Her presenterer vi en metode for å effektivt utnytte cardiac differensiering potensialet av unge menneskelige stamceller for å generere funksjonelle, kontraherende, cardiomyocyte-lignende celler i vitro.
Hjerteinfarkt og påfølgende iskemiske kaskade føre til omfattende tap av cardiomyocytes, fører til hjertesvikt, den ledende årsaken til dødelighet over hele verden. Stamceller (MSCs) er et lovende alternativ for cellen-basert terapi for å erstatte gjeldende, invasiv teknikker. MSCs kan skille ut mesenchymal linjene, inkludert hjerte celletyper, men fullstendig differensiering inn funksjonelle cellene har ennå ikke oppnådd. Tidligere metoder for differensiering var basert på farmakologiske agenter eller vekstfaktorer. Mer fysiologisk relevante strategier kan imidlertid også aktivere MSCs til å gjennomgå cardiomyogenic transformasjon. Her presenterer vi en differensiering metode bruke MSC tilslag på cardiomyocyte mater lag for å produsere cardiomyocyte-lignende kontraherende celler.
Menneskelige navlestreng perivascular celler (HUCPVCs) har vist seg å ha en større differensiering potensielle enn vanlig undersøkt MSC typer, for eksempel benmarg MSCs (BMSCs). Som en ontogenetically yngre kilde undersøkte vi cardiomyogenic potensialet i første trimester (FTM) HUCPVCs sammenlignet med eldre kilder. FTM HUCPVCs er en roman, rik kilde til MSCs som beholder i utero immunoprivileged egenskapene når kultivert i vitro. Denne differensieringen protokollen, FTM og begrepet oppnådd HUCPVCs betydelig økt cardiomyogenic differensiering sammenlignet med BMSCs, som angitt av det økt uttrykket for cardiomyocyte (dvs. myocyte enhancer faktor 2 C, hjerte troponin T, tunge kjeden cardiac myosin, signalet regulatoriske protein α og connexin 43). De har også vedlikeholdt betydelig lavere immunogenisitet, som demonstrert av deres lavere HLA-et uttrykk og høyere HLA-G uttrykk. Bruke samlet-baserte differensiering, viste FTM HUCPVCs økt samlet dannelse potensielle og genererte kontraktørselskaper celler klynger innen 1 uke co kultur på cardiac mater lag, bli den første MSC typen gjøres.
Våre resultater viser at denne differensiering strategien kan effektivt utnytte cardiomyogenic potensialet av unge MSCs, som FTM HUCPVCs, og antyder at i vitro pre differensiering kan være en potensiell strategi for å øke deres regenererende effekt i vivo.
Congestive heart failure (CHF) vedvarer som en ledende årsak til sykelighet og dødelighet over hele verden. CHF forekommer ofte etter den massive tap av cardiomyocytes og utvikling av celle-fri arrvev som patologisk myocardial infarction (MI)1. Hjertet er en delvis selv fornyende organ, reduserer bosatt stammen og stamfar celle bassenget ansvarlig for utføring vev gjenfødelse betydelig i overflod og funksjon hos eldre pasienter, ofte blir nok for optimal gjenoppretting etter skader. Dermed er det stor interesse i å utvikle eksperimentelle behandlinger som involverer transplantasjon av frisk donor cellene i skadet myokard. Det er viktig at donor cellene ikke bare gjenoppretter struktur i vev, men også oppnå funksjonelle utvinning av berørte myokard.
