Här presenterar vi en stereologisk metod, den optiska fraktionen, som används för att kvantifiera bildandet av nya neuroner och deras överlevnad i råttahippocampus efter elektrokonvulsiv stimulering. När korrekt implementeras säkerställer känsligheten och effektiviteten hos stereologiska metoder noggranna uppskattningar med en bestämd och förbestämd precision.
Stereologiska metoder är utformade för att beskriva kvantitativa parametrar utan att göra antaganden om storlek, form, orientering och fördelning av celler eller strukturer. Dessa metoder har varit revolutionerande för kvantitativ analys av däggdjurshjärnan, i vilken volymetriska cellpopulationer är för höga för att räkna manuellt och stereologi är nu den valfria tekniken när uppskattningar av tredimensionella kvantiteter behöver extraheras från mätningar på tvådimensionella sektioner. Alla stereologiska metoder är i princip objektiva; De litar dock på korrekt kunskap om intressestrukturen och vävnadens egenskaper. Stereologin baseras på systematisk enhetlig slumpmässig sampling (SURS), med justering av provtagning till den mest effektiva nivån med avseende på precision, vilket ger pålitlig, kvantitativ information om hela intressekonstruktionen. Här presenterar vi den optiska fraktionen i samband med BrdU immunohistokemi tO uppskatta produktion och överlevnad av nybildade neuroner i granulatcellskiktet (inklusive den subgranulära zonen) hos råtthippocampus efter elektrokonvulsiv stimulering, som är bland de mest potenta stimulatorerna för neurogenes. Den optiska fraktioneringstekniken är utformad för att ge uppskattningar av det totala antalet celler från tjocka sektioner samplade från hela strukturen. Tjocka sektioner ger möjlighet att observera celler i sin fulla 3-D-utsträckning och möjliggör sålunda enkel och robust cellklassificering baserat på morfologiska kriterier. När korrekt implementeras, ger känsligheten och effektiviteten hos den optiska fraktionern noggranna uppskattningar med en fast och förutbestämd precision.
Kvantifiering av celler i en tredimensionell (3-D) struktur kan kräva att man erhåller uppskattningar baserat på objektiva principer. Även idag använder studier ofta tvådimensionella (2-D) metoder för att rapportera data om 3-D-strukturer. Emellertid anser dessa metoder inte strukturen heterogena när det gäller form och distribution av celler som resulterar i metodiska begränsningar; De gör antaganden om 3-D-strukturen av intresse och resultaten hänvisar inte till den fullständiga strukturen. Dessa begränsningar minskar känsligheten och noggrannheten hos metoderna samt ökar risken för fel 1 .
Bias i cellräkning kan undvikas genom tillämpning av designbaserad stereologi, vilken är av allmän betydelse för att erhålla kvantitativ information om antalet celler i en given vävnad eller struktur. Medan stereologi tidigare har varit en mycket tidskrävande metod, framsteg i förfaranden, mjukWare och bildbehandling har gjort det mycket mer effektivt och allmänt tillämpligt. Stereologi medför statistiska provtagningsprinciper och stokastisk geometrisk teori för att tillhandahålla effektiva verktyg för uppskattning av volymen, ytan, längden och antalet objekt i en 3-D struktur genom provtagning i 2-D sektioner 2 . Sålunda tillåter stereologi att man erhåller obearbetade kvantitativa data om strukturella förändringar i vävnadssektioner, vilket ger genomsnittliga uppskattningar av de sanna siffrorna, utan uttömmande analys 1 . Stereologi definieras som den statistiska inferensen av geometriska parametrar från samplad information. Detta kan uppnås genom objektsampling, det vill säga systematisk stickprovtagning, av sektioner samt räkning av regler som säkerställer att alla objekt har lika sannolikheter att räknas 3 . Medan stereologiska resultat kan ha varierande grad av precision som anges av felkoefficienten (CE) kan detta vara annonsJusterad för att passa den inneboende biologiska variansen (varianskoefficienten) genom att justera mängden provtagning som krävs 4 , 5 . Några tidigare stereologiska studier har undersökt de kortsiktiga effekterna av elektrokonvulsiv stimulering (ECS) på hippocampal plasticitet hos gnagare 6,7 . Data från dessa studier visar en initial ökning av det totala antalet neuroner samt förhöjd synaptisk differentiering efter upprepad ECS. Emellertid uppskattar dessa studier inte neurogenes direkt, eftersom de inte använder specifika markörer för cellproliferation.
