Summary
Dieses Protokoll liefert eine Analyse der Makrophagen-Subpopulationen in das erwachsene Maus-Zentralnervensystem durch Durchflusszytometrie und ist hilfreich für die Untersuchung von mehreren Markern, die von diesen Zellen exprimiert werden.
Abstract
Zahlreiche Studien haben gezeigt, die Rolle der Immunzellen, insbesondere Makrophagen, in zentralen Zerversystem (ZNS) Pathologien. Es gibt zwei Hauptmakrophagenpopulationen im ZNS: (i) die Mikroglia, die die residenten Makrophagen des ZNS sind und von Dottersack-Progenitoren während der Embryogenese abgeleitet sind, und (ii) die Monozyten-abgeleiteten Makrophagen (MDM), die infiltrieren können Das ZNS während der Krankheit und werden aus Knochenmark-Vorläufern abgeleitet. Die Rollen jeder Makrophagen-Subpopulation unterscheiden sich je nach der untersuchten Pathologie. Darüber hinaus gibt es keinen Konsens über die histologischen Marker oder die für diese Makrophagen-Subpopulationen verwendeten Unterscheidungskriterien. Die Analyse der Expressionsprofile der CD11b- und CD45-Marker durch Durchflusszytometrie erlaubt es uns jedoch, die Mikroglia (CD11b + CD45 med ) vom MDM (CD11b + CD45 high ) zu unterscheiden. In diesem Protokoll zeigen wir, dass die DichtegradientenzentrifugationUnd die Durchflusszytometrieanalyse kann verwendet werden, um diese ZNS-Makrophagen-Subpopulationen zu charakterisieren und mehrere von diesen Zellen exprimierte Marker zu untersuchen, wie wir vor kurzem veröffentlicht haben. So kann diese Technik unser Verständnis der Rolle von Makrophagen in Mausmodellen von neurologischen Erkrankungen weitergeben und kann auch zur Bewertung von Arzneimittelwirkungen auf diese Zellen verwendet werden.
Introduction
Die Mikroglia sind die parenchymalen Gewebe-residenten Makrophagen des Zentralnervensystems (ZNS). Sie spielen zwei wichtige Funktionsrollen: Immunabwehr und Wartung der ZNS-Homöostase. Im Gegensatz zu den MDM, die kontinuierlich aus den hämatopoetischen Stammzellen im Knochenmark erneuert werden, unterscheiden sich die Mikrogliazellen von primitiven hämatopoetischen Vorläuferzellen aus dem Dottersack (YS), die das Gehirn während der embryonalen Entwicklung 1 , 2 , 3 kolonisierten. Bei Nagetieren spielt der Transkriptionsfaktor Myb eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung aller von Knochenmark abgeleiteten Monozyten und Makrophagen, aber für YS-abgeleitete Mikroglia ist dieser Faktor entbehrlich und die Differenzierung bleibt abhängig vom Transkriptionsfaktor PU.1 4 .
Im gesunden ZNS sind Mikroglia dynamische Zellen, die ständig ihre Umgebung abtasten, scaNning und Vermessung zum Eindringen von Krankheitserregern oder Gewebeschäden 5 . Die Erkennung solcher Signale leitet einen Weg ein, um die Verletzung zu lösen. Die Mikroglia wechselt schnell von einer verzweigten Morphologie zu einer amöboiden, die von Phagozytose und Freisetzung verschiedener Mediatoren wie pro- oder entzündungshemmenden Zytokinen gefolgt wird. So kann abhängig von ihrer Mikroumgebung aktivierte Mikroglia ein Spektrum unterschiedlicher Priming-Zustände 6 erwerben.