Native hjertet har hjertet vev-resident og endogene benmarg opprinnelse stamceller for etter skade reparasjon2,3,4. Regenerativ celler-vert – og donor-avledet både-må ha kapasitet til å få den riktige fenotypen og funksjon i microenvironment av remodeling myokard, sammen med muligheten til å effektivt og sikkert erstatte tapt cellene. In vitro differensiering metoder har blitt brukt mye å oppnå høy effektivitet, stilk cellen-basert cardiomyocyte produksjon5,6. Profilen for expression av cardiac lineage markører brukes til å definere prosessen for stamcelleforskningen differensiering mot cardiac avstamning7. Tidlig differensiering markører, som NKX2.5, myocyte enhancer faktor 2 C (Mef2c), og GATA48,9, kan være en indikasjon på initiering av cardiomyogenic prosessen. Eldre cardiomyocyte markører vanligvis brukes til å vurdere differensiering effekt er signalet regulatoriske protein î± (SIRPA)10, cardiac troponin T (cTnT)11, tunge kjeden cardiac myosin (MYH6)8,12,13og connexin 43 (Cx43)14,15,16. Metodene embryonale stamceller (ESCs) og pluripotent stamceller (PSCer) har blitt grundig optimalisert og diskutert om detaljene for induktiv faktorer, oksygen og næringsstoffer graderinger og eksakt tidspunkt for handling,5,,6,,7,,17,,18. Likevel presentere ESC – og PSC-baserte teknologier fremdeles flere etiske og sikkerhet bekymringer, sammen med suboptimal elektrofysiologiske og immunologiske funksjoner19,20. Verter transplantert med disse cellene ofte opplever immunorejection og krever permanente immunsuppresjon. Dette er hovedsakelig på grunn av armaturene store histocompatibility kompleks (MHC) molekyler i vert og giver og resulterende T-celle respons21. Mens enkelte MHC klasse I matchende er en mulig løsning, en mer tilgjengelig klinisk praksis ville kreve en celle kilde som er universelt immunoprivileged å overvinne bekymring for avvisning.
Som en alternativ cellen for bruk i klinisk, MSCs og spesielt BMSCs, har blitt undersøkt for bruk i vev gjenfødelse siden første beskrivelsen i 199522. MSCs antas å være bosatt regenerativ celler som finnes i nesten alle Stangeriaceae vev23. På isolasjon fra ønsket kilde, MSCs kan enkelt utvides i kultur har omfattende paracrine kapasitet og ofte ha immunoprivileged eller immunmodulerende egenskaper24,25. Deres sikkerhet og effekt har allerede vist i flere pre kliniske studier, spesielt for cardiac gjenfødelse3,26.
Mange MSC differensieringsstrategier benytte farmakologiske agenter, for eksempel 5-azacytidine22 og DMSO27, og vekst eller morphogenic faktorer, som BMP5,7,28,29 eller angiotensin-II30, med variabel effektivitet. Disse strategiene er, men er ikke basert på hindringer som en naiv regenerativ celle er sannsynlig å møte etter homing eller leveres til webområdet av skade i vivo. Mer fysiologisk relevante strategier, mens vanskeligere å definere og manipulere, er basert på premisset om at MSC differensiering kan indusert gjennom signaler fra vev microenvironment selv. Tidligere studier har vist at eksponering til hjerte celle lysates31 eller ventrikkel myokard32,33, eller direkte kontakt med primær cardiomyocytes i vitro15,34, kan øke uttrykket av cardiac markører i MSCs. Andre har vist spontan cardiomyogenesis etter behandling av hjerte skader med MSCs35,36,37,38, selv om delvis blanding av BMSCs og cardiomyocytes39,40 generert begynnende myokard. Til vår kunnskap, har funksjonell, spontant kontraherende cardiomyocytes fra menneskelige MSCs (hMSCs) av alle vev kilder ikke ennå blitt rapportert.
Gjeldende konsensus er at alle MSCs oppstå fra perivascular cellene23. Unge MSCs med pericyte egenskaper kan isoleres fra perivascular regionen av menneskelig navlestreng vev41,42,43. I forhold til BMSCs har HUCPVCs økt differensiering potensielle og flere andre regenererende fordeler, både i vitro41,44 og i vivo45,46,47. Spesielt har kilden som mødre fosterets grensesnittet, HUCPVCs betydelig lavere immunogenisitet sammenlignet med voksen kilder til MSCs. Vår forskning fokuserer på karakterisering og pre-klinisk anvendelser av FTM HUCPVCs, den yngste kilden til MSCs undersøkte, som vi tidligere har vist å ha økt proliferativ og høyere multilineage differensiering kapasiteter, inkludert i den cardiomyogenic avstamning41.
