Her presenterer vi en stereologisk metode, den optiske fraksjonatoren, som brukes til å kvantifisere dannelsen av nye nevroner, og deres overlevelse i rottehippocampus etter elektrokonvulsiv stimulering. Når korrekt implementert, sikrer følsomheten og effektiviteten til stereologiske metoder nøyaktige estimater med en fast og forhåndsbestemt presisjon.
Stereologiske metoder er utformet for å beskrive kvantitative parametere uten å anta forutsetninger om størrelse, form, orientering og distribusjon av celler eller strukturer. Disse metodene har vært revolusjonerende for kvantitativ analyse av pattedyrhjernen, hvor volumetriske cellepopulasjoner er for høye til å telle manuelt, og stereologi er nå den valgte teknikken når estimater av tredimensjonale mengder må utvinnes fra målinger på todimensjonale seksjoner. Alle stereologiske metoder er i prinsippet objektive; De stoler imidlertid på riktig kunnskap om strukturen av interesse og egenskapene til vevet. Stereologi er basert på systematisk ensartet tilfeldig sampling (SURS), med justering av prøvetaking til det mest effektive nivået med hensyn til presisjon, og gir pålitelig, kvantitativ informasjon om hele strukturen av interesse. Her presenterer vi den optiske fraksjonatoren i forbindelse med BrdU immunhistokjemi tO Estimere produksjon og overlevelse av nyformede nevroner i granulasjonscellelaget (inkludert den undergranulære sonen) av rottehippocampusen etter elektrokonvulsiv stimulering, som er blant de mest potente stimulatorene til neurogenese. Den optiske fraksjoneringsteknikken er utformet for å gi estimater av totalt antall celler fra tykke seksjoner samplet fra den fulle strukturen. Tykke seksjoner gir mulighet til å observere celler i sin fulle 3-D-grad og dermed tillate enkel og robust celleklassifisering basert på morfologiske kriterier. Når korrekt implementert, gir sensitiviteten og effektiviteten til den optiske fraksjonatoren nøyaktige estimater med en fast og forhåndsbestemt presisjon.
Kvantifisering av celler i en tredimensjonal (3-D) struktur kan kreve å oppnå estimater basert på objektive prinsipper. Selv i dag bruker studier ofte todimensjonale (2-D) metoder for å rapportere data om 3-D-strukturer. Imidlertid vurderer disse metodene ikke den heterogene karakteren av strukturen når det gjelder form og distribusjon av celler som resulterer i metodiske begrensninger; De gjør antagelser om 3-D-strukturen av interesse, og resultatene refererer ikke til den komplette strukturen. Disse begrensningene reduserer følsomheten og nøyaktigheten av metodene, samt øker risikoen for feil 1 .
Bias i celle telling kan unngås ved anvendelse av design-basert stereologi, som er av generell betydning for å skaffe kvantitativ informasjon om antall celler i et gitt vev eller struktur. Mens stereologi tidligere har vært en svært tidkrevende metode, fremskritt i prosedyrer, mykWare og bildebehandling, har gjort det blitt mye mer effektivt og vidt anvendelig. Stereologi innebærer statistiske samplingsprinsipper og stokastisk geometrisk teori for å gi effektive verktøy for estimering av volum, overflateareal, lengde og antall objekter i en 3-D struktur ved prøvetaking i 2-D seksjoner 2 . Dermed gir stereologi en til å oppnå upartiske kvantitative data om strukturelle endringer i vevseksjoner, noe som gir gjennomsnittlige estimater av de sanne tallene, uten uttømmende analyse 1 . Stereologi er definert som den statistiske inngangen til geometriske parametere fra samplet informasjon. Dette kan oppnås ved upartisk prøvetaking, det vil si systematisk tilfeldig prøvetaking, av seksjoner samt telleregler som sikrer at alle objekter har like muligheter for å bli talt 3 . Mens stereologiske resultater kan ha varierende grad av presisjon som angitt av feilkoeffisienten (CE), kan dette være annonseJustert for å passe til den iboende biologiske variansen (varianskoeffisienten) ved å justere mengden av prøvetaking som nødvendig 4 , 5 . Noen tidligere stereologiske studier har undersøkt kortsiktige effekter av elektrokonvulsiv stimulering (ECS) på hippocampal plasticitet hos gnagere 6,7 . Data fra disse studiene viser en innledende økning i totalt antall nevroner samt forhøyet synaptisk differensiering etter gjentatt ECS. Imidlertid estimerer disse studiene ikke nøyeogenese direkte, da de ikke bruker spesifikke markører for celleproliferasjon.
