Generering av genetisk modifiserte mus gjennom mikroinjeksjon av oocytter
Summary
Mikroinjeksjonen av mus-oocytter blir ofte brukt for både klassisk transgenese ( dvs. tilfeldig integrasjon av transgene) og CRISPR-mediert genmålretting. Denne protokollen vurderer de siste utviklingene i mikroinjeksjon, med særlig vekt på kvalitetskontroll og genotyping-strategier.
Abstract
Bruken av genetisk modifiserte mus har vesentlig bidratt til studier på både fysiologiske og patologiske in vivo prosesser. Den pronukleære injeksjonen av DNA-ekspresjonskonstruksjoner i befruktede oocytter forblir den mest brukte teknikken for å generere transgene mus for overekspresjon. Med introduksjonen av CRISPR-teknologi for genmålretting, har pronukleær injeksjon i befruktede oocytter blitt utvidet til generering av både knockout- og knock-mus. Dette arbeidet beskriver fremstillingen av DNA til injeksjon og generering av CRISPR-guider for genmålretting, med særlig vekt på kvalitetskontroll. Genotypingsprosedyrene som kreves for identifisering av potensielle grunnleggere er kritiske. Innovative genotyping strategier som utnytter "Multiplexing" evner CRISPR er presentert her. Kirurgiske prosedyrer er også skissert. Sammen vil trinnene i protokollen tillate generering av genEtisk modifiserte mus og for påfølgende etablering av musekolonier for en overflod av forskningsfelt, inkludert immunologi, nevrovitenskap, kreft, fysiologi, utvikling og andre.
Introduction
Dyremodeller, både hos vertebrater og vertebrater, har vært med på å undersøke patofysiologien av menneskelige tilstander som Alzheimers sykdom 1 , 2 . De er også uvurderlige verktøy for å søke etter sykdomsmodifikatorer og til slutt utvikle nye behandlingsstrategier i håp om å kurere. Selv om hver modell har inneboende begrensninger, er bruk av dyr som hele systemiske modeller avgjørende for biomedisinsk forskning. Dette skyldes at det metabolske og komplekse fysiologiske miljøet ikke helt kan simuleres i vevskultur.
Hittil er musen den vanligste pattedyrsarten som brukes til genetisk manipulering fordi den har flere fordeler. De fysiologiske prosesser og gener forbundet med sykdommer er sterkt konserverte mellom mus og mennesker. Musen var det første pattedyret som hadde sitt fulle genom sekvensert (2002), ett år før det menneskelige genoMeg (2003). Bortsett fra denne mengden genetisk informasjon, har musen god avlskapacitet, en rask utviklingssyklus (6 uker fra befruktning til avvenning), og en rimelig størrelse. Alle disse fordelene, kombinert med fysiologiske indikatorer, som forskjellige farger (nødvendig for kryssstrategier), gjorde musen til en attraktiv modell for genetisk manipulasjon. Spesielt, i den tidlige alderen av moderne genetikk, begynte Gregor Mendel å jobbe med mus før han flyttet til planter 3 .
Gene overføringsteknikker resulterte i generasjonen av den første transgene musen over tre tiår siden 4 , opprinnelig opprettet ved hjelp av viral levering. Imidlertid innså forskere snart at en av hovedutfordringene ved mus transgenese var manglende evne til å kontrollere skjebnen til det eksogene DNA. Fordi den virale tilførsel av transgener i musoocytter resulterte i flere kopier integrert tilfeldig inn i genomet, kunne mulighetenY for å etablere etterfølgende transgene linjer var begrenset.
En slik begrensning ble overvunnet da Gordon et al. Genererte den første transgene muselinjen ved mikroinjeksjon 5 , 6 . Dette begynte epoken med rekombinant DNA-teknologi, og parametrene som påvirker utfallet av en mikroinjeksjonssesjon har blitt studert mye 7 . Selv om mikroinjeksjon ikke tillater kontroll over integrasjonsstedet for transgenet (som til slutt resulterer i spesifikke uttrykksnivåer for hver grunnmus), forblir den viktigste fordelen av pronuklear mikroinjeksjon dannelsen av konkatemere ( dvs. arrays av flere kopier av transgenet, Koblet i serie) før genomisk integrasjon 5 . Denne egenskapen har blitt brukt over årene for å etablere tusenvis av transgene muselinjer som overexpresser et gen av interesse. Siden da har transgenese, aRasjonell modifikasjon av et organismers genom, har blitt mye brukt til å identifisere rollen som enkeltgener i forekomsten av sykdommer.
En ytterligere nøkkeloppnåelse i manipulering av musegenometet ble nådd da Mario Capecchi forstyrret et enkelt gen i musen, og åpnet epoken med genmålretting 8 . Imidlertid oppstod store ulemper raskt fra ES-cellebasert genmålretting, inkludert utfordringene ved å dyrke ES-celler, den noe variable graden av chimerisme og lengden av prosessen ( dvs. 12-18 måneder, minimum, for å oppnå musen) .
