במחקר זה, ספרנו בגובה של 10 מיקרומטר. לקטעים של המחקר הנוכחי היה עובי ממוצע סופי של 26 מיקרומטר, 5 מיקרומטראזור השמירה בחלק העליון ואת אזור 11 מיקרומטר (מתכוון) השומר בחלק התחתון של הקטע. פרמטרים אלה מקובלים מאז אזורי השמירה צריך להיות בערך קוטר של החלקיקים שנדגמו.
לאחר התיחום של GCL / SGZ, דיקטורים היו ממוקמים באופן אקראי באופן אקראי בתוך השטח המסומן. יש להציב את הדיסקטורים באורך קבוע, הממטב את הדגימה והספירה כדי להשיג ביעילות אומדנים בדיוק כפי שנקבע על ידי החוקר. דיוק אופטימלי מושגת בדרך כלל על ידי ספירת עד 150-200 תאים בכל מבנה של עניין 5 . במחקר הנוכחי, ספרנו ממוצע של 133 (טווח 33-372) נוירונים חיוביים BrdU בכל היפוקמפוס חולדה. בשל מספר תאים נמוך בחלק מחיות הבקרה, הספירות של נוירונים חיוביים של BrdU נפלו מתחת למספר המקובל של התאים הנדרשים כדי להשיג דיוק מתאים, וכתוצאה מכך ערכי CE גבוהים יחסית עבור מקרים אלה. חעם זאת, כפי שקיבלנו ערכים CE של פחות ממחצית ערכי CV (ראה סעיף תוצאה נציג) דגימה נוספת לספור לא היה נדרש. ערכי CV הגבוהים מראים כי התורם הגדול ביותר לשינויים שנצפו מקורו בשינוי הביולוגי. ואכן, אנו עשויים לטעון כי המספר הממוצע של נוירונים חיוביים BrdU שנספרו במחקר הנוכחי היה גבוה מהנדרש. לדוגמה, בקבוצה אחת של חולדות השגנו ערך CE של 9%, וצפתה ערך CV של 43%. במקרה זה, היינו יכולים לכוון דיוק של כ 20%. לסיכום, הדיוק של המספר הכולל של נוירונים חיוביים BrdU במחקר הנוכחי הוא מספיק בכך שהוא לוכד השפעות טיפול אמיתי על המספרים האמיתיים של חלקיקים. בשל השונות הביולוגית הגדולה יחסית בקבוצות מסוימות של בעלי חיים, ניתן היה לקבל את אותן אומדנים בדייקנות מקובלת, למרות ההוצאות הנמוכות של מאמץ. שונות ביולוגית גבוהה בתוך הקבוצות יכולה רקלקבל פיצוי על ידי הגדלת מספר בעלי חיים.
אפשר לטעון כי תקן הזהב לקבלת מספרי תאים מדויקים כרוך בספירה ממצה של כל האובייקטים של עניין. עם זאת, ברוב המחקרים של המוח זה לא אפשרי בשל המספרים העצומים של תאים. למרות יעילות הרבה יותר מאשר ספירת תאים ממצה, Fractator אופציונלי הוא זמן רב יחסית בהשוואה להקרנה פשוטה של הבדלים במספרי תאים אשר העדיף אם המספר המדויק של תאים אינו חיוני. זה הניסיון שלנו כי הבדלים של יותר מ 20-30% ניתן לאתר אך ורק על ידי הליכי ההקרנה.