Här presenterar vi en tillämpning av en stereologisk metod, den optiska fraktioneringstekniken 8 , 9 , för att kvantifiera det totala antalet nybildade neuroner i det råtta hippocampala granulacellskiktet (GCL) inklusive även den granulära zonen (SGZ) Som deras långsiktiga sUrvival 10 , 11 . Vi utsatte råttor för ett kliniskt relevant schema av ECS (tre gånger i veckan i 3 veckor), vilket är en av de mest potenta stimulatorerna av neurogenes 12 . Kontrolldjur behandlades med användning av samma förfarande, men utan att strömmen överfördes. På var och en av de 21 dagarna av experimentet injicerades alla råttor intraperitonealt med 5-brom-2'-deoxyuridin (BrdU) som inkorporerar i DNA i stället för tymidin under celldelning 13 . Efter experimentering behöll råttorna i fyra olika tidsperioder (24 timmar, 3 månader, 6 månader och 12 månader). Med användning av fraktionsprincipen erhöll vi en känd fraktion av hippocampus genom likformig slumpmässig provtagning av sektioner och applicerade optiska disektorer (3-D-prober) till de provtagna och immunfärgade tjocka vävnadssektionerna. Det är speciellt noterat att frusna sektioner brukar kollapsa i z-axeln under processenOch att optiska disektorer baserade på den antalviktade genomsnittliga sektionstjockleken bör användas i detta speciella fall 14 . När fokalplanet för de optiska disektorerna flyttades ett känt avstånd ned genom sektionen räknades BrdU-positiva neuroner när deras egenskaper av intresse var tydligt igenkända. Inom stereologin är det en del debatt om det totala antalet partiklar som ska räknas 15 ; Typiskt 150-200 neuroner räknas i strukturen av intresse för att uppnå tillräcklig precision dvs en koefficient på 7-8% 8 . De BrdU-positiva neurontalen kompletterades med användning av stereologisk mjukvara med avbildning av ett standardmikroskop utrustat med kamera och följande mål: 2X, 4X och 10X samt ett 100X oljedämpningsmål (numerisk bländare = 1,40) och ett motoriserat stadium . Rörelser i z-riktningen mättes med en digital mikrocator. Den slutliga förstoringenVar 3000X.
Med hjälp av ECS som metod för att framkalla neurogenes finner vi en omedelbar ökning av 260% vid bildandet av nya BrdU-positiva neuroner i hippocampus. I denna pool av akut genererade neuroner fann vi 40% avgång från dag 1 till 3 månader, med nästan 50% av de nybildade neuronerna som överlevde minst 12 månader efter behandling 10 , 11 . Räkning av BrdU-märkta neuroner följde ett strikt provtagningsschema, varigenom hela hippocampusen skars i 80-pm tjocka sektioner följt av delprovtagning av varje 5: e sektion med en slumpmässig provtagningsstart mellan sektion 1 och sektion fem. Att tillhandahålla dessa sektioner väljs på ett systematiskt slumpmässigt sätt, detta är bevisligen en utmärkt metod för att minska varians av slutresultatet, utan uttömmande räkning 1 . Detta provtagningsschema tillät oss att räkna BrdU-positiva neuroner i ett genomsnitt på 12 (8-16) hippocampAl sektioner i varje råtthjärna, med en slutgiltighet på 9-11%.
