Summary
Ce protocole fournit une analyse des sous-populations de macrophages dans le système nerveux central de souris par cytométrie de flux et est utile pour l'étude de marqueurs multiples exprimés par ces cellules.
Abstract
De nombreuses études ont démontré le rôle des cellules immunitaires, en particulier des macrophages, dans les pathologies du système nerveux central (SNC). Il existe deux principales populations de macrophages dans le SNC: (i) la microglie, qui sont les macrophages résidents du SNC et dérivent des progéniteurs du sac vésiculaire pendant l'embryogenèse, et (ii) les macrophages dérivés des monocytes (MDM), qui peuvent infiltrer Le SNC pendant la maladie et sont dérivés de progéniteurs de moelle osseuse. Les rôles de chaque sous-population de macrophages diffèrent en fonction de la pathologie étudiée. En outre, il n'y a pas de consensus sur les marqueurs histologiques ou les critères distinctifs utilisés pour ces sous-populations de macrophages. Cependant, l'analyse des profils d'expression des marqueurs CD11b et CD45 par cytométrie en flux nous permet de distinguer la microglie (CD11b + CD45 med ) du MDM (CD11b + CD45 haute ). Dans ce protocole, nous montrons que la centrifugation à gradient de densitéEt l'analyse par cytométrie de flux peut être utilisée pour caractériser ces sous-populations de macrophages du SNC et pour étudier plusieurs marqueurs d'intérêt exprimés par ces cellules au fur et à mesure de notre publication. Ainsi, cette technique peut favoriser notre compréhension du rôle des macrophages dans les modèles de souris de maladies neurologiques et peut également être utilisée pour évaluer les effets sur ces cellules.
Introduction
Les microglies sont les macrophages résiduels du système nerveux central (SNC) parenchymateux. Ils jouent deux rôles fonctionnels clés: la défense immunitaire et le maintien de l'homéostasie du SNC. Contrairement au MDM, qui sont renouvelés continuellement à partir des cellules souches hématopoïétiques dans la moelle osseuse, les cellules microgliales se différencient des cellules progénitrices hématopoïétiques primitifs provenant du sac vellé (YS) qui ont colonisé le cerveau pendant le développement embryonnaire 1 , 2 , 3 . Chez les rongeurs, le facteur de transcription Myb joue un rôle crucial dans le développement de tous les monocytes et macrophages dérivés de la moelle osseuse, mais pour la microglie dérivée de YS, ce facteur est dispensable et la différenciation reste dépendante du facteur de transcription PU.1 4 .
Dans le SNC sain, les microglies sont des cellules dynamiques qui échantillonnent constamment leur environnement, scaEt l'arpentage pour les agents pathogènes envahissants ou les dommages aux tissus 5 . La détection de ces signaux déclenche une voie pour résoudre la blessure. La microglie passe rapidement d'une morphologie ramifiée à une amiboïde, suivie d'une phagocytose et d'une libération de divers médiateurs, tels que des cytokines pro ou anti-inflammatoires. Ainsi, selon leur microenvironnement, la microglie activée peut acquérir un spectre d'états d'amorçage distincts 6 .
