Burada, elektrokonvülsif uyarımı takiben sıçan hipokampusunda, yeni nöronların oluşumunu ve canlılığını ölçmek için kullanılan bir optik fraktatör olan stereolojik bir yöntemi sunuyoruz. Doğru şekilde uygulandığında, stereolojik yöntemlerin duyarlılığı ve verimliliği, sabit ve önceden belirlenmiş bir hassaslıkla doğru tahminler sağlar.
Sterolojik yöntemler, hücrelerin veya yapıların boyutu, şekli, yönelimi ve dağılımı hakkında kehanet parametrelerini tanımlamak için tasarlanmıştır. Bu yöntemler, hacimsel hücre popülasyonlarının elle sayılması çok yüksek olan memeli beyninin kantitatif analizi için devrim yarattı ve üç boyutlu niceliklerin tahminleri iki boyutlu ölçümlerle çıkarıldığında stereoloji şimdi tercih edilen tekniğe dönüştü bölümleri. Bütün stereolojik yöntemler prensipte yanlızdır; Ancak, ilgi yapısı ve doku özellikleri hakkında doğru bilgilere güvenirler. Stereoloji, duyarlılıkla ilgili olarak örneklemin en verimli seviyeye ayarlanarak, tüm yapının güvenilir, niceliksel bilgileri sağlayan Sistematik Tekbiçimli Rastgele Örneklemeye (SURS) dayanıyor. Burada BrdU immünohistokimyası ile birlikte optik fraksiyonatör sunmaktNöron oluşumunun en güçlü uyarıcıları arasında yer alan elektrokonvülsif uyarımı takiben, sıçan hipokampusunun granül hücre katmanında (alt granüler bölge de dahil olmak üzere) yeni oluşan nöronların üretimini ve hayatta kalmasını tahmin eder. Optik fraksiyonelatör tekniği, tam yapıdan örneklenen kalın kesitlerden toplam hücre sayısının tahminlerini sağlamak üzere tasarlanmıştır. Kalın bölümler, hücreleri tam 3B boyutlarında gözlemleme fırsatı sağlar ve böylece morfolojik kriterlere dayanan kolay ve sağlam hücre sınıflandırmasına izin verir. Doğru şekilde uygulandığında, optik fraksiyonelleştiricinin duyarlılığı ve verimliliği, sabit ve önceden belirlenmiş hassasiyetle doğru tahminler sağlar.
Üç boyutlu (3 boyutlu) bir yapıdaki hücrelerin nicelendirilmesi, yansız ilkelere dayanan tahminlerin elde edilmesini gerektirebilir. Bugün bile çalışmalar üç boyutlu yapıların verilerini bildirmek için sıklıkla iki boyutlu (2-D) yöntemler kullanmaktadır. Bununla birlikte, bu yöntemler yapının heterojen niteliğini, hücrelerin şekli ve dağılımı açısından metodik sınırlamalara neden olarak düşünmemektedir; Ilgi konusu 3 boyutlu yapı hakkında varsayımlar yaparlar ve sonuçlar bütün yapıyı ifade etmez. Bu kısıtlamalar yöntemlerin hassasiyetini ve doğruluğunu azaltır ve aynı zamanda hatalar riskini artırır 1 .
Hücre sayımındaki önyargılar, belirli bir doku veya yapıdaki hücre sayısı hakkında niceliksel bilgi edinmek için genel olarak önem taşıyan tasarıma dayalı stereolojinin uygulanmasıyla önlenebilir. Stereoloji eskiden çok zaman alıcı bir yöntem olsa da, prosedürlerdeki ilerlemeler, yumuşakEşyalar ve görüntüleme, çok daha verimli ve yaygın bir hale getirdi. Stereoloji, istatistiksel örnekleme prensiplerini ve stokastik geometrik teoriyi, hacim, yüzey alanı, uzunluk ve 3 boyutlu yapıdaki nesnelerin sayısının tahmini için 2-B kesitlerde örnekleme yoluyla etkili araçlar sağlamayı gerektirir 2 . Böylece, stereoloji, doku kesitlerindeki yapısal değişikliklerle ilgili, yorucu bir analiz olmaksızın, gerçek sayıların ortalama tahminlerini veren tarafsız kantitatif verileri elde etmeyi sağlar 1 . Stereoloji, örneklenen bilgilerden geometrik parametrelerin istatistiksel çıkarımı olarak tanımlanır. Bu, tarafsız örnekleme, diğer bir deyişle tüm nesnelerin 3 sayılma olasılığının eşit olmasını sağlayan sayım kurallarının yanı sıra bölümlerin sistematik rasgele örneklemesi ile elde edilebilir. Stereolojik sonuçlar, hata katsayısı (CE) ile gösterilen hassaslık derecelerini değiştirebilirken, bu durum reklam olabilirGerekli örnekleme miktarını ayarlayarak, doğal biyolojik varyansa (varyans katsayısı (CV)) uymaya hak kazandı. 4 , 5 . Daha önceki birkaç stereolojik çalışmada kemirgenlerde hiperbolik plastisite üzerine elektrokonvülsif stimülasyon (ECS) 'nin kısa vadeli etkileri incelenmiş 6,7 . Bu çalışmalardan elde edilen veriler, tekrarlayan ECS'yi takiben sinaptik farklılaşmanın yanı sıra toplam nöron sayısında bir ilk artış olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, bu çalışmalar, hücre proliferasyonu için özel belirteçler kullanmadığı için nörojenezi doğrudan tahmin etmemektedir.
