Summary
このプロトコールは、成体マウス中枢神経系におけるマクロファージ亜集団のフローサイトメトリーによる分析を提供し、これらの細胞によって発現される複数のマーカーの研究に有用である。
Abstract
数多くの研究が、中枢神経系（CNS）病変における免疫細胞、特にマクロファージの役割を実証している。 CNSには、（i）CNSの常在マクロファージであり、胚形成中に卵黄嚢前駆体に由来するミクログリア、および（ii）浸潤し得る単球由来マクロファージ（MDM）の2つの主要なマクロファージ集団が、疾患中のCNSは骨髄前駆細胞に由来する。各マクロファージ亜集団の役割は、研究されている病理によって異なる。さらに、これらのマクロファージ亜集団に使用される組織学的マーカーまたは識別基準にコンセンサスはない。しかし、フローサイトメトリーによるCD11bおよびCD45マーカーの発現プロファイルの分析は、我々がミクログリア（CD11b + CD45 med ）をMDM（CD11b + CD45 high ）から区別することを可能にする。このプロトコルでは、密度勾配遠心分離フローサイトメトリー分析を用いて、これらのCNSマクロファージ亜集団を特徴づけ、最近発表されたこれらの細胞によって発現されるいくつかの興味深いマーカーを研究することができる。従って、この技術は、神経疾患のマウスモデルにおけるマクロファージの役割をさらに理解することができ、これらの細胞に対する薬物効果を評価するためにも使用することができる。
Introduction
ミクログリアは、中枢神経系（CNS）の実質組織に存在するマクロファージである。それらは2つの重要な機能的役割を果たします：免疫防御およびCNSホメオスタシスの維持。骨髄の造血幹細胞から絶えず更新されているMDMとは対照的に、ミクログリア細胞は、胚発生の間に脳に定着した卵黄嚢（YS）に由来する原始造血前駆細胞から分化する1,2,3 。げっ歯類では、転写因子Mybは、骨髄由来の単球およびマクロファージのすべての発生に重要な役割を果たすが、YS由来のミクログリアについては、この因子は不可欠であり、分化は転写因子PU.14に依存する。
健康な中枢神経系において、ミクログリアは、絶えず彼らの環境をスクリーニングする動的細胞である侵入する病原体または組織の損傷のための巣作りおよび調査5 。そのようなシグナルの検出は、傷害を解決するための経路を開始する。ミクログリアは、急速に形態を変化させてアメイボイドに転換し、続いて食作用および炎症性サイトカインなどの様々なメディエーターの貪食および放出が起こる。したがって、それらの微小環境に依存して、活性化ミクログリアは、異なるプライミング状態のスペクトルを獲得することができる6 。
ミクログリアは、多くの神経障害の発症および進行に深く影響する。アルツハイマー病（AD） 7 、筋萎縮性側索硬化症（ALS） 8 、多発性硬化症（MS） 9またはパーキンソン病（PD） 10のげっ歯類モデルにおいて、ミクログリアは有害な神経毒性を誘発するか、神経保護的な様式で、これは依存性である特定の疾患、病期、およびその病気が全身性免疫コンパートメント7,8,9,10,11の影響を受けているかどうかを判定した。上記の疾患において観察されるCNS病変の大部分は、実質性小膠細胞だけでなく、血管周囲および髄膜マクロファージならびにCNS浸潤性MDMを含む骨髄系細胞の異種集団を含む。これらの細胞型は、傷害および修復に関連する病態生理学的機構に示差的に寄与する可能性がある7,12,13,14,15。これらの疾患モデルを研究している研究者の現在の課題は、末梢単球およびマクロファージがCNSに浸潤するかどうかを確かめることであり、そうであれば、distこれらの細胞から常在性小膠細胞を摘出する。実際、小膠細胞は非常に塑性である。それらが活性化されると、ミクログリアは、通常、末梢単球およびマクロファージによって発現されるマーカーを再発現する。従って、この問題は、常在ミクログリアを浸潤単球およびマクロファージから区別することができるマーカーを同定することに依存する。
免疫組織学的適用による脳切片上のこれらの集団の識別は、特異的抗体の欠如のために制限される。しかし、フローサイトメトリー分析は、いくつかのマーカーの発現を評価し、細胞集団（例えば、リンパ球、マクロファージ/ MDM CD11b + CD45 high 、およびミクログリアCD11b + CD45 med ）ならびに細胞亜集団16 、 17,18 。このプロトコルは、最適化された酵素組織解離および密度勾配遠心分離を用いることによって神経疾患モデルにおいてマウスCNS由来の単核細胞を単離すること;ならびにフローサイトメトリーを用いてCNS中のミクログリアおよびMDM集団を識別するための方法を提供する。
