Summary

Análise de Microglia e Macropagos derivados de Monócitos do Sistema Nervoso Central por Citometria de Fluxo

Published: June 22, 2017
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Summary

Este protocolo fornece uma análise das subpopulações de macrófagos no sistema nervoso central do mouse adulto por citometria de fluxo e é útil para o estudo de marcadores múltiplos expressos por essas células.

Abstract

Numerosos estudos demonstraram o papel das células imunes, em particular dos macrófagos, nas patologias do sistema nervoso central (SNC). Existem duas populações principais de macrófagos no SNC: (i) a microglia, que são os macrófagos residentes do SNC e são derivadas de progenitores do saco vitelino durante a embriogênese, e (ii) os macrófagos derivados de monócitos (MDM), que podem infiltrar-se O SNC durante a doença e são derivados de progenitores da medula óssea. Os papéis de cada subpopulação de macrófagos diferem dependendo da patologia em estudo. Além disso, não há consenso sobre os marcadores histológicos ou os critérios distintivos utilizados para essas subpopulações de macrófagos. No entanto, a análise dos perfis de expressão dos marcadores CD11b e CD45 por citometria de fluxo nos permite distinguir a microglia (CD11b + CD45 med ) do MDM (CD11b + CD45 alta ). Neste protocolo, mostramos que a centrifugação com gradiente de densidadeE a análise de citometria de fluxo pode ser usada para caracterizar essas subpopulações de macrófagos do SNC e para estudar vários marcadores de interesse expressados ​​por essas células como publicamos recentemente. Assim, esta técnica pode aprofundar a nossa compreensão do papel dos macrófagos em modelos de ratos de doenças neurológicas e também pode ser usada para avaliar os efeitos de drogas nessas células.

Introduction

A microglia são os macrófagos residuais do tecido parenquimatoso do sistema nervoso central (SNC). Eles desempenham dois principais papéis funcionais: defesa imune e manutenção da homeostase do SNC. Em contraste com o MDM, que são renovados continuamente a partir das células estaminais hematopoiéticas na medula óssea, as células microgliais se diferenciam das células progenitoras hematopoiéticas primitivas originadas no saco vitelino (YS) que colonizaram o cérebro durante o desenvolvimento embrionário 1 , 2 , 3 . Em roedores, o fator de transcrição Myb desempenha um papel crucial no desenvolvimento de todos os monócitos e macrófagos derivados da medula óssea, mas para a microglia derivada de YS, esse fator é dispensável e a diferenciação continua dependente do fator de transcrição PU.1 4 .

No SNC saudável, a microglia é uma célula dinâmica que provoca constantemente o seu ambiente, a scaLevantamento e levantamento de patógenos invasores ou danos nos tecidos 5 . A detecção de tais sinais inicia um caminho para resolver a lesão. A microglia passa rapidamente de uma morfologia ramificada a uma amebaide, que é seguida de fagocitose e liberação de vários mediadores, como citoquinas pró ou anti-inflamatórias. Assim, dependendo do seu microambiente, a microglia ativada pode adquirir um espectro de estados de iniciação distintos 6 .

A microglia afeta profundamente o desenvolvimento e a progressão de muitos distúrbios neurológicos. Nos modelos de roedores da doença de Alzheimer (AD) 7 , esclerose lateral amiotrófica (ALS) 8 , esclerose múltipla (MS) 9 ou doença de Parkinson (PD) 10 , a microglia mostra um duplo papel, induzindo neurotoxicidade prejudicial ou agindo De forma neuroprotetiva, dependente deN a doença específica, o estágio da doença e se a doença foi influenciada pelo compartimento imune sistêmico 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . A maioria das lesões do SNC observadas nas doenças citadas acima contém uma população heterogênea de células mieloides, incluindo não apenas microglia parenquimatosa, mas também macrófagos perivasculares e meníngeos, bem como MDM infiltrante do SNC. Estes tipos de células podem contribuir diferencialmente para os mecanismos fisiopatológicos relacionados à lesão e reparação 7 , 12 , 13 , 14 , 15 . O desafio atual para os investigadores que estão estudando esses modelos de doenças é estabelecer se os monócitos periféricos e os macrófagos se infiltram no SNC e, em caso afirmativo, distriamChateie a microglia residente dessas células. Na verdade, as células microgliais são muito plásticas; Quando são ativados, os marcadores de re-expressões de microglia geralmente são expressos por monócitos e macrófagos periféricos. A questão, portanto, se baseia na identificação de marcadores que podem distinguir a microglia residente dos monócitos e macrófagos infiltrantes.

A discriminação dessas populações em fatias cerebrais por aplicações imuno-histológicas é limitada devido à falta de anticorpos específicos. No entanto, a análise de citometria de fluxo é uma técnica eficiente para avaliar a expressão de vários marcadores e para distinguir as populações celulares (por exemplo, linfócitos, macrófagos / MDM CD11b + CD45 alto e microglia CD11b + CD45 med ), bem como subpopulações celulares 16 , 17 , 18 . Este protocolo descreve os procedimentos para isolar oCélulas mononucleares do SNC de ratinho em modelos de doenças neurológicas usando uma dissociação de tecido enzimático otimizado e uma centrifugação com gradiente de densidade; Bem como, um método para diferenciar as populações de microglia e MDM no SNC usando citometria de fluxo.