Burada, alt granüler bölge (SGZ) de dahil olmak üzere, sıçan hipokampal granül hücre tabakasında (GCL) yeni oluşan nöronların sayısının nicelleştirilmesi için optik fraksiyonator tekniği 8 , 9 olan stereolojik bir yöntemin bir uygulaması sunulmaktadır Onların uzun vadeli sUrvival 10 , 11 . Sıçanları, nörogenezis 12'nin en güçlü uyarıcılarından biri olan, ECS'nin klinikle ilişkili bir çizelgesine (haftada üç kez 3 hafta boyunca) tabi tuttuk. Kontrol hayvanları, aynı prosedür kullanılarak, ancak akım geçirmeden tedavi edildi. Deneyden 21 günün her birinde sıçanlara intraperitoneal olarak hücre bölünmesi sırasında timidin yerine DNA'ya karışan 5-bromo-2'-deoksiuridin (BrdU) enjekte edildi. Deneyden sonra, sıçanlara dört farklı zaman periyodunda (24 saat, 3 ay, 6 ay ve 12 ay) devam edildi. Kesirleme prensibini kullanarak, kesitlerin rastgele rastgele örneklenmesiyle hipokampüsün bilinen bir fraksiyonu elde edildi ve örneklenmiş ve immünostained kalın doku kesitlerine optik disektörler (3-D problar) uygulandı. Dondurulmuş bölümlerin genellikle işlem sırasında z eksende çöktüğü özellikle belirtilmektedirBu durumda, sayı ağırlıklı ortalama kesit kalınlığına dayalı optik disektörler kullanılmalıdır. 14 . Optik disektörlerin odak düzlemi, kesit boyunca bilinen bir mesafeye taşınırken, BrdU-pozitif nöronlar, ilgi konusu özelliklerinin açık bir şekilde fark edildiğinde sayıldı. Stereoloji alanında sayılması gereken toplam partikül sayısı hakkında bazı tartışmalar vardır; Uygun duyarlık elde etmek için, tipik olarak 150-200 nöron ilgi yapısında sayılır, yani % 7-8 katsayısı 8 . BrdU-pozitif nöronal sayımlar kamera ve aşağıdaki hedeflerle donatılmış standart bir mikroskop ile görüntüleme ile stereolojik yazılım kullanılarak tamamlandı: 2X, 4X ve 10X gibi 100X yağ daldırmalı objektif (numerik açıklık = 1.40) ve motorize bir aşama . Z-yönündeki hareketler bir dijital mikroçiratör ile ölçülmüştür. Nihai büyütme3000X oldu.
Nörojenezi indüklemek için bir metodoloji olarak ECS'yi kullanarak, hipokampusta yeni BrdU-pozitif nöronların oluşumunda% 260'luk bir artışa rastlıyoruz. Akut olarak üretilen nöronların bu havuzunda, yeni oluşturulmuş nöronların yaklaşık% 50'si tedaviyi takiben en az 12 ay hayatta kalan, 1 ila 3 ay arasında% 40 oranında yıpranma tespit ettik. BrdU etiketli nöronların sayımı sıkı bir örnekleme planı izledi; böylece tüm hipokampüs 80 um kalınlıktaki kesitlere bölündü ve bunu her beşinci bölümün altınal örneklemesi, bölüm 1 ile bölüm beş arasında rasgele örnekleme başlattı. Bu kesitlerin sistematik bir şekilde rastgele seçilmesi şartıyla, ayrıntılı sonuç vermeden 1 nihai sonucun varyansını azaltmak için mükemmel bir yöntem olduğu açıktır. Bu örnekleme şeması, BrdU-pozitif nöronları ortalama 12 (8-16) hipokampüs içinde saymamızı sağladı.Her bir sıçan beynindeki kesitler,% 9-11'lik kesin hassasiyetle.