Die Mikroglia beeinflusst die Entwicklung und den Fortschritt vieler neurologischer Erkrankungen. Bei den Nagetiermodellen der Alzheimer-Krankheit (AD) 7 , der amyotrophischen Lateralsklerose (ALS) 8 , der Multiple Sklerose (MS) 9 oder der Parkinson-Krankheit (PD) 10 wird gezeigt , dass die Mikroglia eine doppelte Rolle spielt, die entweder eine nachteilige Neurotoxizität oder eine wirksame Wirkung hervorruft In einer neuroprotektiven Weise, die abhängig ist oN die spezifische Krankheit, das Krankheitsstadium und ob die Krankheit durch das systemische Immunabteil 7 , 8 , 9 , 10 , 11 beeinflusst wurde . Die meisten der in den oben genannten Krankheiten beobachteten ZNS-Läsionen enthalten eine heterogene Population von myeloiden Zellen, darunter nicht nur parenchymale Mikroglia, sondern auch perivaskuläre und meningeale Makrophagen sowie CNS-infiltrierende MDM. Diese Zelltypen können unterschiedlich zu den pathophysiologischen Mechanismen beitragen, die sich auf Verletzungen und Reparaturen beziehen 7 , 12 , 13 , 14 , 15 . Die gegenwärtige Herausforderung für Forscher, die diese Krankheitsmodelle studieren, besteht darin, festzustellen, ob die peripheren Monozyten und Makrophagen das ZNS infiltrieren und wenn ja, in distLegen Sie die residenten Mikroglia aus diesen Zellen. In der Tat sind die Mikrogliazellen sehr plastisch; Wenn sie aktiviert sind, werden die Mikroglia-Marker, die üblicherweise durch periphere Monozyten und Makrophagen exprimiert werden, erneut exprimieren. Das Problem beruht daher auf der Identifizierung von Markern, die die residenten Mikroglia von den infiltrierenden Monozyten und Makrophagen unterscheiden können.
Die Diskriminierung dieser Populationen auf Gehirnscheiben durch immunhistologische Anwendungen ist aufgrund des Fehlens spezifischer Antikörper begrenzt. Die Durchflusszytometrieanalyse ist jedoch eine effiziente Technik zur Beurteilung der Expression mehrerer Marker und zur Unterscheidung von Zellpopulationen (z. B. Lymphozyten, Makrophagen / MDM CD11b + CD45 hoch und Microglia CD11b + CD45 med ) sowie Zellsubpopulationen 16 , 17 , 18 Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren zur Isolierung derMononukleare Zellen aus dem Maus-ZNS in neurologischen Erkrankungsmodellen unter Verwendung einer optimierten, enzymatischen Gewebe-Dissoziation und einer Dichtegradienten-Zentrifugation; Sowie ein Verfahren zur Differenzierung der Mikroglia- und MDM-Populationen im ZNS durch Durchflusszytometrie.
Ein weiterer Ansatz besteht darin, das Myelin zu eliminieren und die Zellen unter Verwendung von magnetischen Perlen zu reinigen, die mit spezifischen Antikörpern 19 , 20 , 21 konjugiert sind. Die Myelinentfernung unter Verwendung von Anti-Myelin-Magnetperlen ist teurer und beeinflusst die Lebensfähigkeit und die Ausbeute an isolierten Zellen 22 . Dieser Schritt und die folgende immunomagnetische Trennung der Mikroglia, beschränken weitere Untersuchungen der spezifischen Immunzellpopulationen 21 , 22 .
Diese Verfahren bieten eine einfache Möglichkeit, die Makrophagen-Subpopulationen in der Krankheitsentwicklung zu untersuchen undUm die Arzneimittelwirkungen oder Genmodifikationen auf Makrophagen-Phänotypen und Aktivierungszuständen zu bestimmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee am ICM Institute und dem Darwin French Ethic Animal Committee genehmigt und sind unter dem Protokoll 01407.02 abgedeckt.
1. Vorbereitung
- Den Verdauungscocktail in einem 1,5 mL Röhrchen vorbereiten, indem man für jede Maus folgendes kombiniert: 1 ml Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS); 123 μl Verdauungsenzym (siehe Materialtabelle) bei 13 wunsch / mL (Stammlösung), Endkonzentration 1,6 wunsch / mL; Und 5 & mgr; l DNase I (siehe Tabelle der Materialien) bei 100 mg / ml (Stammlösung), Endkonzentration 0,5 mg / ml.
2. Perfusion und Dissektion
- Euthanisieren der Mäuse mit einer letalen Dosis Pentobarbital (100 μl bei 400 mg / ml).
- Legen Sie das Tier in Rückenlage und nass den Körper mit 70% Ethanol.
- Schneide die ventrale Haut mit feiner Schere direkt unterhalb des Xyphus-Prozesses, um den Thorax-Cavit auszusetzenY
- Machen Sie einen Einschnitt in die Membran und schneiden Sie die seitlichen Aspekte des Brustkorbes mit feinen Scheren in einer kaudalen zu rostralen Richtung, um das Herz auszusetzen (und vermeiden Sie das Schneiden von anderen Organen). Identifizieren Sie den linken Ventrikel (LV) und den rechten Vorhof (RA).