別のアプローチは、特定の抗体19,20,21にコンジュゲートした磁気ビーズを使用することによってミエリンを除去し、細胞を精製することである。抗ミエリン磁気ビーズを使用するミエリン除去は、より高価であり、単離された細胞22の生存率および収量に影響を及ぼす。この段階およびミクログリアの以下の免疫磁気分離は、特定の免疫細胞集団のさらなる研究を制限する21,22 。
これらの手順は、疾患発症におけるマクロファージ亜集団を研究する簡単な方法を提供し、マクロファージの表現型および活性化状態における薬物効果または遺伝子修飾を決定する。
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Protocol
ここに記載されている全ての方法は、ICM研究所の機関動物管理利用委員会とダーウィンフランス倫理委員会によって承認されており、プロトコル01407.02の適用を受けています。
1.準備
- 各マウスのために以下のものを組み合わせることにより、1.5mLチューブで消化カクテルを調製する：1mLリン酸緩衝食塩水（PBS）; 13 wunsch / mL（ストック溶液）、最終濃度1.6 wunsch / mLで123μLの消化酵素（材料の表参照）。 100mg / mL（ストック溶液）、最終濃度0.5mg / mLで5μLのDNase I（材料の表参照）を添加する。
2.灌流および切開
- 致死量のペントバルビタール（400mg / mLで100μL）でマウスを安楽死させる。
- 動物を仰臥位に置き、70％エタノールで体を濡らします。
- 胸骨の窩を露出させるために、腸骨棘のちょうど下の細かいはさみで腹部の皮膚を切るy。
- 横隔膜に切開を入れ、心臓を露出させるために（そして他の器官を切断することを避けるために）尾側から吻側への細かいはさみで胸郭の側面を切断する。左心室（LV）と右心房（RA）を特定する。
- LVの内側に25Gの針を入れたバタフライカテーテルを挿入します。細かいはさみでRAを切開し、血流の開始時に、20mLのPBSを用いて10mL /分の流速で灌流を開始し、血管から細胞および血液を除去する。正常な灌流は、血液が移動するにつれて肺と肝臓との間のブランチングによって示される。
- 中位のはさみで動物を断頭してください。脊柱の腹側にある腹壁筋肉を切除し、尾根の根元で脊柱を切断することにより、脊柱を細かいハサミで解剖し、体から分離する。
- PBSと腰椎側に200μLピペットチップを搭載している10mLシリンジを挿入脊柱を洗浄し、頚椎側の脊髄を洗い流す。
注：200μLのピペットチップは、最も広い端部（約1cm）ではさみで切断し、PBSであらかじめ充填した10mLのシリンジにしっかりと挿入します。 - 頭蓋骨の上の肌を除去し、脳を暴露するために鉗子を使用してください。頭蓋骨の基部にはさみ刃を挿入し、矢状縫合に続いて頭蓋を切断する。小さな鉗子をカットに挿入し、頭蓋骨を静かに持ち上げます。マウスの頭部から脳を解剖し、嗅球と小脳を除去する。
- 1.128 mLの消化カクテルを含むPBS（ステップ1.1から）を含む1.5 mLチューブに脳と脊髄を集める。
3.細胞の解離
- 1.5 mLチューブ（ステップ2.9）の脳と脊髄を細かいはさみで1〜2 mm 3に細かく切断します （ 図1 ）。
- 細かくした組織を入れた1.5mLのチューブを30分間インキュベートする37℃、5％CO 2でインキュベートする。
注：このステップで密度勾配を準備します。 - 酵素反応を停止するために1.5 mLチューブに0.5μMEDTA（ストック溶液）20μL、最終濃度10 mMを加えます。
- 5mLのピペットでピペットで上下に静かに細胞懸濁液を作る。
- 10mLシリンジのプランジャーを使用して、50mLチューブ内のナイロンメッシュ（70μm孔径）に細胞懸濁液を通過させます。
- 20mLの5％ウシ胎仔血清（FBS）-PBSでナイロンメッシュを洗浄する。
- 室温（18℃）で7分間遠心分離する（300×g）。上清を吸引して捨て、次のステップに進む。上清を取り除くときは十分に注意してください。ペレットを邪魔しないでください。ペレットは吸引ピペットで簡単に吸引できます。
4.密度勾配
- 適切な量の10×PBSを密度勾配媒体に添加することによって、密度勾配媒体の保存溶液を調製する。
注：1部の10X PBSを9部の密度勾配媒体に加えます。 - 表1に記載されているように、 1 ％PBSでストック密度勾配媒体を異なる割合で希釈する。
- ペレット（ステップ3.7から）を4mLの30％密度勾配媒体で再懸濁し、15mLチューブに移す。
- パスツールピペットを15mLチューブの底に置き、37mLの密度勾配培地4mLをゆっくりと下ろす。
- 上記のように、4mLの70％密度勾配媒体を添加する。