Her presenterer vi en anvendelse av en stereologisk metode, den optiske fraksjoneringsteknikken 8 , 9 , for å kvantifisere det totale antall nybildede nevroner i rottehippocampal granulatcellelaget (GCL), inkludert også den undergranulære sonen (SGZ) Som deres langsiktige sUrvival 10 , 11 . Vi underkastet rotter til en klinisk relevant tidsplan for ECS (tre ganger i uken i 3 uker), som er en av de mest potente stimulatorene til nevrogenese 12 . Kontrolldyr ble behandlet under anvendelse av samme fremgangsmåte, men uten å føre strøm. På hver av de 21 døgnene av eksperimentet ble alle rotter injisert intraperitonealt med 5-brom-2'-deoksyuridin (BrdU) som inkorporerer i DNA i stedet for tymidin under celledeling 13 . Etter eksperimentering ble rotter opprettholdt i fire forskjellige tidsperioder (24 timer, 3 måneder, 6 måneder og 12 måneder). Ved bruk av fraksjonsprinsippet oppnådde vi en kjent fraksjon av hippocampuset gjennom ensartet tilfeldig prøvetaking av seksjoner og påførte optiske disektorer (3-D-prober) til de samplede og immunfargede tykke vevseksjonene. Det er spesielt bemerket at frosne seksjoner vanligvis faller sammen i z-aksen under prosessenOg at optiske disektorer basert på den antallvektede midlere seksjonstykkelse skal benyttes i dette spesielle tilfellet 14 . Som fokalplanet til de optiske disektorer ble flyttet en kjent avstand ned gjennom seksjonen, ble BrdU-positive nevroner telt da deres egenskaper av interesse var tydelig anerkjent. I stereologien er det noen debatt om det totale antall partikler som skal regnes 15 ; Typisk 150-200 nevroner regnes i strukturen av interesse for å oppnå tilstrekkelig presisjon, dvs. en koeffisient på 7-8% 8 . BrdU-positive neurontalene ble fullført ved hjelp av stereologisk programvare med avbildning ved hjelp av et standardmikroskop utstyrt med kamera og følgende mål: 2X, 4X og 10X samt et 100X oljedempingsmål (numerisk blenderåpning = 1,40) og en motorisert scene . Bevegelser i z-retningen ble målt med en digital mikrocator. Den endelige forstørrelsenVar 3000X.
Ved å bruke ECS som metode for å indusere neurogenese finner vi en umiddelbar økning på 260% i dannelsen av nye BrdU-positive nevroner i hippocampus. I dette bassenget av akutte genererte nevroner fant vi 40% avgang fra dag 1 til 3 måneder, med nesten 50% av de nylig dannede nevronene overlevde minst 12 måneder etter behandling 10 , 11 . Tellingen av BrdU-merkede nevroner fulgte et strengt utvalgsskjema, hvorved hele hippocampus ble kuttet i 80 μm tykke seksjoner etterfulgt av undersampling av hver 5. del med en tilfeldig prøveuttak mellom del ett og seksjon fem. Å gi disse delene er valgt på en systematisk tilfeldig måte, dette er påviselig en utmerket metode for å redusere variansen til sluttresultatet, uten uttømmende telling 1 . Dette prøvetakingssystemet tillot oss å telle BrdU-positive nevroner i et gjennomsnitt på 12 (8-16) hippocampAl seksjoner i hver rottehjerne, med en endelig presisjon på 9-11%.