- Setzen Sie einen Schmetterlingskatheter mit einer 25 G Nadel im Inneren des LV ein. Machen Sie einen Einschnitt auf der RA mit feinen Scheren und am Anfang des Blutflusses, starten Sie die Perfusion bei 10 mL / min Durchflussrate durch die LV mit 20 mL PBS, um Zellen und Blut aus Gefäßen zu entfernen; Die erfolgreiche Perfusion wird durch die Blanchierung der Lunge und der Leber als Blut verunreinigt.
- Das Tier mit einer mittleren Schere enthaupten. Die Wirbelsäule mit feiner Schere zerreißen und vom Körper trennen, indem man die Bauchwandmuskulatur auf der Bauchseite der Wirbelsäule aufhebt und die Wirbelsäule an der Unterseite des Schwanzes schneidet.
- Legen Sie eine 10 ml Spritze mit PBS und eine 200 μl Pipettenspitze in die Lendenwirbelsäule einDie Wirbelsäule und spüle das Rückenmark auf der zervikalen Seite.
HINWEIS: Die 200 μl Pipettenspitze wird mit einer Schere an ihrem breitesten Ende (ca. 1 cm) geschnitten und auf eine 10 mL Spritze, die zuvor mit PBS gefüllt ist, fest eingesteckt. - Entfernen Sie die Haut über dem Schädel und verwenden Sie Pinzette, um das Gehirn freizulegen. Setzen Sie ein Scherenblatt an die Basis des Schädels und schneiden Sie den Schädel nach der sagittalen Naht. Setzen Sie kleine Zangen in den Schnitt und heben Sie den Schädel vorsichtig an. Ziehen Sie das Gehirn aus dem Mauskopf und entfernen Sie die olfaktorische Glühbirne und Kleinhirn.
- Sammeln Sie das Gehirn und das Rückenmark in einem 1,5 ml-Röhrchen mit 1,128 ml PBS mit dem Verdauungscocktail (ab Schritt 1.1).
3. Zelldissoziation
- Das Gehirn und das Rückenmark im 1,5 mL Röhrchen (Schritt 2.9) in 1-2 mm 3 Stück mit kleiner Schere schneiden ( Bild 1 ).
- Inkubieren Sie das 1,5 ml-Röhrchen, das das gehackte Gewebe enthält, für 30 min in einem InkubaBei 37 ° C mit 5% CO 2 .
HINWEIS: Den Dichtegradienten in diesem Schritt vorbereiten. - Füge 20 μl 0,5 M EDTA (Stammlösung), Endkonzentration 10 mM, zum 1,5 mL Röhrchen hinzu, um die enzymatische Reaktion zu stoppen.
- Vorsichtig eine Zellsuspension durch Pipettieren auf und ab mit einer 5-ml-Pipette machen.
- Führen Sie die Zellsuspension durch ein Nylongewebe (70 μm Porengröße) in einem 50 mL Röhrchen unter Verwendung des Tauchkolbens einer 10 ml Spritze.
- Waschen Sie das Nylongewebe mit 20 ml 5% fetalem Rinderserum (FBS) -PBS.
- 5 min (300 xg) bei Raumtemperatur (18 ° C) zentrifugieren. Verwerfe den Überstand durch Aspiration und gehe zum nächsten Schritt. Sei besonders vorsichtig beim Entfernen des Überstandes; Störe nicht das Pellet, das leicht von der Saugpipette angesaugt werden kann.
4. Dichtegradient
- Vorbereiten einer Stammlösung des Dichtegradientenmediums durch Zugabe der geeigneten Menge von 10x PBS zu dem Dichtegradientenmedium.
HINWEIS: Füge einen Teil 10X PBS zu neun Teilen Dichtegradientenmedium hinzu. - Verdünnen Sie das Stammdichtegradientenmedium mit 1x PBS für die verschiedenen Prozentsätze, wie in Tabelle 1 beschrieben .
- Das Pellet (ab Schritt 3.7) mit 4 mL 30% Dichtegradientenmedium resuspendieren und in ein 15 mL Röhrchen überführen.
- Legen Sie eine Pasteurpipette in den Boden des 15-ml-Röhrchens und legen Sie langsam 4 ml 37% Dichtegradientenmedium auf.