- 勾配を室温（18℃）で40分間（800xg）遠心分離する。中間相が妨げられないように、遠心分離機が最小限のブレーキなしで停止することを確認する。
注：チューブは層状に表示されます。 70％〜37％の密度勾配界面で層化された細胞は、単核免疫細胞（小膠細胞およびマクロファージ小集団）である。上位レベルは細胞破片およびミエリンである（ 図2 ）。 - 清潔な15mLのチューブに、マクロファージ亜集団細胞を含む70〜37％密度勾配間期の3-4mLを集める。
- 細胞をPBSで3回洗浄し、全量を15mLとする。細胞を含む密度勾配培地をPBSで少なくとも3回希釈し、ブレーキを「オン」にして7分間遠心する（500 xg、4℃）ことを確認します。
- 細胞ラベリングまたは他の機能アッセイのために1mL PBSで細胞ペレットを再懸濁する。
フローサイトメトリー用細胞標識
- フローサイトメトリーチューブに細胞を移す（ステップ4.10）。
- ステップ4.10で得られた各細胞サンプルに1μLの固定可能な死細胞染色試薬を加えます。氷上で30分間インキュベートし、光から保護する。
- 細胞を2 mLのPBSで1回洗浄し、5分間遠心（300 xg、4℃）します。
- 上清を除去し、細胞ペレットを400μLのPBS1％BSA、0.1％アジド。
- 1μgのCD16 / CD32抗体を100μLの細胞に加えて、Fcレセプターをブロックする。氷上で10-15分間インキュベートし、光から保護する。
- 細胞内染色のための細胞浸透化のために、PBS 1％BSA、0.1％アジドまたはPBS 1％BSA、0.1％アジド、0.25％サポニン中の一次抗体混合物を調製する。
- 100μLの一次抗体ミックス（2×）を添加し、氷上で30分間インキュベートし、光から保護する。
注：最適な結果を得るためには、実験を行う前にすべての抗体を滴定する必要があります。 - 2mLのPBSで細胞を洗浄し、5分間遠心分離する（300×g、4℃）。この手順を3回繰り返します。
- 一次抗体がフルオロフォアに直接コンジュゲートしていない場合は、100μLの二次抗体を添加し、氷上で30分間インキュベートし、光から保護する。
- 4℃で300xgで5分間遠心分離して2mLのPBSで細胞を洗浄する。この手順を3回繰り返します。
- 修正する100μLの1％PFAを含む細胞に、光から保護された室温で15分間インキュベートする。
注意：注意：PFAは有毒です。ヒュームフードで使用し、個人用保護具を着用する。 - 4℃で300 xgで5分間遠心分離して2 mL PBSで細胞を洗浄する。この手順を3回繰り返します。
- 200μLのPBSで細胞ペレットを再懸濁し、フローサイトメトリーの取得と分析に進みます。 図3のゲーティング戦略に従います 。
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Representative Results
密度勾配遠心分離および抗体染色の後、細胞をフローサイトメーターで取得し、以下のような形態学的ゲーティング戦略を用いて分析した。単一の細胞を二重線から区別するために、ドットプロット前方散乱領域（FSC-A） 対前方散乱高（FSC-H）で第1ゲートを定義した（ 図3A ）。次いで、相対細胞サイズおよび細胞粒度に基づいて、細胞破片および角化細胞を排除するために、単一細胞をFSC-A 対側方散乱面積（SSC-A）ドットプロットでゲートした（ 図3B ）。 MDMは、CD11bおよびCD45マーカーの発現レベルに基づいて同定された（ 図3C 、3D ）。最後に、各マクロファージ亜集団について他の発現マーカーを分析した（ 図 3E〜3G ）。マイクログラムiaはMDM 23とは対照的にCX3CR1を発現するが、CCR2マーカーは発現しないことが報告されている。最近、Tmem119がミクログリアの特異的マーカーであることが実証された19 。以下のマーカー（Tmem119、CX3CR1、およびCCR2）を、各マーカーに特異的な検出抗体を用いたフローサイトメトリーによって評価した。すべてのCD11b + CD45 med細胞は、Tmem119およびCX3CR1マーカーについて陽性であるが、このゲーティング戦略を検証するCCR2マーカーについては陽性でないことが示された（ 図 3E〜3G ）。
密度勾配単離が存在しない場合、マクロファージ亜集団は、多くの細胞およびミエリン破片の存在のためにドットプロットFSC-A 対 SSC-Aでは定義できなかった（ 図3H ）。注目すべきことに、透過処理は細胞収縮を誘導し、したがってマクロファージ亜集団はsm以前に記載されたように、FSC 対 SSCドットプロット（ 図3I 、J ）のaller。固定可能な死細胞染色キットを用いて細胞の生存率を測定した。密度勾配の後、細胞の85〜95％が生存している（ 図3K ）。ミクログリアおよびMDM集団は、単一サンプル（ 図3L ）および脳または脊髄単独（ 図3M 、3N ）における脳および脊髄細胞の単離後のドットプロット上のCD45およびCD11bマーカーによって定義することができる）。