Nylig har fremskritt i ny teknologi, slik som konstruerte endonukleaser ( f.eks. Sinkfingernukleaser (ZFN), transkripsjonsaktivator-lignende effektorukleaser (TALEN) og klyngede regelmessige interspaced korte palindromiske gjentakelser (CRISPR / Cas9)) oppstått som alternative metoder for å Akselerere prosessen med genmålretting i mikrofonE 9 , 10 . Disse endonukleaser kan lett injiseres i musoocytter ved mikroinjeksjon, noe som tillater generering av genmålrettede mus på så lite som 6 uker.
Siden den første rapporten om bruk av CRISPR for genomredigering 11 , har dette bakterielle adaptive immunsystemet erstattet ZFN og TALEN på grunn av dets mange fordeler, inkludert enkel syntese og evnen til å målrette flere loki på en gang (referert til som "multipleksering "). CRISPR ble først brukt til genmålretting i mus 12 og har siden blitt anvendt på utallige arter, fra planter til mennesker 13 , 14 . Til nå er det ingen rapport om en enkelt art som er resistent mot CRISPR genom redigering.
De to hovedbegrensende trinnene i generasjonen av transgene mus er injeksjonen av oocytter og reimplantasjonenAv disse oocytene til pseudo-gravide kvinner. Selv om denne teknikken har blitt beskrevet av oss 15 og andre 16 , har nyere tekniske forbedringer i musembryologi og genoverføringsteknikker revolusjonert prosessen med å generere genetisk modifiserte mus. Disse forbedringene vil bli beskrevet her.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiske trinn i protokollen
Genereringen av genetisk modifiserte mus er kjent for å være teknisk utfordrende. Protokollen som presenteres her er imidlertid en optimalisert og forenklet metode som gjør at man kan mestre og feilsøke teknikken i rekordtid. Det er to trinn som er nødvendige for en vellykket gjennomføring av teknikken. For det første kan syntesen av lineære DNA-maler (for syntese av sgRNAer) oppnås uten magnesiumklorid (MgCl2). Imidlertid anbefales det å systematisk legge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker personalet på dyreanlegget (BRC) for deres løpende støtte. Dette arbeidet ble finansiert av National Health and Medical Research Council og Australian Research Council.
Materials
| Micropipette 0.1-2.5 ul | Eppendorf | 4920000016 | |
| Micropipette 2-20 ul | Eppendorf | 4920000040 | |
| Micropipette 20-200 ul | Eppendorf | 4920000067 | |
| Micropipette 100-1000 ul | Eppendorf | 4920000083 | |
| Molecular weight marker | Bioline | BIO-33025 | HyperLadder 1kb |
| Molecular weight marker | Bioline | BIO-33056 | HyperLadder 100 bp |
| Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
| EDTA buffer | Sigma-Aldrich | 93296 | 10x – Dilute to 1x |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| SYBR Safe gel stain | Invitrogen | S33102 | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28706 | |
| PCR purification kit (Qiaquick) | Qiagen | 28106 | |
| Vacuum system (Manifold) | Promega | A7231 | |
| Nuclease-free microinjection buffer | Millipore | MR-095-10F | |
| Ultrafree-MC microcentrifuge filter | Millipore | UFC30GV00 | |
| Cas9 mRNA | Sigma-Aldrich | CAS9MRNA | |
| CRISPR expressing plasmid (px330) | Addgene | 42230 | |
| Nuclease free water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Phusion polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| T7 Quick High Yield RNA kit | New England Biolabs | E2050S | |
| RNA purification spin columns (NucAway) | Thermo Fisher Scientific | AM10070 | |
| ssOligos | Sigma-Aldrich | OLIGO STANDARD | |
| Donor plasmid | Thermo Fisher Scientific | GeneArt | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884 | |
| KSOMaa embryo culture medium | Zenith Biotech | ZEKS-100 | |
| Mineral oil | Zenith Biotech | ZSCO-100 | |
| M2 Medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | |
| Mouthpiece | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| Glass microcapillaries | Sutter Instrument | BF100-78-10 | |
| Proteinase K | Applichem | A3830.0100 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Vessel clamp | Fine Science Tools | 18374-43 | |
| Wound clips | Fine Science Tools | 12040-01 | |
| Clips applier | Fine Science Tools | 12018-12 | |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Cauterizer | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Non-absorbable surgical sutures (Ethilon 3-0) | Ethicon | 1691H | |
| 5% CO2 incubator | MG Scientific | Galaxy 14S | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000c | |
| Thermocycler | Eppendorf | 6321 000.515 | |
| Electrophoresis set up | BioRad | 1640300 | |
| UV Transilluminator | BioRad | 1708110EDU | |
| Thermocycler | Eppendorf | 6334000069 | |
| Stereoscopic microscope | Olympus | SZX7 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| 2x Micromanipulators | Eppendorf | 5188000.012 | |
| Oocytes manipulator | Eppendorf | 5176000.025 | |
| Microinjector (Femtojet) | Eppendorf | 5247000.013 | |
| Mice C57BL/6J strain | Australian BioResources | C57BL/6JAusb |
References
- Ittner, L. M. Dendritic function of tau mediates amyloid-beta toxicity in Alzheimer’s disease mouse models. Cell. 142 (3), 387-397 (2010).