- Füge 4 ml 70% Dichtegradientenmedium hinzu, wie oben beschrieben.
- Den Gradienten für 40 min (800 xg) bei Raumtemperatur (18 ° C) zentrifugieren. Stellen Sie sicher, dass die Zentrifuge mit minimaler oder keiner Bremse stoppt, damit die Zwischenphase nicht gestört wird.
HINWEIS: Die Röhre wird geschichtet erscheinen. Die Zellen, die an der 70% - 37% Dichtegradientenschnittstelle geschichtet sind, sind die mononukleierten Immunzellen (Mikroglia und Makrophagen Subpopulationen); Die oberen Ebenen sind Zelltrümmer und Myelin ( Abbildung 2 ). - Sammeln Sie 3-4 ml der 70-37% Dichtegradienten-Interphase, die die Makrophagen-Subpopulationszellen enthält, in ein sauberes 15-ml-Röhrchen.
- Waschen Sie die Zellen 3x mit PBS, Gesamtvolumen von 15 ml. Achten Sie darauf, dass das die Zellen enthaltende Dichtegradientenmedium mindestens dreimal mit PBS verdünnt und 7 min (500 xg, 4 ° C) mit der Bremse "ein" zentrifugiert wird.
- Das Zellpellet mit 1 ml PBS zur Zellmarkierung oder für andere funktionelle Assays resuspendieren.
5. Zellbeschriftung für Durchflusszytometrie
- Übertragen Sie die Zellen (Schritt 4.10) in eine Durchflusszytometrie-Röhre.
- Füge 1 μl fixierbares totes Zellfleck-Reagens zu jeder in Schritt 4.10 erhaltenen Zellprobe hinzu. Inkubieren für 30 min auf Eis, vor Licht geschützt.
- Die Zellen einmal mit 2 ml PBS waschen und 5 min zentrifugieren (300 xg, 4 ° C).
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet mit400 & mgr; l PBS 1% BSA, 0,1% Azid.
- Füge 1 μg CD16 / CD32 Antikörper zu 100 μl der Zellen hinzu, um die Fc-Rezeptoren zu blockieren. Inkubieren Sie 10-15 min auf Eis, geschützt vor Licht.
- Bereiten Sie die primäre Antikörpermischung in PBS 1% BSA, 0,1% Azid oder PBS 1% BSA, 0,1% Azid, 0,25% Saponin, für die Zellpermeabilisierung für intrazelluläre Färbung vor.
- 100 μl Primär-Antikörper-Mischung (2x) zugeben und 30 min auf Eis, inkubiert, inkubieren.
HINWEIS: Alle Antikörper sollten vor der Durchführung des Experiments titriert werden, um optimale Ergebnisse zu erzielen. - Die Zellen mit 2 ml PBS waschen und 5 min zentrifugieren (300 xg, 4 ° C). Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
- Fügen Sie 100 μl eines sekundären Antikörpers hinzu, wenn die primären Antikörper nicht direkt an einen Fluorophor konjugiert sind und für 30 min auf Eis, vor Licht geschützt, inkubieren.
- Die Zellen mit 2 ml PBS waschen und 5 min bei 300 xg bei 4 ° C zentrifugieren). Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
- Beheb dasZellen mit 100 μl 1% PFA für 15 min bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt.
HINWEIS: Achtung: PFA ist giftig. In einer Dunstabzugshaube verwenden und persönliche Schutzausrüstung tragen. - Die Zellen mit 2 ml PBS waschen und 5 min bei 300 xg bei 4 ° C zentrifugieren. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
- Das Zellpellet mit 200 μl PBS resuspendieren und die Cytometrieerfassung und -analyse durchlaufen. Befolgen Sie die Gating-Strategie in Abbildung 3 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nach der Dichtegradientenzentrifugation und Antikörperfärbung wurden die Zellen auf einem Durchflusszytometer gewonnen und unter Verwendung einer morphologischen Gating-Strategie wie folgt analysiert. Ein erstes Tor wurde im Punkt-Forward-Scattered-Area (FSC-A) gegenüber der Forward-Scattered-Height (FSC-H) definiert, um einzelne Zellen aus Dubletten zu unterscheiden ( Abbildung 3A ). Die einzelnen Zellen wurden dann auf FSC-A versus Side-Scattered-Area (SSC-A) Dot-Plots, um Zelltrümmer und pyknotische Zellen auszuschließen, basierend auf der relativen Zellgröße und Zellgranularität ( Abbildung 3B ). Dann wurden die Mikroglia und Die MDM wurden anhand ihrer Expressionsniveaus der CD11b- und CD45-Marker identifiziert ( Abbildung 3C , 3D ). Schließlich wurden andere Expressionsmarker für jede Makrophagen-Subpopulation ( Abbildung 3E- 3G ) analysiert. Die microglIa wurde berichtet, um den CX3CR1, aber nicht den CCR2-Marker im Gegensatz zu MDM 23 auszudrücken. Vor kurzem wurde gezeigt, dass Tmem119 ein spezifischer Marker für Microglia ist 19 . Die folgenden Marker (Tmem119, CX3CR1 und CCR2) wurden durch Durchflusszytometrie unter Verwendung von für jeden Marker spezifischen Detektorantikörpern beurteilt; Alle CD11b + CD45- Med- Zellen zeigten sich für die Tmem119- und CX3CR1-Marker als positiv, aber nicht für den CCR2-Marker, der diese Gating-Strategie validiert ( Abbildung 3E -3G ).