Outra abordagem é eliminar a mielina e purificar as células usando esferas magnéticas conjugadas com anticorpos específicos 19 , 20 , 21 . A remoção de mielina usando esferas magnéticas anti-mielina é mais dispendiosa e afeta a viabilidade e o rendimento de células isoladas 22 . Este passo e a seguinte separação imunomagnética da microglia, limitam estudos adicionais de populações específicas de células imunes 21 , 22 .

Esses procedimentos fornecem uma maneira fácil de estudar as subpopulações dos macrófagos no desenvolvimento da doença ePara determinar os efeitos de medicamentos ou modificações de genes em fenótipos de macrófagos e estados de ativação.

Protocol

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso Animal no Instituto ICM e pelo Comitê de Ética Francesa Darwin, e estão cobertos pelo protocolo 01407.02. 1. Preparação Prepare o cocktail de digestão em um tubo de 1,5 mL, combinando o seguinte para cada mouse: 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS); 123 μL de enzima de digestão (ver tabela de materiais) a 13 wunsch / mL (solução de reserva), concentração final …

Representative Results

Após a centrifugação em gradiente de densidade e coloração de anticorpos, as células foram adquiridas em um citómetro de fluxo e analisadas utilizando uma estratégia de bloqueio morfológico como se segue. Um primeiro portão foi definido no quadro de pontos Forward-Scattered-Area (FSC-A) versus Forward-Scattered-Height (FSC-H) para discriminar células individuais de dupletos ( Figura 3A ). As células únicas foram então fechadas em FSC-A…

Discussion

Demonstrou-se que a microglia eo MDM têm diferentes funções e fenótipos no SNC e, portanto, a identificação e análise dessas subpopulações de macrófagos são essenciais para melhor compreender as doenças neurológicas 9 , 18 , 25 . A análise de citometria de fluxo usando dois marcadores (CD11b e CD45) permite a distinção entre cada subpopulação ( Figura 3C ). Esta estratégia foi an…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por bolsas da Agence Nationale pour la Recherche (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), Association France Alzheimer e Bpifrance. O nosso laboratório também é apoiado pela Inserm, CNRS, Université Pierre et Marie-Curie e o programa "Investissements d'avenir" ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM). Gostaríamos de agradecer a assistência das instalações centrais da cultura CELIS.

Materials

5-month-old Mice Janvier C57BL/6J
Liberase TL Research Grade Sigma-Aldrich 5401020001 Digestion enzyme
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma-Aldrich DN25
Percoll GE Healthcare Life Sciences 17-0891-01  Density gradient medium
Cell Strainer size 70 µm Nylon Corning 731751
Venofix 25G BRAUN 4056370
Piston syringe 10 mL Terumo SS+10ES1
Pasteur pipette 230 mm Dustcher 20420
1,5 mL  tube Eppendorf 0030 123.328
15 mL  tube TPP 91015
50 mL  tube TPP 91050
5 mL polystyrene round bottom tube BD Falcon 352054
D-PBS (1X) without Ca2+/Mg2+ Thermo Fisher Scientific 14190-094
D-PBS (10X) without Ca2+/Mg2+ Thermo Fisher Scientific 14200-067
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 10270-106
EDTA Sigma-Aldrich E4884
Bovine Serum Albumin solution 30% Sigma-Aldrich A7284
Paraformaldehyde 32% Solution Electron Microscopy Sciences 15714-S Caution -Toxic
Saponin Sigma-Aldrich S2002
Sodium Azide Sigma-Aldrich 47036
PerCPCy5.5 Rat anti-mouse CD11b (clone M1/70) eBioscience 45-0112
Rat IgG2b K Isotype Control PerCP-Cyanine5.5 eBioscience 45-4031 
BV421 Rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) BD Biosciences 563890
BV421 Rat IgG2b, κ Isotype Control RUO BD Biosciences 562603
Rabbit anti-mouse TMEM119 (clone28-3) Abcam ab209064
AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG Life Technologies A31573
Anti-Mouse CD16/CD32 Purified eBioscience 14-0161 Mouse Fc Block
Fixable Dead Cell Stain Kits Invitrogen L34969
Mouse CCR2 APC-conjugated Antibody R&D FAB5538A
Rat IgG2B APC-conjugated Isotype Control R&D IC013A
Mouse CX3CR1 PE-conjugated Antibody R&D FAB5825P
Goat IgG PE-conjugated Antibody R&D IC108P
Centrifuge Eppendorf 5804R
Cell analyzer BD Biosciences BD FACSVERSE
Data Analysis Software FlowJo LLC FlowJo
Fine scissors F.S.T 14090-11
Standard Pattern Forceps F.S.T 11000-13
Mayo Scissors F.S.T 14010-15
Dumont #5 Forceps F.S.T 11251-20

References

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Cite This Article
Martin, E., El-Behi, M., Fontaine, B., Delarasse, C. Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (124), e55781, doi:10.3791/55781 (2017).

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