- Ittner, A. Site-specific phosphorylation of tau inhibits amyloid-beta toxicity in Alzheimer’s mice. Science. 354 (6314), 904-908 (2016).
- Marantz Henig, R. . The Monk in the Garden. , (2000).
- Jaenisch, R., Mintz, B. Simian virus 40 DNA sequences in DNA of healthy adult mice derived from preimplantation blastocysts injected with viral DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 71 (4), 1250-1254 (1974).
- Gordon, J. W., Ruddle, F. H. Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei. Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).
- Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (12), 7380-7384 (1980).
- Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (13), 4438-4442 (1985).
- Capecchi, M. R. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nat Rev Genet. 6 (6), 507-512 (2005).
- Carbery, I. D. Targeted genome modification in mice using zinc-finger nucleases. Genetics. 186 (2), 451-459 (2010).
- Sung, Y. H. Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting. Nat Biotechnol. 31 (1), 23-24 (2013).
- Jinek, M. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Wang, H. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Kang, X. Introducing precise genetic modifications into human 3PN embryos by CRISPR/Cas-mediated genome editing. J Assist Reprod Genet. 33 (5), 581-588 (2016).
- Liang, P. CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes. Protein Cell. 6 (5), 363-372 (2015).
- Ittner, L. M., Götz, J. Pronuclear injection for the production of transgenic mice. Nat Protoc. 2 (5), 1206-1215 (2007).
- Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nat Protoc. 9 (8), 1956-1968 (2014).
- . Resuspension Calculator Available from: https://sg.idtdna.com/calc/resuspension/ (2017)
- Auerbach, A. B. Strain-dependent differences in the efficiency of transgenic mouse production. Transgenic Res. 12 (1), 59-69 (2003).
- Merriman, J. A., Jennings, P. C., McLaughlin, E. A., Jones, K. T. Effect of aging on superovulation efficiency, aneuploidy rates, and sister chromatid cohesion in mice aged up to 15 months. Biol Reprod. 86 (2), 49 (2012).
- Nakagawa, Y., et al. Ultra-superovulation for the CRISPR-Cas9-mediated production of gene-knockout, single-amino-acid-substituted, and floxed mice. Biol Open. 5 (8), 1142-1148 (2016).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS One. 7 (4), e35538 (2012).
- Whitten, W. K. Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male. J Endocrinol. 13 (4), 399-404 (1956).
- Ye, S., Dhillon, S., Ke, X., Collins, A. R., Day, I. N. An efficient procedure for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Res. 29 (17), E88 (2001).
- Yoshimi, K., et al. ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes. Nat Commun. 7, 10431 (2016).
- Suzuki, K., et al. In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration. Nature. , (2016).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21, 70-71 (1999).
- Liu, X., et al. A targeted mutation at the known collagenase cleavage site in mouse type I collagen impairs tissue remodeling. J Cell Biol. 130 (1), 227-237 (1995).
- Ke, Y. D. Short-term suppression of A315T mutant human TDP-43 expression improves functional deficits in a novel inducible transgenic mouse model of FTLD-TDP and ALS. Acta Neuropathol. 130 (5), 661-678 (2015).
- Auerbach, A. B. Production of functional transgenic mice by DNA pronuclear microinjection. Acta Biochim Pol. 51 (1), 9-31 (2004).
- Iyer, V., et al. Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice. Nat Methods. 12 (6), 479 (2015).
- Zhou, Y. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).
- Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Avarbock, M. R. Translation of globin messenger RNA by the mouse ovum. Nature. 283 (5746), 499-501 (1980).
- Pinkert, C. A., Irwin, M. H., Johnson, L. W., Moffatt, R. J. Mitochondria transfer into mouse ova by microinjection. Transgenic Res. 6 (6), 379-383 (1997).
- Biggers, J. D., Summers, M. C. Choosing a culture medium: making informed choices. Fertil Steril. 90 (3), 473-483 (2008).
- Nakagata, N. Embryo transfer through the wall of the fallopian tube in mice. Jikken Dobutsu. 41 (3), 387-388 (1992).
- Truett, G. E. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).
- Richardson, C. D., Ray, G., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nat Biotechnol. 34 (3), 339-344 (2016).
- Delerue, F., Ittner, L. M. Genome Editing in Mice Using CRISPR/Cas9: Achievements and Prospects. Clon. Transgen. 4, (2015).