Her presenterer vi en protokoll som kombinerer samlet dannelse og primære cardiac celle mater lag som induktiv styrker for å oppnå fullstendig cardiomyogenic differensiering av MSCs. aggregater gir et 3D-miljø, som bedre modeller forhold i vivo forhold til 2D tilhenger kulturer. Utnytte cardiac mater lag tilbyr et miljø som er representativt for den ultimate transplantasjon nettstedet for MSCs. Vi viser at yngre kilder til MSCs isolert fra pre- eller postnatal kontrollkabler har en høyere kapasitet skjemaet aggregater og nå cardiac fenotypen forhold til voksen BMSCs, samtidig som deres immun-privilegium. Foruten den bratte heving av cardiac avstamning markør gener og indusert uttrykk for intracellulær (dvs. cTnT og MYH6) og celle-overflate proteiner (dvs. SIRPA og Cx43) spesifikke for cardiomyocytes, viser vi at differensiering potensialet i FTM HUCPVCs kan bli brukt med denne metoden, og at de kan gi opphav til spontant kontrahering cardiomyocyte-lignende celler.
Cardiac differensiering av stamceller har vært under utvikling i over 2 tiår, med flere ulike strategier brukes til å generere cardiomyocyte-lignende celler fra MSC kilder. Mange av disse strategiene, men er ineffektiv, og betingelsene brukes er ofte ikke representative for den miljø transplantert celler møte i vivo.
I motsetning til eksisterende metoder benytter protokollen presenteres her en kombinasjon av primære cardiac mater lag og MSC samlet formasjon. Primære cardiac mat…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker følgende stab medlemmer og forskning personell for deres bidrag: Matthew Librach, Leila Maghen, Tanya A. Baretto, Shlomit Kenigsberg og Andrée Gauthier-Fisher. Dette arbeidet ble støttet av den The Ontario Research Fund – fremragende (ORF-RE, runde #7) og opprette programmet Inc.
0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200056 | For cell dissociation |
Alpha-MEM | Gibco | 12571071 | For HUCPVC and BMSC culture media. |
PE-conjugated anti-human/mouse CD49f antibody | Biolegend | 313612 | Integrin marker for FC |
APC-conjugated human Cx43/GJA1 antibody | R&D Systems | FAB7737A | Connexin 43 marker for FC |
FITC-conjugated HLA-A2 antibody | Genway Biotech Inc. | GWB-66FBD2 | Immunogenicity marker for FC |
FITC-conjugated anti-HLA-G [MEM-G/9] antibody | Abcam | ab7904 | Immunogenicity marker for FC |
FITC-conjugated mouse anti-human SIRPA/CD172a antibody | AbD Serotec/Bio-Rad | MCA2518F | Cardiac marker for FC |
APC-conjugated human TRA-1-85/CD147 antibody | R&D Systems | FAB3195A | Human cell marker for FC and FACS |
FITC-conjugated human TRA-1-85/CD147 antibody | R&D Systems | FAB3195F | Human cell marker for FC and FACS |
Anti-connexin 43/GJA1 antibody | Abcam | ab11370 | Cx43. For ICC |
Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 | Life Technologies | A-21428 | For ICC |
Anti-sarcomeric alpha actinin [EA-53] antibody | Abcam | ab9465 | aSARC. For ICC |
Goat anti-mouse IgM heavy chain cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 | Life Technologies | A-21426 | For ICC |
Mef2C (D80C1) XP rabbit antibody | New England BioLabs Ltd. | 5030S | For ICC |
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A-21206 | For ICC |
Anti-nuclei (HuNu) (clone 235-1) antibody | EMD Millipore | MAB1281 | For ICC |
MZ9.5 Stereomicroscope | Leica | For imaging aggregates. | |
1.5 ml centrifuge microtubes | Axygen | MCT-150-C | For staining MSCs with fluorescent dye. |
ImageJ | Open source image processing software. | ||
Aria II | BD | UHN SickKids FC Facility. For cell sorting. | |
Bone marrow mesechymal stromal cells | Lonza | PT-2501 | BMSCs |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030-100G | BSA. To prepare solutions for ICC |
BrdU | EMD Millipore | MAB3424 | Caution: BrdU is a strong teratogen and suspected mutagen. Please ensure proper training and refer to the SDS before use. |
