ここでは、電気刺激刺激後のラット海馬における新しいニューロンの形成およびその生存を定量化するために使用される立体的方法、光学分画器を提示する。正確に実施されると、立体方法の感度と効率は、固定された所定の精度で正確な推定を保証する。
立体学的方法は、細胞または構造のサイズ、形状、配向および分布について仮定することなく、定量的パラメータを記述するように設計されている。これらの方法は、体積細胞集団が高すぎて手作業でカウントすることができない哺乳動物の脳の定量分析に革命的であり、三次元量の推定値を二次元セクション。すべての立体的方法は原則として不偏である。しかし、彼らは関心のある構造と組織の特徴についての適切な知識に頼っています。ステレオロジーは、精度に関して最も効率的なレベルにサンプリングを調整し、関心のある構造全体について信頼性の高い定量的情報を提供するシステマティック均一ランダム・サンプリング(SURS)に基づいています。ここでは、光学分画器をBrdU免疫組織化学と組み合わせて提示する神経興奮の最も強力な刺激因子の1つである電気痙攣刺激後のラット海馬の顆粒細胞層(小顆粒領域を含む)における新たに形成されたニューロンの産生および生存を推定する。光学分画器技術は、全構造からサンプリングされた厚い切片からの細胞の総数の推定値を提供するように設計される。厚い切片は、完全な3D範囲で細胞を観察する機会を提供し、形態学的基準に基づいて細胞分類を容易かつ堅牢にすることを可能にする。正確に実施されると、光学分画器の感度および効率は、固定された所定の精度で正確な推定値を提供する。
3次元(3-D)構造の細胞の定量化には、偏りのない原理に基づく推定値を得る必要があるかもしれない。今日でも、研究はしばしば二次元(2D)の方法を用いて三次元構造のデータを報告する。しかしながら、これらの方法は、細胞の形状および分布の点で構造の異種性を考慮しておらず、結果として、それらは関心のある3D構造について仮定を行い、その結果は完全な構造を指すものではない。これらの制限は、方法の感度と精度を低下させるだけでなく、エラーのリスクを増加させる1 。
所与の組織または構造中の細胞の数に関する定量的情報を得るために一般的に重要な、設計に基づく立体構造の適用によって、細胞カウントにおける偏りを回避することができる。 ステレオロジーは以前は非常に時間がかかる方法でしたが、手順の進歩、ソフトそれははるかに効率的かつ広く適用可能になっています。ステレオロジーは、統計的サンプリング原理と確率的幾何学理論を伴い、2-Dセクション2でサンプリングすることにより、3次元構造内の物体の体積、表面積、長さ、および数の推定のための効率的なツールを提供する。したがって、ステレオロジーは、網羅的な分析なしに、真の数の平均推定を与える組織切片の構造変化に関する不偏の定量的データを得ることを可能にする1 。ステレオロジーは、サンプリングされた情報からの幾何学的パラメータの統計的推測として定義される。これは、偏りのないサンプリング、すなわちセクションの系統的なランダムサンプリング、およびすべてのオブジェクトが等しい確率でカウントされることを保証する計数規則によって達成することができる3 。立体的結果は、誤差係数(CE)によって示されるように様々な程度の精度を有することができるが、これは、必要に応じてサンプリング量を調整することにより、固有の生物学的分散(変動係数(CV))に適合させることができます4,5 。これまでのいくつかの立体学的研究では、げっ歯類の海馬可塑性に及ぼす電気痙攣刺激(ECS)の短期作用を調べた6,7 。これらの研究からのデータは、反復ECS後のニューロンの総数の増加ならびにシナプスの上昇の上昇を示す。しかし、これらの研究は、細胞増殖に特異的なマーカーを使用しないため、神経発生を直接的に推定しない。
ここでは、サブグラニュラーゾーン(SGZ)を含むラット海馬顆粒細胞層(GCL)における新たに形成されたニューロンの総数を定量化するための立体的方法、光学分画器技術8,9彼らの長期的なものとして謝罪10,11 。我々は、ラットに、神経新生の最も強力な刺激因子の1つである、ECSの臨床関連スケジュール(週3回、3週間)を施した12 。対照動物は、電流を流さずに同じ手順を用いて処置した。 21日間の実験の各々において、全てのラットに、細胞分裂13の間にチミジンの代わりにDNAに取り込まれる5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(BrdU)を腹腔内注射した。実験後、ラットを4つの異なる期間(24時間、3ヶ月、6ヶ月および12ヶ月)維持した。分画器の原理を使用して、セクションの均一な無作為抽出による海馬の既知の画分を得、サンプルおよび免疫染色された厚い組織切片に適用された光学的ディシジョン(3-Dプローブ)を行った。凍結切片は、通常、プロセス中にz軸で崩壊するこの特定の場合には、数加重平均断面厚さに基づく光学ディテクタを使用する必要があります14 。光学ディテクターの焦点面がその区間を通って既知の距離だけ下方に移動すると、BrdU陽性ニューロンは、その特徴がはっきりと認識されたときに数えられた。立体学の分野では、計数すべき粒子の総数についていくつかの議論がある。適切な精度、 すなわち 7〜8%の係数を得るために、典型的には150〜200個のニューロンが関心構造内で数えられる。 BrdU陽性神経細胞数は、カメラを備えた標準的な顕微鏡および2倍、4倍および10倍ならびに100倍の油浸対物レンズ(開口数= 1.40)および電動ステージ。 z方向の動きは、デジタルマイクロカッターで測定した。最終倍率3000Xだった。