Ved bruk av fraksjoneringsmetoden er det viktig å kjenne fraksjonen av seksjonshøyden der teller utføres, siden vevskrymping og deformasjon ofte oppstår under histologisk behandling 14 . Faktisk så vi tydelig nedgang i tykkelsen i denne studien. Videre bør det bemerkes at differensial vevskrymping kan forekomme, som presentert i Dorph-Petersen et al. 2001. Så lenge den totale interessestrukturen er tilgjengelig for analyse, resulterer disse begrensningene ikke i en bias av det totale antall partikler, det vil si BrdU-positive nevroner. I studier hvor vevskrymping er et bestemt problem, bør det alltid oppgis at resultatene oppnås i deformert vev. I denne studien telt vi i en disektorhøyde på 10 μm. Seksjonene i den foreliggende studien hadde en endelig middeltykkelse på 26 μm, en 5 μmVaktsone øverst og en 11-μm (middel) vaktsone nederst på seksjonen. Disse parametrene er akseptable siden vaktsonene skal være omtrent diameteren av de samplede partiklene.
Etter avgrensning av GCL / SGZ ble disktorer jevnt plassert i det avgrensede området. Disektorene skal plasseres med en fast trinnlengde som optimaliserer prøvetaking og telling for effektivt å oppnå estimater med en presisjon bestemt av etterforskeren. Optimal presisjon oppnås typisk ved å telle opptil 150-200 celler i hver interessestruktur 5 . I den foreliggende studien telt vi et gjennomsnitt på 133 (rekkevidde 33-372) BrdU-positive nevroner i hver rottehippocampus. På grunn av lave celle tall i noen av kontrolldyrene, falt våre teller av BrdU-positive nevroner under det generelt akseptable antall celler som var nødvendig for å oppnå en passende presisjon, noe som resulterte i relativt høye CE-verdier for disse tilfellene. HOwever, da vi oppnådde CE-verdier på mindre enn halvparten av CV-verdiene (se representativ resultateksjon) var det ikke nødvendig med ytterligere prøvetaking og telling. Høye CV-verdier viser at den største bidragsyteren til den observerte variasjonen stammer fra den biologiske variasjonen. Faktisk kan vi hevde at gjennomsnittlig antall BrdU-positive nevroner som ble talt i den foreliggende studien, var høyere enn nødvendig. For eksempel oppnådde vi i en gruppe rotter en CE-verdi på 9%, og observert en CV-verdi på 43%. I dette tilfellet kunne vi ha sikret en presisjon på ca 20%. Oppsummert er presisjonen til det totale antall BrdU-positive nevroner i den foreliggende studien tilstrekkelig ved at den fanger opp virkelige behandlingseffekter på det sanne antall partikler. På grunn av den ganske store biologiske variasjonen i bestemte grupper av dyr kunne de samme estimatene ha blitt oppnådd med en akseptabel presisjon, til tross for mindre utgifter til innsats. Høye biologiske avvik i grupper kan bareKompenseres ved å øke antall dyr.
Man kan hevde at gullstandarden for å oppnå nøyaktige celle tall innebærer uttømmende telling av alle gjenstandene av interesse. Men i de fleste hjernestudier er dette ikke en mulighet på grunn av det store antallet celler. Selv om det er mye mer effektivt enn uttømmende celletelling, er valgfri fraksjonator relativt tidkrevende i forhold til enkel screening av forskjeller i celle tall som er foretrukket dersom det nøyaktige antall celler ikke er essensielt. Det er vår erfaring at forskjeller på mer enn 20-30% kan oppdages rent ved screening prosedyrer.