In Abwesenheit der Dichtegradientenisolation konnten die Makrophagen-Subpopulationen nicht im Punkt-Plot FSC-A gegenüber SSC-A aufgrund der Anwesenheit von vielen Zellen und Myelin-Trümmern definiert werden ( Abbildung 3H ). Die Permeabilisierungsbehandlung induziert eine Zellschrumpfung und damit die Makrophagen-Subpopulationen erschienenAller im FSC gegen SSC-Punkt-Diagramm ( Abbildung 3I , J ) wie zuvor beschrieben 24 . Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde unter Verwendung des fixierbaren toten Zellfleckkits bestimmt. Nach dem Dichtegradienten sind 85-95% der Zellen lebendig ( Abbildung 3K ). Die Mikroglia- und MDM-Populationen können durch die CD45- und CD11b-Marker auf einem Punktdiagramm nach der Isolierung des Gehirns und der Rückenmarkszellen in einer einzigen Probe ( Abbildung 3L ) und auch aus dem Gehirn oder dem Rückenmark allein definiert werden ( Abbildung 3M , 3N ).
Für die Durchflusszytometrie-Markierung ist es wichtig zu wissen, ob das Protein und / oder das Epitop, das vom Antikörper erkannt wird, intra- oder extrazellulär ist. Im Falle von intrazellulären Antigenen ist ein Permeabilisierungspuffer erforderlich. Tmem119 ist ein Transmembranprotein, aber das Epitop erkanntDurch die Antikörperflecken als intrazelluläre 19 . In Abwesenheit der Zellpermeabilisierung gab es keine Markierung ( Abbildung 3O ). Das Fehlen dieses Permeabilisierungsschrittes könnte zu falsch negativen Ergebnissen führen. Da der Tmem119-Antikörper nicht direkt an einen Fluorophor konjugiert ist, wurden die Zellen mit einem sekundären Antikörper markiert; Die Negativkontrolle war sekundärer Antikörper allein (schwarze Linie) ( Abbildung 3E , 3O-3R ). Wenn direkt konjugierte Antikörper verwendet werden, gibt es zwei Hauptstrategien, um die spezifische Markierung zu beurteilen: Isotyp-Antikörper als Negativkontrolle oder Fluoreszenz Minus One (FMO) Kontrollen. FMO-Kontrollen enthalten jeden Markierungs-Antikörper in der Mischung außer dem Kontroll-Antikörper für diese Probe. Somit ist für jede Markierung eine FMO-Kontrolle erforderlich, während für die Isotyp-Antikörper-Kontrolle pro Probe nur eine Markierungsmischung benötigt wird. Für die Etikettierung der Gehirn-Immunzellen wählten wir die IsotYpe-Antikörper-Kontrolle, da eine begrenzte Anzahl von Zellen (400.000 Zellen) nach dem Dichtegradienten aus einem Maus-Gehirn erhalten wird.