フローサイトメトリー標識のためには、抗体によって認識されるタンパク質および/またはエピトープが細胞内または細胞外であるかどうかを知ることが重要である。細胞内抗原の場合、透過性緩衝液が必要である。 Tmem119は膜貫通タンパク質であるが、エピトープは認識されている細胞内の抗体としての染色によって19 。細胞透過化がない場合、標識は存在しなかった（ 図30 ）。この透過化工程が存在しないと、偽陰性の結果につながる可能性がある。 Tmem119抗体はフルオロフォアに直接コンジュゲートしていないので、細胞を二次抗体で標識した。陰性対照は二次抗体単独（黒線）であった（ 図3E 、3O-3R ）。直接コンジュゲート抗体を使用する場合、特異的標識を評価する2つの主な戦略がある：ネガティブコントロールとしてのアイソタイプ抗体または蛍光マイナスワン（FMO）コントロール。 FMOコントロールは、そのサンプルの対照抗体を除いて、混合物中のすべての標識抗体を含む。したがって、各マーカーに対してFMO対照が必要であるが、サンプル当たりアイソタイプ抗体対照については1つの標識混合物のみが必要である。脳免疫細胞の標識のために、我々はアイソトームを選択した1つのマウスの脳からの密度勾配の後に限定された数の細胞（400,000細胞）が得られるので、抗ype抗体が制御される。
図1：細胞解離手順のステップ。 （ A ）組織を消化カクテル酵素を含むチューブに入れた。 （ B ）組織をはさみで細かく細かく切断した。 （ C ）組織の小片を効率的な組織消化のために30分間（37℃）インキュベートした。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2：Cen後の密度勾配のスキーマステップ3。遠心分離後、ミエリンは密度勾配の最上部に存在し、マクロファージ集団を含む免疫細胞は37％と70％の密度勾配層の間に見出される。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3：マクロファージの代表的なフローサイトメトリー分析。論理ゲーティング戦略が適用された：（ A ）ダブレット識別はドットプロットFSC-A 対 FSC-Hを指す。 （ B ）形態学的ゲーティング戦略は、ドットプロットFSC-A 対 SSC-Aを指す。 （ C ）マクロファージ亜集団は、ドットプロットCD45 対 CD11bを指す。 （ D ）細胞のドットプロットstaCD45およびCD11b染色の対照としてアイソタイプ抗体を用いた。 Tmem119（ E ）、CX3CR1（ F ）およびCCR2（ G ）（ゲートP2の10,000事象が獲得された）の2つのマクロファージ亜集団によって発現されたマーカーの分析。密度勾配（ H ）前または密度勾配単離後および浸透処理（ I ）またはなし（ J ）の前の脳および脊髄細胞の細胞サイズ（FSC-A）および粒状度（SSC-A）を示すドットプロットは、 。 （ K ）フローサイトメトリーのヒストグラムは、密度勾配後の死細胞の割合を示す。ドットプロットに示されたゲートは、脳および脊髄（ L ）または脳（ M ）または脊髄（ N ）のCD11b + CD45中小膠細胞集団およびCD11b + CD45 高 MDM集団をそれぞれ示す。発現したTmem119の分析（ O ）または非透過性（ P ）の脳および脊髄細胞、および脳（ Q ）または脊髄（ R ）の透過性細胞におけるマクロファージ亜集団による。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
| 1チューブ分の容量（mL） | 密度勾配媒体1倍 | PBS 10倍 | PBS 1x |
| 密度勾配媒体30％ | 1.5 | 0.15 | 3.35 |
| 密度勾配媒体37％ | 1.85 | 0.185 | 2.965 |
| 密度勾配媒体70％ | 3.5 | 0.35 | 1.15 |
表1：密度勾配媒体の異なるパーセンテージの組成。
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Discussion