Vid användning av fraktionsmetoden är det väsentligt att känna av fraktionen av sektionshöjden i vilken räkning utförs, eftersom vävnadsminskning och deformation ofta uppträder under histologisk behandling 14 . Vi såg faktiskt en betydande minskning av tjockleken i denna studie. Vidare bör det noteras att differentialvävnads krympning kan uppträda, såsom presenteras i Dorph-Petersen et al. 2001. Så länge som den fullständiga intressanta strukturen är tillgänglig för analys, leder dessa begränsningar inte till en bias av det totala antalet partiklar, dvs BrdU-positiva neuroner. I studier där vävnadsminskning är ett särskilt problem bör det alltid anges att resultaten erhålls i deformerad vävnad. I denna studie räknade vi i en disektorhöjd på 10 μm. Sektionerna i föreliggande studie hade en slutlig medeltjocklek av 26 μm, en 5-umSkyddszon överst och en 11-mm (medel) skyddsområde längst ner på sektionen. Dessa parametrar är acceptabla eftersom skyddszoner borde vara ungefär diametern hos de provtagna partiklarna.
Efter avgränsning av GCL / SGZ placerades disektorerna likformigt i det avgränsade området. Disektorerna ska placeras med en fast steglängd som optimerar provtagningen och räkningen för att effektivt uppnå uppskattningar med en precision som bestäms av utredaren. Optimal precision uppnås typiskt genom att räkna upp till 150-200 celler i varje intressant struktur 5 . I den föreliggande studien räknade vi ett medelvärde av 133 (intervall 33-372) BrdU-positiva neuroner i varje råtthippocampus. På grund av låga celltal i vissa av kontrolldjuren föll våra räkningar av BrdU-positiva neuroner under det allmänt acceptabla antalet celler som erfordras för att erhålla en lämplig precision, vilket resulterade i relativt höga CE-värden för dessa fall. HOwever, eftersom vi fick CE-värden på mindre än hälften av CV-värdena (se representativa resultatavsnitt) krävs ytterligare provtagning och räkning. De höga CV-värdena visar att den största bidragsgivaren till den observerade variationen härrör från den biologiska variationen. Faktum är att vi kan hävda att det genomsnittliga antalet BrdU-positiva neuroner som räknades i föreliggande studie var högre än nödvändigt. Till exempel uppnådde vi i en grupp råttor ett CE-värde på 9% och observerade ett CV-värde på 43%. I det här fallet kunde vi ha riktat oss till en precision på cirka 20%. Sammanfattningsvis är precisionen av det totala antalet BrdU-positiva neuroner i den föreliggande studien tillräcklig genom att det fångar verkliga behandlingseffekter på det verkliga antalet partiklar. På grund av den ganska stora biologiska variationen i vissa djurgrupper kunde samma uppskattningar ha erhållits med en acceptabel precision, trots mindre ansträngningar. Höga biologiska variationer inom grupper kan baraKompenseras genom att antalet djur ökar.
Man kan hävda att guldstandarden för att erhålla exakta celltal innebär en uttömmande räkning av alla föremål av intresse. Men i de flesta hjärnstudier är det inte en möjlighet på grund av det stora antalet celler. Även om det är mycket effektivare än uttömmande cellräkning, är den frivilliga fraktorn relativt tidskrävande i jämförelse med enkel screening av skillnader i cellnummer som är föredraget om det exakta antalet celler inte är väsentligt. Det är vår erfarenhet att skillnader på mer än 20-30% kan detekteras rent genom screeningprocedurer.