Fraksiyonator yöntemini kullanırken, histolojik işleme sırasında sıklıkla doku küçülmesi ve deformasyonu oluştuğundan, saymanın gerçekleştirildiği kesit yüksekliğinin kesimini bilmek önemlidir. Gerçekten de, bu çalışmada kalınlık önemli ölçüde azalma gördük. Ayrıca, Dorph-Petersen ve ark.'nda da belirtildiği gibi, farklı doku küçülmesi oluşabileceği unutulmamalıdır. Ancak, ilgilenilen bütün yapı analiz için mevcut olduğu sürece, bu kısıtlamalar, BrdU-pozitif nöronlar gibi partiküllerin toplam sayısına bir önyargı ile sonuçlanmaz. Doku çekmesinin belirli bir konudaki çalışmalarda, sonuçların deforme olmuş dokuda elde edildiği daima belirtilmelidir. Bu çalışmada, 10 μm'lik bir disektör yüksekliğinde sayılmıştır. Bu çalışmanın bölümleri nihai ortalama kalınlığı 26 μm, 5 μm'likKoruma bölgesi ve bölümün tabanında 11 μm'lik (ortalama) koruma bölgesi. Koruyucu bölgeler örneklenen parçacıkların yaklaşık çapı olması gerektiği için bu parametreler kabul edilebilir.
GCL / SGZ'nin tasvirini takiben, disektörler belirgin bir şekilde rasgele çizili alana yerleştirildi. Hâlbazlar, araştırmacı tarafından belirlenen kesinlikli tahminleri verimli bir şekilde elde etmek için örneklemeyi ve saymayı optimize eden sabit bir adım uzunluğunda yerleştirilmelidir. Optimal hassasiyet, tipik olarak, her bir yapıda 150-200 hücreye kadar sayım yaparak elde edilir 5 . Bu çalışmada, her sıçan hipokampusunda ortalama 133 (dağılım 33-372) BrdU-pozitif nöron saydık. Kontrol hayvanlarının bazılarında düşük hücre sayıları nedeniyle, BrdU-pozitif nöronların sayımları uygun hassasiyet elde etmek için gerekli genel kabul edilebilir hücre sayısının altına düştü ve bu durumlar için nispeten yüksek CE değerleri elde edildi. 'HBununla birlikte, CV değerlerinin yarısından azında CE değerleri elde ettiğimiz için (örnek sonuç bölümüne bakınız) ilave numune alma ve sayma gerekli değildi. Yüksek CV değerleri, gözlemlenen varyasyona en büyük katkıyı yapan kişinin biyolojik çeşitlemeden kaynaklandığını göstermektedir. Gerçekten de, bu çalışmada sayılan BrdU pozitif nöronların ortalama sayısının gerekli olandan fazla olduğunu iddia edebiliriz. Örneğin, bir grup sıçanda,% 9'luk bir CE değeri elde ettik ve% 43'lük bir CV değeri gördük. Bu özel durumda, yaklaşık% 20'lik bir kesinlik hedefleyebilirdik. Özetle, bu çalışmadaki BrdU-pozitif nöronların toplam sayısının hassasiyeti, parçacıkların gerçek sayısı üzerinde gerçek tedavi etkileri yakalaması açısından yeterlidir. Bazı hayvan gruplarında oldukça büyük biyolojik çeşitlilik nedeniyle, aynı tahminler daha az harcama yapılmasına rağmen kabul edilebilir bir hassasiyetle elde edilebilirdi. Gruplar içindeki yüksek biyolojik varyasyonlar yalnızcaHayvan sayısını arttırarak telafi edilmelidir.
Kişi, tam hücre sayılarını elde etmek için altın standardın, ilgilenen tüm nesnelerin kapsamlı sayılmasını gerektirdiğini iddia edebilir. Bununla birlikte, beynin çoğunda yapılan çalışmalarda, bu çok sayıda hücre yüzünden bir olasılık değildir. Kapsamlı hücre sayımından çok daha verimli olmakla birlikte, opsiyonel fraksiyonatör, doğru sayıda hücre gerekli olmadığında tercih edilen hücre sayılarındaki farklılıkların basitçe taranmasına nispeten zaman alıcıdır. Deneyimlerimiz,% 20-30'un üzerinde farklılıkların yalnızca tarama prosedürleri ile tespit edilebileceğidir.