Abbildung 1: Schritte des Zelldissoziationsverfahrens. ( A ) Das Gewebe wurde in eine Röhre mit Verdauungscocktailenzymen gegeben. ( B ) Das Gewebe wurde mit Scheren fein in kleine Stücke geschnitten. ( C ) Die kleinen Stücke Gewebe wurden für 30 min (37 ° C) für eine effiziente Gewebeverdauung inkubiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Schema des Dichtegradienten nach CenTrifugation Schritt. Nach der Zentrifugation liegt Myelin an der Oberseite des Dichtegradienten vor und Immunzellen, die Makrophagenpopulationen enthalten, finden sich bei der Zwischenphase zwischen den 37% und 70% Dichtegradientenschichten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Repräsentative Durchflusszytometrie Analyse von Makrophagen. Es wurde eine logische Gating-Strategie angewendet: ( A ) Die Doublet-Diskriminierung bezieht sich auf den Punkt-Plot FSC-A gegenüber FSC-H. ( B ) Die morphologische Gating-Strategie bezieht sich auf den Punkt-Plot FSC-A gegenüber SSC-A. ( C ) Die Makrophagen-Subpopulationen beziehen sich auf Punktdiagramm CD45 gegenüber CD11b. ( D ) Der Punkt der Zellen staMit Isotyp-Antikörpern als Kontrolle für CD45- und CD11b-Färbung. Die Analyse der Marker, die durch diese beiden Makrophagen-Subpopulationen ausgedrückt wurden: Tmem119 ( E ), CX3CR1 ( F ) und CCR2 ( G ) (10.000 Ereignisse im Gate P2 wurden erfasst). Dot-Plots, die die Zellgröße (FSC-A) und die Granularität (SSC-A) des Gehirns und der Rückenmarkszellen vor dem Dichtegradienten ( H ) oder nach der Dichtegradientenisolation und mit der Permeabilisierungsbehandlung ( I ) oder ohne ( J ) . ( K ) Durchflusszytometrie-Histogramm veranschaulicht den Prozentsatz der toten Zellen nach dem Dichtegradienten. Die in den Punktdiagrammen dargestellten Gates veranschaulichen die CD11b + CD45 med- Mikroglia-Population und die CD11b + CD45-MDM-Population im Gehirn und im Rückenmark ( L ) oder im Gehirn ( M ) oder im Rückenmark ( N ) getrennt. Analyse von Tmem119 exprimiertDurch die Makrophagen-Subpopulationen im Gehirn und die Wirbelsäulenzellen permeabilisiert ( O ) oder nicht-permeabilisiert ( P ) und im Gehirn ( Q ) oder dem Rückenmark ( R ) permeabilisierten Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Volumen für 1 Tube (ml) | Dichtegradientenmedium 1x | PBS 10x | PBS 1x |
| Dichtegradientenmedium 30% | 1.5 | 0,15 | 3.35 |
| Dichtegradientenmedium 37% | 1.85 | 0,185 | 2.965 |
| Dichtegradient Medium 70% | 3.5 | 0,35 | 1.15 |
Tabelle 1: Zusammensetzung der verschiedenen Prozentsätze des Dichtegradientenmediums.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Es wurde gezeigt, dass die Mikroglia und MDM unterschiedliche Funktionen und Phänotypen im ZNS haben und somit die Identifizierung und die Analyse dieser Makrophagen-Subpopulationen wesentlich sind, um neurologische Erkrankungen besser zu verstehen 9 , 18 , 25 . Durchflusszytometrieanalyse unter Verwendung von zwei Markern (CD11b und CD45) ermöglicht die Unterscheidung zwischen jeder Subpopulation ( Abbildung 3C ). Diese Strategie wurde zuvor mit anderen spezifischen Markern wie CCR2 für das MDM und CX3CR1 für die Mikroglia und einem kürzlich entwickelten Ansatz mit einem Antikörper gegen Tmem119 ( Abbildung 3E - 3G ) validiert. Wir haben Experimente mit CCR2- und CX3CR1-Antikörpern durchgeführt ( Abbildung 3F , 3G ), wie wir zuvor veröffentlicht haben. Die CD11b + CD45Med- Population stark ausgedrückt Tmem119 und CX3CR1 aber nicht CCR2 im Gegensatz zu der CD11b + CD45 hohen Population. Die CD11b + CD45-Hochpopulation besteht aus verschiedenen Subpopulationen mit oder ohne CCR2-Expression. Die Identifizierung und Charakterisierung dieser Makrophagen-Subpopulationen (perivaskuläre Makrophagen, infiltrierende Makrophagen etc. ) sind ein umfangreiches Forschungsgebiet. Darüber hinaus können sich die Marker für diese Populationen je nach pathologischen Prozessen ändern. In der Tat ist CCR2 herunterreguliert, wenn die Monozyten die Blut-Hirn-Schranke 26 kreuzen.