Canto II | BD | UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry. | |
cDNA EcoDry Premix | Clontech/Takara | 639570 | For preparation of cDNA for qPCR |
CellTracker Green CMFDA Dye | Life Technologies | C7025 | Fluorescent imaging of cell cytoplasm |
Countess automated cell counter | Invitrogen Inc. | C10227 | For cell counting |
DMEM-F12 | Sigma-Aldrich | D6421 | For rat primary cardiomyocyte culture medium. |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 10010023 | D-PBS, without Ca2+, Mg2+ |
EVOS | Life Technologies | In-house fluorescent microscope | |
FACSCalibur | BD | In-house. For flow cytometry. | |
Fetal bovine serum (Hyclone) | GE Healthcare | SH3039603 | FBS. Component of cell culture medium. |
IDT Prime Time qPCR probes | Integrated Data Technologies | FAM fluorophore | http://www.idtdna.com/pages/products/gene-expression/primetime-qpcr-assays-and-primers |
Lab Vision PermaFluor Aqueous Mounting Medium | ThermoScientific | TA-030-FM | For storage of cells to undergo ICC |
LSR II | BD | UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry. | |
MoFlo Astrios | Beckman Coulter | UHN SickKids FC Facility. For cell sorting. | |
Normal goat serum | Cell Signaling Technology | 5425S | NGS. Used in blocking solution for ICC |
Nunc Lab-Tek II Chamber Coverglass, 8-wells | Thermo Scientific Nunc | 155409 | To prepare samples for ICC |
OmniPur Triton X-100 Surfactant | EMD Millipore | 9410-OP | As a component of permeabilizing solution when preparing cells for ICC |
Paraformaldehyde, 16% Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For fixing cells for ICC. |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | Component of cell culture medium. |
Primers | Sigma | Custom Standard DNA Oligos, Desalted, 0.2 μmol | CTnT_F: GGC AGC GGA AGA GGA TGC TGA A; CTnT_R: GAG GCA CCA AGT TGG GCA TGA ACG A; MYH6 F: GCA AAG TAC TGG ATG ACA CGC T; MYH6 R: GTC ATT GCT GAA ACC GAG AAT G |
Quorum Spinning Disk Confocal | Zeiss | SickKids Imaging Facility | |
ReproCardio hiPS cell derived cardiomyocytes | ReproCell | RCD001N | Positive control for qPCR |
RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | To isolate RNA for qPCR |
Rotor-Gene SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 204074 | For qPCR with master mix |
RPMI 1640 | Gibco | A1049101 | For MSC, monocyte coculture medium. |
TaqMan qPCR primer assays | Thermo Fisher Scientific | 4444556 | For qPCR |
Trypan Blue | Life Technologies | T10282 | Staining of cells for viability and counting |
Trypsin | Gibco | 272500108 | For cell dissociation |
Volocity | Perkin-Elmer | Volocity 6.3 | Imaging software |
0.2 μm pore filter | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | For sterilizing tissue culture media |
HERAcell 150i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026410 | For incubating cells |
Dulbecco's phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride |
Forceps | Almedic | 7727-A10-704 | For handing rat heart. Can use any similar forceps. |
Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | For mincing rat heart. Curved scissors recommended. |
50 mL tube | BD Falcon | 352070 | For collection during cardiomyocyte collection and general tissue culture procedures |
15 mL tube | BD Falcon | 352096 | For general tissue culture procedures |
6-well plates | Thermo Scientific Nunc | CA73520-906 | For tissue culture |
10 cm tissue culture dishes | Corning | 25382-428 | For aggregate formation |
Axiovert 40C Microscope | Zeiss | For bright-field imaging through out tissue culture and the rest of the protocol | |
70 μm cell strainer | Fisherbrand | 22363548 | To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting |
Triton X-100 | EMD Millipore | 9410-1L | Used in permeabilization solution for ICC |
Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H1399 | Stain used during visualization of Cx43 localization |