ミクログリアおよびMDMは、CNSにおいて異なる機能および表現型を有することが実証されており、したがって、これらのマクロファージ亜集団の同定および分析は、神経疾患9,18,25をよりよく理解するために不可欠である。 2つのマーカー（CD11bおよびCD45）を使用するフローサイトメトリー分析は、各亜集団の間の区別を可能にする（ 図3C ）。この戦略は、MDMについてはCCR2、ミクログリアについてはCX3CR1などの他の特異的マーカーを用いて以前に検証されており、Tmem119に対する抗体を用いた近年開発されたアプローチ（ 図 3E〜3G）が行われている。我々は、以前に18を公表したように、 CCR2およびCX3CR1抗体（ 図3F 、3G ）を用いて実験を行った。 CD11b + CD45CD11b + CD45 高集団とは対照的に、Tmem119およびCX3CR1は高発現したが、CCR2は発現しなかった。 CD11b + CD45 高集団は、CCR2発現の有無にかかわらず、様々な亜集団から構成される。これらのマクロファージ亜集団（血管周囲マクロファージ、浸潤マクロファージなど ）の同定および特徴付けは、広範な研究領域である。さらに、これらの集団のマーカーは、病理学的プロセスに応じて変化し得る。実際、CCR2は、単球が血液脳関門26を横切るときに下方制御される。
CD45およびCD11b抗体は細胞表面抗原を認識したので、透過処理は不要です。したがって、この技術は、mRNA分析または他の機能アッセイのための細胞選別によって、各マクロファージ亜集団を精製するためにも使用することができる。酵素の使用および密度grad小膠細胞の活性化をある程度誘導することができる。本発明者らは、単離後、ミクログリアおよびマクロファージが誘導性酸化窒素シンターゼ（iNOS）を発現することを以前に観察した。それにもかかわらず、正常状態に対して病理学的に観察されるiNOS発現レベルの増加は、この方法18を用いて強調することができる。さらに、この技術は、生存細胞の割合が高い良好に分離された細胞集団（一重項）を達成する。
このプロトコルを正常に複製するには、いくつかの重要なパラメータがあります。勾配の設定が最も重要です。私たちの経験によれば、15mLチューブと50mLチューブのグラジエントを調製すると、より良い分離が達成されます。 70〜37％の界面に細胞が見られない場合、細胞単離に使用されるCNS組織の量を考慮する必要がある。私たちは通常、1匹のマウスの脳から約40万個の細胞を収集します。この収率は様々な実験条件70-37％の界面をよりよく視覚化するために、PBSおよびフェノールレッドを用いて37％の密度勾配層を作製することである。
フローサイトメーターのさまざまなレーザーとフィルターの助けを借りて、このプロトコルは、マクロファージ亜集団18のそれぞれによって表されるいくつかのマーカーを定量化することができます。この技術は、同じサンプル中のT細胞およびB細胞などの他の免疫細胞の関与を評価するためにも有用である。実際に、免疫磁気濃縮を使用する技術は、以前に選択された集団の研究のみを可能にする21 。
全体として、この技術は、神経疾患のマウスモデルにおける異なるマクロファージ亜集団を特徴付ける有用なツールを構成する。この独自の選択肢は、病理学的状態における炎症過程に対する治療の効果を評価することができる。
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Disclosures
著者は何も開示していない
Acknowledgments
この研究は、Agence Nationale Pour la Recherche（ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD）、Association France AlzheimerおよびBpifranceからの助成金によって支援された。私たちの研究室は、Inserm、CNRS、Pierre et Marie-CurieUniversidéと「Investissements d'avenir」ANR-10-IAIHU-06（IHU-A-ICM）の支援を受けています。 CELIS細胞培養コア施設の支援に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 month-old Mice | Janvier | C57BL/6J | |
| Liberase TL Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401020001 | Digestion enzyme |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17-0891-01 | Density gradient medium |
| Cell Strainer size 70 µm Nylon | Corning | 731751 | |