Om korrekt utförd ger provtagning med hjälp av designbaserad stereologi objektiva och exakta uppskattningar på ett effektivt sätt 1 . Den opartiska egenskapen hos stereologi producerar uppskattningar att när de replikeras approximerar den sanna populationens medelvärde och förbättrar reproducerbarheten hosUppskattning 21 . Initialt måste ett representativt urval av hela strukturen av intresse (i denna studie hippocampala GCL / SGZ) erhållas, vilket möjliggör uppskattning i en statistiskt giltig delmängd av sektionerna 4 . För att erhålla ett lämpligt antal sektioner och räknar prober tillämpar vi SURS, vilket minskar variansen jämfört med slumpmässig provtagning 8 . Dessutom säkerställer SURS att de intressanta partiklarna i strukturen samplas med samma sannolikheter oberoende av deras storlek, form, orientering och fördelning i strukturen. Som sådan är stereologin starkt rekommenderad när man får exakta och objektiva estimat är en central aspekt av projektet.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Susanne Sørensen för det skickliga tekniska biståndet. Detta arbete stöddes av bidrag från The Velux Foundation; Jascha Foundation; Aase och Ejnar Danielsens Stiftelse; Hartmann Brothers Foundation; Direktör Jacob Madsen och fru Olga Madsens Foundation; Doktor Sofus Carl Emil Friis och fru Doris Friis Trust; Stiftelsen 1870; Torben och Alice Frimodts Foundation och Stiftelsen för neurologisk forskning. Manuskriptredigering utfördes av Inglewood Biomedical Editing.
Materials | |||
5'-bromo-2'deoxyuridine – BrdU | Sigma-Aldrich | 19-160 | |
Cresyl Violet | Sigma-Aldrich | C5042 | Contains the following materials for 1 L: 0.2 g cresyl violet; 2.0 g sodiumacetate, 3 H2O; 3 ml glacial acetic acid; 1000 ml destilled water |
Cryoprotectant | Capital Region Pharmacy, DK | 861334 | Contains the following materials: Sucrose; polyvinylpyrrolidon PVP 40; sodiumphosphatebuffer (0.2 M); ethylenglycol; demineralized water. |
dH2O | Capital Region Pharmacy, DK | 817205 | |
Diaminobenzidine – DAB | Sigma-Aldrich | D5637 | |
Envision-HRP | DAKO | K4001 | Peroxidase labeled polymer conjugated to goat anti-mouse immunoglobulins |
Ethanol – 70 % | Plum A/S | 201098 | |
Ethanol – 96 % | Plum A/S | 201104 | |
Ethanol – 99.9 % | Plum A/S | 201111 | |
Fetal Bovine Serum | In Vitro | BI-04-003-1A | |
H2O2 30% | Capital Region Pharmacy, DK | 896456 | |
HCl | J. T. Baker | 6081 | |
Mounting medium | Sakura | 4583 | Tissue Tek |
Mouse-anti-BrdU | Becton-Dickinson | 347580 | |
PBS buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 853436 | pH = 7.4 |
PFA | VWR | 28,794,295 | pH = 7.4 |
Phosphate buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 866533 | 0.1 mol/l, pH 7.4 |
Rapid drying mounting medium | Histolab Products AB | 801 | Pertex |
Sodium Tetraborate | Merck A/S | 1,063,080,500 | |
Sucrose | Merck A/S | 1,076,515,000 | |
Triton X-100 | Merck A/S | 1,086,031,000 | |
Xylene | VWR | 28,973,363 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Cover slips | Menzel-Gläser | 24×50 mm #0 | |
Cryostat | Leica | CM1860 | |
Digital Microcator | Heidenhain | VRZ 401 | |
Glass dishes | Brain Resaerch Laboratories | 1256 | |
Microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
Microscope camera | Olympus | DP72 | |
Microscope slides | VWR | 48311-703 | SuperFrost+ |
Motorized stage | Prior | H101A | |
Multidish Containers | Sigma-Aldrich | D6315-1CS | Nuclon 12-wells |
New-Cast software | Visiopharm | ver. 4.5.6.440 | |
Objective 2x | Nikon | CFI Plan UW 2X | |
Objective 4x | Nikon | CFI Plan Fluor 4X | |
Objective 10x | Nikon | CFI Plan Fluor 10X | |
Objective 100x oil immersion | Nikon | CFI Plan Apo Lambda DM 100X Oil | Numerical aperture 1.40 |
Orbital shaker | Gemini BV | CM-9 | Sarstedt |
Slide rack | Sakura | 4465 | |
Slide staining dishes | Sakura | 4457 | Tissue-Tek |
Specimen disc | Leica | 14037008637 | |
Staining nets | Brain Research Laboratories | 2512 | 25-wells |