אם נעשה בצורה נכונה, דגימה באמצעות stereology מבוסס עיצוב מספק הערכות משוחדת ומדויקת בצורה יעילה 1 . המאפיין הבלתי מוטה של הסטריאולוגיה מייצר הערכות, שכאשר משוכפלים, מקורב לאוכלוסייה האמיתית, ומשפר את יכולת ההחזר שלאומדן 21 . בתחילה יש לקבל מדגם מייצג של כל מבנה העניין (במחקר זה את ה- GCL / SGZ בהיפוקמפוס), דבר המאפשר הערכה בתת-קבוצה תקפה מבחינה סטטיסטית של סעיפים 4 . כדי להשיג מספר מתאים של סעיפים וספירת בדיקות אנו מיישמים את SURS, דבר המקטין את השונות בהשוואה לדגימה אקראית 8 . יתר על כן, SURS מבטיח כי חלקיקים של עניין בתוך המבנה נדגמים עם הסתברויות אותו, ללא קשר לגודל שלהם, צורה, כיוון והפצה במבנה. כמו סטראולוגיה כזו היא להיות מומלץ מאוד כאשר קבלת הערכות מדויקות ולא משוחדות היא היבט מרכזי של הפרויקט.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לסוזאן סורנסן על סיוע טכני מיומן. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מן הקרן ולוקס; קרן יאשה; קרן Aase ו Ejnar Danielsens; קרן האחים הרטמן; הבמאי יעקב מדסן ואשתו אולגה מאדנס קרן; דוקטור סופוס קרל אמיל פריס ואשתו דוריס פריס 'אמון; קרן 1870; קרן Torben ו- Alice Frimodts והקרן למחקר נוירולוגי. עריכה של כתב היד בוצעה על ידי Inglewood Biomedical Editing.
Materials | |||
5'-bromo-2'deoxyuridine – BrdU | Sigma-Aldrich | 19-160 | |
Cresyl Violet | Sigma-Aldrich | C5042 | Contains the following materials for 1 L: 0.2 g cresyl violet; 2.0 g sodiumacetate, 3 H2O; 3 ml glacial acetic acid; 1000 ml destilled water |
Cryoprotectant | Capital Region Pharmacy, DK | 861334 | Contains the following materials: Sucrose; polyvinylpyrrolidon PVP 40; sodiumphosphatebuffer (0.2 M); ethylenglycol; demineralized water. |
dH2O | Capital Region Pharmacy, DK | 817205 | |
Diaminobenzidine – DAB | Sigma-Aldrich | D5637 | |
Envision-HRP | DAKO | K4001 | Peroxidase labeled polymer conjugated to goat anti-mouse immunoglobulins |
Ethanol – 70 % | Plum A/S | 201098 | |
Ethanol – 96 % | Plum A/S | 201104 | |
Ethanol – 99.9 % | Plum A/S | 201111 | |
Fetal Bovine Serum | In Vitro | BI-04-003-1A | |
H2O2 30% | Capital Region Pharmacy, DK | 896456 | |
HCl | J. T. Baker | 6081 | |
Mounting medium | Sakura | 4583 | Tissue Tek |
Mouse-anti-BrdU | Becton-Dickinson | 347580 | |
PBS buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 853436 | pH = 7.4 |
PFA | VWR | 28,794,295 | pH = 7.4 |
Phosphate buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 866533 | 0.1 mol/l, pH 7.4 |
Rapid drying mounting medium | Histolab Products AB | 801 | Pertex |
Sodium Tetraborate | Merck A/S | 1,063,080,500 | |
Sucrose | Merck A/S | 1,076,515,000 | |
Triton X-100 | Merck A/S | 1,086,031,000 | |
Xylene | VWR | 28,973,363 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Cover slips | Menzel-Gläser | 24×50 mm #0 | |
Cryostat | Leica | CM1860 | |
Digital Microcator | Heidenhain | VRZ 401 | |
Glass dishes | Brain Resaerch Laboratories | 1256 | |
Microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
Microscope camera | Olympus | DP72 | |
Microscope slides | VWR | 48311-703 | SuperFrost+ |
Motorized stage | Prior | H101A | |
Multidish Containers | Sigma-Aldrich | D6315-1CS | Nuclon 12-wells |
New-Cast software | Visiopharm | ver. 4.5.6.440 | |
Objective 2x | Nikon | CFI Plan UW 2X | |
Objective 4x | Nikon | CFI Plan Fluor 4X | |
Objective 10x | Nikon | CFI Plan Fluor 10X | |
Objective 100x oil immersion | Nikon | CFI Plan Apo Lambda DM 100X Oil | Numerical aperture 1.40 |
Orbital shaker | Gemini BV | CM-9 | Sarstedt |
Slide rack | Sakura | 4465 | |
Slide staining dishes | Sakura | 4457 | Tissue-Tek |
Specimen disc | Leica | 14037008637 | |
Staining nets | Brain Research Laboratories | 2512 | 25-wells |