Die CD45- und CD11b-Antikörper erkannten die Zelloberflächen-Antigene, so dass die Permeabilisierungsbehandlung unnötig ist. Daher könnte diese Technik auch verwendet werden, um jede Makrophagen-Subpopulation durch Zellsortierung für die mRNA-Analyse oder andere funktionelle Assays zu reinigen. Es ist zu beachten, dass die Verwendung des Enzyms und der DichtegradKann in gewissem Maße die Mikroglia-Aktivierung induzieren. Wir haben bisher beobachtet, dass nach der Isolierung die Mikroglia und Makrophagen die induzierbare Stickoxidsynthase (iNOS) exprimieren. Trotzdem kann mit diesem Verfahren 18 ein erhöhter iNOS-Expressionsgrad, der im pathologischen gegenüber dem normalen Zustand beobachtet wird, hervorgehoben werden. Darüber hinaus erreicht diese Technik eine gut getrennte Zellpopulation (Einzelstücke) mit einem hohen Anteil an lebenden Zellen.
Für die erfolgreiche Replikation dieses Protokolls gibt es mehrere kritische Parameter. Die Einstellung des Gradienten ist am kritischsten. Unsere Erfahrung zeigt, dass die Vorbereitung der Steigungen in 15 ml Röhrchen gegenüber 50 ml eine bessere Trennung erreicht. Wenn keine Zellen in der Schnittstelle von 70-37% gesehen werden, sollte die Menge an ZNS-Gewebe, die für die Zellisolation verwendet wird, in Betracht gezogen werden. Normalerweise sammeln wir ~ 400.000 Zellen aus einer Maus Gehirn. Obwohl diese Ausbeute aus verschiedenen experimentellen Bedingungen schwanktS, eine für eine bessere Visualisierung der 70-37% -Schnittstelle ist, die 37% Dichtegradientenschicht mit PBS und Phenolrot zu machen.
Mit Hilfe verschiedener Laser und Filter im Durchflusszytometer kann dieses Protokoll mehrere Marker quantifizieren, die von jeder der Makrophagen-Subpopulationen 18 ausgedrückt werden. Diese Technik ist auch nützlich für die Beurteilung der Beteiligung von anderen Immunzellen wie T-Zellen und B-Zellen in der gleichen Probe. Tatsächlich erlauben Techniken, die immunomagnetische Anreicherung verwenden, nur die Untersuchung der zuvor ausgewählten Populationen 21 .
Insgesamt ist diese Technik ein nützliches Werkzeug, um die verschiedenen Makrophagen-Subpopulationen in Mausmodellen von neurologischen Erkrankungen zu charakterisieren. Diese einzigartige Alternative kann die Auswirkungen der Behandlung auf entzündliche Prozesse in pathologischen Zuständen beurteilen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse von Agence Nationale pour la Recherche (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), Vereinigung Frankreich Alzheimer und Bpifrance. Unser Labor wird auch von Inserm, CNRS, Université Pierre et Marie-Curie und dem Programm "Investissements d'avenir" ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM) unterstützt. Wir danken der Unterstützung der CELIS Zellkultur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 month-old Mice | Janvier | C57BL/6J | |
| Liberase TL Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401020001 | Digestion enzyme |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17-0891-01 | Density gradient medium |
| Cell Strainer size 70 µm Nylon | Corning | 731751 | |
| Venofix 25 G | BRAUN | 4056370 | |
| Piston syringe 10 mL | Terumo | SS+10ES1 | |
| Pasteur pipette 230 mm | Dustcher | 20420 | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| 15 mL tube | TPP | 91015 | |
| 50 mL tube | TPP | 91050 | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352054 | |
| D-PBS (1x) without Ca2+/Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| D-PBS (10x) without Ca2+/Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14200-067 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | |
| Bovine Serum Albumin solution 30% | Sigma-Aldrich | A7284 | |
| Paraformaldehyde 32% Solution | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Caution -Toxic |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| PerCPCy5.5 Rat anti-mouse CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 45-0112 | |
| Rat IgG2b K Isotype Control PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-4031 | |
| BV421 Rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) | BD Biosciences | 563890 | |
| BV421 Rat IgG2b, κ Isotype Control RUO | BD Biosciences | 562603 | |
| Rabbit anti-mouse TMEM119 (clone28 - 3) | Abcam | ab209064 | |
| AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG | Life Technologies | A31573 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Purified | eBioscience | 14-0161 | Mouse Fc Block |
| Fixable Dead Cell Stain Kits | Invitrogen | L34969 | |
| Mouse CCR2 APC-conjugated Antibody | R&D | FAB5538A | |
| Rat IgG2B APC-conjugated Isotype Control | R&D | IC013A | |
| Mouse CX3CR1 PE-conjugated Antibody | R&D | FAB5825P | |
| Goat IgG PE-conjugated Antibody | R&D | IC108P | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Cell analyzer | BD Biosciences | BD FACSVERSE | |
| Data Analysis Software | FlowJo LLC | FlowJo | |
| Fine scissors | F.S.T | 14090-11 | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T | 11000-13 | |
| Mayo Scissors | F.S.T | 14010-15 | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T | 11251-20 |
References
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
- Ginhoux, F., Lim, S., Hoeffel, G., Low, D., Huber, T. Origin and differentiation of microglia. Front Cell Neurosci. 7, 45 (2013).