| Venofix 25 G | BRAUN | 4056370 | |
| Piston syringe 10 mL | Terumo | SS+10ES1 | |
| Pasteur pipette 230 mm | Dustcher | 20420 | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| 15 mL tube | TPP | 91015 | |
| 50 mL tube | TPP | 91050 | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352054 | |
| D-PBS (1x) without Ca2+/Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| D-PBS (10x) without Ca2+/Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14200-067 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | |
| Bovine Serum Albumin solution 30% | Sigma-Aldrich | A7284 | |
| Paraformaldehyde 32% Solution | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Caution -Toxic |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| PerCPCy5.5 Rat anti-mouse CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 45-0112 | |
| Rat IgG2b K Isotype Control PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-4031 | |
| BV421 Rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) | BD Biosciences | 563890 | |
| BV421 Rat IgG2b, κ Isotype Control RUO | BD Biosciences | 562603 | |
| Rabbit anti-mouse TMEM119 (clone28 - 3) | Abcam | ab209064 | |
| AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG | Life Technologies | A31573 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Purified | eBioscience | 14-0161 | Mouse Fc Block |
| Fixable Dead Cell Stain Kits | Invitrogen | L34969 | |
| Mouse CCR2 APC-conjugated Antibody | R&D | FAB5538A | |
| Rat IgG2B APC-conjugated Isotype Control | R&D | IC013A | |
| Mouse CX3CR1 PE-conjugated Antibody | R&D | FAB5825P | |
| Goat IgG PE-conjugated Antibody | R&D | IC108P | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Cell analyzer | BD Biosciences | BD FACSVERSE | |
| Data Analysis Software | FlowJo LLC | FlowJo | |
| Fine scissors | F.S.T | 14090-11 | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T | 11000-13 | |
| Mayo Scissors | F.S.T | 14010-15 | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T | 11251-20 |
References
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