Hvis det utføres riktig, gir prøvetaking ved hjelp av designbasert stereologi enkle og presise estimater på en effektiv måte 1 . Den objektive egenskapen til stereologi produserer estimater for at når den replikeres, omtrentlig sanne populasjonsmiddel, og øke reproduserbarheten avAnslå 21 . I utgangspunktet må det oppnås et representativt utvalg av hele interessekonstruksjonen (i denne studien, Hippocampal GCL / SGZ), slik at det kan estimeres i et statistisk gyldig delsett av seksjoner 4 . For å få et passende antall seksjoner og tellerprober bruker vi SURS, noe som reduserer variansen i forhold til tilfeldig prøvetaking 8 . Videre sikrer SURS at partiklene av interesse i strukturen samples med de samme sannsynlighetene, uavhengig av størrelse, form, orientering og fordeling i strukturen. Som sådan er stereologien sterkt anbefalt når man oppnår presise og objektive estimater, et sentralt aspekt av prosjektet.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Susanne Sørensen for den dyktige tekniske assistansen. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra The Velux Foundation; The Jascha Foundation; Aase og Ejnar Danielsens Stiftelse; Hartmann Brothers Foundation; Direktør Jacob Madsen og kone Olga Madsens Foundation; Doktor Sofus Carl Emil Friis og kone Doris Friis 'Trust; Stiftelsen 1870; Torben og Alice Frimodts Foundation og Stiftelsen for Neurologisk Forskning. Manuskriptredigering ble utført av Inglewood Biomedical Editing.
Materials | |||
5'-bromo-2'deoxyuridine – BrdU | Sigma-Aldrich | 19-160 | |
Cresyl Violet | Sigma-Aldrich | C5042 | Contains the following materials for 1 L: 0.2 g cresyl violet; 2.0 g sodiumacetate, 3 H2O; 3 ml glacial acetic acid; 1000 ml destilled water |
Cryoprotectant | Capital Region Pharmacy, DK | 861334 | Contains the following materials: Sucrose; polyvinylpyrrolidon PVP 40; sodiumphosphatebuffer (0.2 M); ethylenglycol; demineralized water. |
dH2O | Capital Region Pharmacy, DK | 817205 | |
Diaminobenzidine – DAB | Sigma-Aldrich | D5637 | |
Envision-HRP | DAKO | K4001 | Peroxidase labeled polymer conjugated to goat anti-mouse immunoglobulins |
Ethanol – 70 % | Plum A/S | 201098 | |
Ethanol – 96 % | Plum A/S | 201104 | |
Ethanol – 99.9 % | Plum A/S | 201111 | |
Fetal Bovine Serum | In Vitro | BI-04-003-1A | |
H2O2 30% | Capital Region Pharmacy, DK | 896456 | |
HCl | J. T. Baker | 6081 | |
Mounting medium | Sakura | 4583 | Tissue Tek |
Mouse-anti-BrdU | Becton-Dickinson | 347580 | |
PBS buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 853436 | pH = 7.4 |
PFA | VWR | 28,794,295 | pH = 7.4 |
Phosphate buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 866533 | 0.1 mol/l, pH 7.4 |
Rapid drying mounting medium | Histolab Products AB | 801 | Pertex |
Sodium Tetraborate | Merck A/S | 1,063,080,500 | |
Sucrose | Merck A/S | 1,076,515,000 | |
Triton X-100 | Merck A/S | 1,086,031,000 | |
Xylene | VWR | 28,973,363 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Cover slips | Menzel-Gläser | 24×50 mm #0 | |
Cryostat | Leica | CM1860 | |
Digital Microcator | Heidenhain | VRZ 401 | |
Glass dishes | Brain Resaerch Laboratories | 1256 | |
Microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
Microscope camera | Olympus | DP72 | |
Microscope slides | VWR | 48311-703 | SuperFrost+ |
Motorized stage | Prior | H101A | |
Multidish Containers | Sigma-Aldrich | D6315-1CS | Nuclon 12-wells |
New-Cast software | Visiopharm | ver. 4.5.6.440 | |
Objective 2x | Nikon | CFI Plan UW 2X | |
Objective 4x | Nikon | CFI Plan Fluor 4X | |
Objective 10x | Nikon | CFI Plan Fluor 10X | |
Objective 100x oil immersion | Nikon | CFI Plan Apo Lambda DM 100X Oil | Numerical aperture 1.40 |
Orbital shaker | Gemini BV | CM-9 | Sarstedt |
Slide rack | Sakura | 4465 | |
Slide staining dishes | Sakura | 4457 | Tissue-Tek |
Specimen disc | Leica | 14037008637 | |
Staining nets | Brain Research Laboratories | 2512 | 25-wells |