- Ginhoux, F., Jung, S. Monocytes and macrophages: developmental pathways and tissue homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (6), 392-404 (2014).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- London, A., Cohen, M., Schwartz, M. Microglia and monocyte-derived macrophages: functionally distinct populations that act in concert in CNS plasticity and repair. Front Cell Neurosci. 7, 34 (2013).
- Miron, V. E., Franklin, R. J. Macrophages and CNS remyelination. J Neurochem. 130 (2), 165-171 (2014).
- Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease. J Neurosci. 31 (31), 11159-11171 (2011).
- Boillee, S., et al. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 312 (5778), 1389-1392 (2006).
- Yamasaki, R., et al. Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system. J Exp Med. 211 (8), 1533-1549 (2014).
- Wu, D. C., et al. Blockade of microglial activation is neuroprotective in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson disease. J Neurosci. 22 (5), 1763-1771 (2002).
- Cartier, N., Lewis, C. A., Zhang, R., Rossi, F. M. The role of microglia in human disease: therapeutic tool or target? Acta Neuropathol. 128 (3), 363-380 (2014).
- Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool. Nat Neurosci. 14 (9), 1142-1149 (2011).
- Funk, N., et al. Characterization of peripheral hematopoietic stem cells and monocytes in Parkinson's disease. Mov Disord. 28 (3), 392-395 (2013).
- Butovsky, O., et al. Modulating inflammatory monocytes with a unique microRNA gene signature ameliorates murine ALS. J Clin Invest. 122 (9), 3063-3087 (2012).
- Lewis, C. A., Solomon, J. N., Rossi, F. M., Krieger, C. Bone marrow-derived cells in the central nervous system of a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis are associated with blood vessels and express CX(3)CR1. Glia. 57 (13), 1410-1419 (2009).
- Sedgwick, J. D., et al. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (16), 7438-7442 (1991).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J Immunol. 154 (9), 4309-4321 (1995).
- Martin, E., Boucher, C., Fontaine, B., Delarasse, C. Distinct inflammatory phenotypes of microglia and monocyte-derived macrophages in Alzheimer's disease models: effects of aging and amyloid pathology. Aging Cell. , (2016).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
- Jin, L. W., et al. Dysregulation of glutamine transporter SNAT1 in Rett syndrome microglia: a mechanism for mitochondrial dysfunction and neurotoxicity. J Neurosci. 35 (6), 2516-2529 (2015).
- Bedi, S. S., Smith, P., Hetz, R. A., Xue, H., Cox, C. S. Immunomagnetic enrichment and flow cytometric characterization of mouse microglia. J Neurosci Methods. 219 (1), 176-182 (2013).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. J Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. J Immunol. 188 (1), 29-36 (2012).
- Lecoeur, H., Ledru, E., Gougeon, M. L. A cytofluorometric method for the simultaneous detection of both intracellular and surface antigens of apoptotic peripheral lymphocytes. J Immunol Methods. 217 (1-2), 11-26 (1998).
- Richter, N., et al. Glioma-associated microglia and macrophages/monocytes display distinct electrophysiological properties and do not communicate via gap junctions. Neurosci Lett. 583, 130-135 (2014).
- Mahad, D., et al. Modulating CCR2 and CCL2 at the blood-brain barrier: relevance for multiple sclerosis pathogenesis. Brain. 129 (Pt 1), 212-223 (2006).