神経新生を誘導するための方法論としてECSを使用すると、我々は、海馬における新しいBrdU陽性ニューロンの形成において260%の即時増加を見出す。この急激に生成されたニューロンのプールでは、1日目から3ヶ月目までに40%の減少が見られ、新たに形成されたニューロンの約50%が治療後少なくとも12ヶ月生存した10,11 。 BrdUで標識されたニューロンの計数は厳密なサンプリングスキームに従った。海馬全体を80μm厚の切片に切断した後、セクション1とセクション5との間のランダムサンプリングを開始して5 番目のセクションごとにサブサンプリングした。これらのセクションを系統的なランダムな方法で選択することは、徹底的な集計をすることなく、最終結果の分散を減らす優れた方法です1 。このサンプリングスキームは、BrdU陽性ニューロンを平均12(8-16)の海馬で計数することを可能にした各ラットの脳の全切片であり、最終的な精度は9〜11%である。
分画器法を使用する場合、組織収縮および変形は組織学的処理中に頻繁に起こるため、計数を行うセクションの高さの部分を知ることが不可欠である14 。実際、本研究では厚さの実質的な収縮が見られた。さらに、Dorph-Petersenらに提示されているように、示差的な組織収縮が起こる可能性があることに留意すべきである。しかしながら、分析のために完全な構造が利用可能である限り、これらの制限は、粒子、 すなわち BrdU陽性ニューロンの総数の偏りをもたらさない。組織収縮が特に問題となる研究では、結果が変形組織で得られると常に述べるべきである。この研究では、10μmのディセクター高さでカウントした。本研究の断面は、最終平均厚さ26μm、5μm上部にガードゾーン、下部に11μm(平均)のガードゾーンがあります。これらのパラメータは、ガードゾーンがサンプリングされた粒子のおおよその直径でなければならないので、許容可能である。
GCL / SGZの描写に続いて、ディセクタは、描写された領域内に均一にランダムに配置された。検査官が決定した精度で推定値を効率的に得るために、標本化および計数を最適化する固定されたステップ長さで配置されるべきである。最適な精度は、典型的には、関心のある各構造において150~200個の細胞を計数することによって達成される。今回の研究では、各ラット海馬に平均133のBrdU陽性ニューロン(範囲33〜372)を計数した。いくつかの対照動物では細胞数が低いため、BrdU陽性ニューロンの数は適切な精度を得るために必要とされる一般的に許容される細胞数を下回り、そのために比較的高いCE値をもたらした。 HCV値の半分以下のCE値を得たので(代表的な結果の項を参照)、追加のサンプリングとカウントは必要ありませんでした。 CV値が高いことは、観察された変動に対する最大の寄与が生物学的変動に起因することを示している。実際、本研究で計数したBrdU陽性ニューロンの平均数は必要以上に多くなったと主張するかもしれない。例えば、ある群のラットにおいて、9%のCE値を達成し、43%のCV値を観察した。この特定のケースでは、約20%の精度を目指すことができました。要約すると、本研究におけるBrdU陽性ニューロンの総数の精度は、真の数の粒子に対する実際の治療効果を捕捉するのに十分である。ある種の動物群ではかなり大きな生物学的変異があるため、労力を費やすことなく、許容できる精度で同じ推定値を得ることができました。グループ内の高い生物学的差異は、動物の数を増やすことによって補償される。
正確な細胞数を得るためのゴールドスタンダードには、関心のあるすべての対象物の網羅的なカウントが必要であると主張するかもしれない。しかし、脳の大部分の研究では、これは膨大な数の細胞に起因する可能性はない。徹底的な細胞計数よりはるかに効率的であるが、任意の分画器は、正確な細胞数が必須ではない場合に好ましい細胞数の単純なスクリーニングと比較して、比較的時間がかかる。 20-30%を超える違いがスクリーニング手順によって純粋に検出されるのは私たちの経験です。
正しく実行された場合、設計ベースの立体視を使用したサンプリングは、効率的な方法で偏っていない正確な推定を提供する1 。ステレオロジーのバイアスのない特性は、複製されたときに、真の母集団平均を近似し、その再現性を高める推定値を生成する。推定21 。最初に、セクション4の統計的に有効なサブセットの推定を可能にする目的の構造全体(この研究では海馬GCL / SGZ)の代表的なサンプルを取得しなければならない。適切な数のセクションとカウントプローブを得るために、SURSを適用します.SURSはランダムサンプリングに比べて分散を減少させます8 。さらに、SURSは、構造内の対象粒子が構造内のサイズ、形状、向きおよび分布とは無関係に同じ確率でサンプリングされることを保証します。そのような立体視は、プロジェクトの中心的な側面である、正確で偏りのない見積もりを得るために強く推奨される。
The authors have nothing to disclose.