Doğru gerçekleştirilirse, tasarıma dayalı stereolojiyi kullanarak örnekleme, tarafsız ve kesin tahminleri verimli bir şekilde sağlar 1 . Stereolojinin tarafsız özelliği, tekrarlandığında gerçek nüfus ortalamasını yaklaşık olarak tahmin eden ve bunun tekrarlanabilirliğini artıran tahminler üretir.Tahmin 21 . Başlangıçta, tüm yapıların (bu çalışmada hipokampal GCL / SGZ) temsili bir örnek alınmalı ve istatistiksel olarak geçerli olan 4. bölümlerin alt kümelerindeki tahminler yapılmalıdır. Uygun sayıda bölüm elde etmek ve sondaları saymak için, tesadüfi örnekleme 8'e kıyasla varyansı azaltan SURS uyguluyoruz. Ayrıca, SURS yapısı içindeki ilgi konusu parçacıkların yapıdaki boyutlarından, şeklinden, oryantasyonundan ve dağılımından bağımsız olarak aynı olasılıklarla örneklenmesini sağlar. Kesin ve tarafsız tahminler elde etmek için bu tür bir stereoloji önerilirse, projenin merkezi bir yönüdür.
The authors have nothing to disclose.
Susanne Sørensen'e yetenekli teknik yardım için teşekkür ederiz. Bu çalışma Velux Vakfı tarafından sağlanan hibelerle desteklendi; Jascha Vakfı; Aase ve Ejnar Danielsens Vakfı; Hartmann Brothers Vakfı; Yönetmen Jacob Madsen ve eşi Olga Madsens Vakfı; Doktor Sofus Carl Emil Friis ve eşi Doris Friis'in Güveni; 1870 Vakfı; Torben ve Alice Frimodts Vakfı ve Nörolojik Araştırma Vakfı. El yazması düzenleme Inglewood Biyomedikal Düzenlemesi tarafından yapıldı.
Materials | |||
5'-bromo-2'deoxyuridine – BrdU | Sigma-Aldrich | 19-160 | |
Cresyl Violet | Sigma-Aldrich | C5042 | Contains the following materials for 1 L: 0.2 g cresyl violet; 2.0 g sodiumacetate, 3 H2O; 3 ml glacial acetic acid; 1000 ml destilled water |
Cryoprotectant | Capital Region Pharmacy, DK | 861334 | Contains the following materials: Sucrose; polyvinylpyrrolidon PVP 40; sodiumphosphatebuffer (0.2 M); ethylenglycol; demineralized water. |
dH2O | Capital Region Pharmacy, DK | 817205 | |
Diaminobenzidine – DAB | Sigma-Aldrich | D5637 | |
Envision-HRP | DAKO | K4001 | Peroxidase labeled polymer conjugated to goat anti-mouse immunoglobulins |
Ethanol – 70 % | Plum A/S | 201098 | |
Ethanol – 96 % | Plum A/S | 201104 | |
Ethanol – 99.9 % | Plum A/S | 201111 | |
Fetal Bovine Serum | In Vitro | BI-04-003-1A | |
H2O2 30% | Capital Region Pharmacy, DK | 896456 | |
HCl | J. T. Baker | 6081 | |
Mounting medium | Sakura | 4583 | Tissue Tek |
Mouse-anti-BrdU | Becton-Dickinson | 347580 | |
PBS buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 853436 | pH = 7.4 |
PFA | VWR | 28,794,295 | pH = 7.4 |
Phosphate buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 866533 | 0.1 mol/l, pH 7.4 |
Rapid drying mounting medium | Histolab Products AB | 801 | Pertex |
Sodium Tetraborate | Merck A/S | 1,063,080,500 | |
Sucrose | Merck A/S | 1,076,515,000 | |
Triton X-100 | Merck A/S | 1,086,031,000 | |
Xylene | VWR | 28,973,363 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Cover slips | Menzel-Gläser | 24×50 mm #0 | |
Cryostat | Leica | CM1860 | |
Digital Microcator | Heidenhain | VRZ 401 | |
Glass dishes | Brain Resaerch Laboratories | 1256 | |
Microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
Microscope camera | Olympus | DP72 | |
Microscope slides | VWR | 48311-703 | SuperFrost+ |
Motorized stage | Prior | H101A | |
Multidish Containers | Sigma-Aldrich | D6315-1CS | Nuclon 12-wells |
New-Cast software | Visiopharm | ver. 4.5.6.440 | |
Objective 2x | Nikon | CFI Plan UW 2X | |
Objective 4x | Nikon | CFI Plan Fluor 4X | |
Objective 10x | Nikon | CFI Plan Fluor 10X | |
Objective 100x oil immersion | Nikon | CFI Plan Apo Lambda DM 100X Oil | Numerical aperture 1.40 |
Orbital shaker | Gemini BV | CM-9 | Sarstedt |
Slide rack | Sakura | 4465 | |
Slide staining dishes | Sakura | 4457 | Tissue-Tek |
Specimen disc | Leica | 14037008637 | |
Staining nets | Brain Research Laboratories | 2512 | 25-wells |