巧みな技術援助のためにSusanneSørensenに感謝します。この作品はVelux財団からの助成金によって支えられました。ジャシュカ財団。 AaseとEjnar Danielsens財団;ハートマンブラザーズ財団; Jacob Madsen監督とOlga Madsens妻の妻。ドクター・ソフィス・カール・エミール・フリス(Dissis Friis) 1870年の財団; TorbenとAlice Frimodts財団と神経学研究のための財団。原稿編集はInglewood Biomedical Editingで行った。
Materials | |||
5'-bromo-2'deoxyuridine – BrdU | Sigma-Aldrich | 19-160 | |
Cresyl Violet | Sigma-Aldrich | C5042 | Contains the following materials for 1 L: 0.2 g cresyl violet; 2.0 g sodiumacetate, 3 H2O; 3 ml glacial acetic acid; 1000 ml destilled water |
Cryoprotectant | Capital Region Pharmacy, DK | 861334 | Contains the following materials: Sucrose; polyvinylpyrrolidon PVP 40; sodiumphosphatebuffer (0.2 M); ethylenglycol; demineralized water. |
dH2O | Capital Region Pharmacy, DK | 817205 | |
Diaminobenzidine – DAB | Sigma-Aldrich | D5637 | |
Envision-HRP | DAKO | K4001 | Peroxidase labeled polymer conjugated to goat anti-mouse immunoglobulins |
Ethanol – 70 % | Plum A/S | 201098 | |
Ethanol – 96 % | Plum A/S | 201104 | |
Ethanol – 99.9 % | Plum A/S | 201111 | |
Fetal Bovine Serum | In Vitro | BI-04-003-1A | |
H2O2 30% | Capital Region Pharmacy, DK | 896456 | |
HCl | J. T. Baker | 6081 | |
Mounting medium | Sakura | 4583 | Tissue Tek |
Mouse-anti-BrdU | Becton-Dickinson | 347580 | |
PBS buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 853436 | pH = 7.4 |
PFA | VWR | 28,794,295 | pH = 7.4 |
Phosphate buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 866533 | 0.1 mol/l, pH 7.4 |
Rapid drying mounting medium | Histolab Products AB | 801 | Pertex |
Sodium Tetraborate | Merck A/S | 1,063,080,500 | |
Sucrose | Merck A/S | 1,076,515,000 | |
Triton X-100 | Merck A/S | 1,086,031,000 | |
Xylene | VWR | 28,973,363 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Cover slips | Menzel-Gläser | 24×50 mm #0 | |
Cryostat | Leica | CM1860 | |
Digital Microcator | Heidenhain | VRZ 401 | |
Glass dishes | Brain Resaerch Laboratories | 1256 | |
Microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
Microscope camera | Olympus | DP72 | |
Microscope slides | VWR | 48311-703 | SuperFrost+ |
Motorized stage | Prior | H101A | |
Multidish Containers | Sigma-Aldrich | D6315-1CS | Nuclon 12-wells |
New-Cast software | Visiopharm | ver. 4.5.6.440 | |
Objective 2x | Nikon | CFI Plan UW 2X | |
Objective 4x | Nikon | CFI Plan Fluor 4X | |
Objective 10x | Nikon | CFI Plan Fluor 10X | |
Objective 100x oil immersion | Nikon | CFI Plan Apo Lambda DM 100X Oil | Numerical aperture 1.40 |
Orbital shaker | Gemini BV | CM-9 | Sarstedt |
Slide rack | Sakura | 4465 | |
Slide staining dishes | Sakura | 4457 | Tissue-Tek |
Specimen disc | Leica | 14037008637 | |
Staining nets | Brain Research Laboratories | 2512 | 25-wells |