La microglie a un impact profond sur le développement et la progression de nombreux troubles neurologiques. Dans les modèles de rongeurs de la maladie d'Alzheimer (AD) 7 , de la Sclérose latérale amyotrophique (ALS) 8 , de la Sclérose en plaques (MS) 9 ou de la maladie de Parkinson (PD) 10 , la microglie joue un double rôle, induisant une neurotoxicité néfaste ou agissant De manière neuroprotective, qui dépend deN la maladie spécifique, le stade de la maladie et si la maladie a été influencée par le compartiment immunitaire systémique 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . La plupart des lésions du SNC observées dans les maladies citées ci-dessus contiennent une population hétérogène de cellules myéloïdes, y compris non seulement la microglie parenchymateuse, mais aussi les macrophages périvasculaires et méningés, ainsi que le MDM infiltrant le SNC. Ces types de cellules peuvent contribuer de manière différentielle aux mécanismes pathophysiologiques liés aux blessures et à la réparation 7 , 12 , 13 , 14 , 15 . Le défi actuel pour les chercheurs qui étudient ces modèles de maladie est d'établir si les monocytes et les macrophages périphériques s'infiltrent dans le SNC et, dans l'affirmative,Astuce la microglie résidante de ces cellules. En effet, les cellules microgliales sont très plastiques; Lorsqu'ils sont activés, les marqueurs de réticine de microglie sont habituellement exprimés par des monocytes périphériques et des macrophages. La question, par conséquent, repose sur l'identification de marqueurs qui peuvent distinguer la microglie résidante des monocytes et des macrophages infiltrants.
La discrimination de ces populations sur les tranches de cerveau par des applications immunohistologiques est limitée en raison du manque d'anticorps spécifiques. Cependant, l'analyse par cytométrie en flux est une technique efficace pour évaluer l'expression de plusieurs marqueurs et pour distinguer les populations cellulaires (par exemple, lymphocytes, macrophages / MDM CD11b + CD45 haute et microglie CD11b + CD45 med ), ainsi que les sous-populations cellulaires 16 , 17 , 18 . Ce protocole décrit les procédures pour isoler lesDes cellules mononucléaires du SNC de souris dans des modèles de maladies neurologiques en utilisant une dissociation de tissu enzymatique optimisée et une centrifugation en gradient de densité; Ainsi qu'une méthode pour différencier les populations de microglie et MDM dans le SNC en utilisant la cytométrie en flux.
Une autre approche est d'éliminer la myéline et de purifier les cellules en utilisant des billes magnétiques conjuguées à des anticorps spécifiques 19 , 20 , 21 . L'élimination de la myéline à l'aide de perles magnétiques anti-myéline est plus coûteuse et affecte la viabilité et le rendement des cellules isolées 22 . Cette étape et la séparation immunomagnétique suivante de la microglie, limitent les études supplémentaires de populations de cellules immunitaires spécifiques 21 , 22 .
Ces procédures fournissent un moyen simple d'étudier les sous-populations de macrophages dans le développement de la maladie, etPour déterminer les effets des médicaments ou les modifications des gènes sur les phénotypes et les états d'activation des macrophages.
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Protocol
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel pour les soins et l'utilisation des animaux à l'Institut ICM et par le Comité d'éthique française de Darwin, et sont couverts par le protocole 01407.02.
1. Préparation
- Préparez le cocktail de digestion dans un tube de 1,5 mL en combinant les suivants pour chaque souris: 1 ml de solution salée tamponnée au phosphate (PBS); 123 μL enzyme de digestion (voir tableau de matériaux) à 13 wunsch / mL (solution mère), concentration finale 1,6 wunsch / mL; Et 5 μL d'ADNase I (voir tableau de matières) à 100 mg / mL (solution mère), concentration finale 0,5 mg / mL.
2. Perfusion et dissection
- Éuthaniser les souris avec une dose létale de pentobarbital (100 μL à 400 mg / mL).
- Placez l'animal en position couchée et humectez le corps avec 70% d'éthanol.
- Couper la peau ventrale avec des ciseaux fins juste en dessous du processus xyphoïde pour exposer la cavité thoraciqueY.
- Faire une incision dans le diaphragme et couper les aspects latéraux de la cage thoracique avec un ciseau fin dans une direction caudale à rostrale pour exposer le cœur (et éviter de couper d'autres organes). Identifiez le ventricule gauche (LV) et l'oreillette droite (RA).
- Insérez un cathéter papillon avec une aiguille de 25 G à l'intérieur du LV. Faire une incision sur la RA avec des ciseaux fins et au début du flux sanguin, commencer la perfusion à un débit de 10 ml / min dans le LV avec 20 ml de PBS pour éliminer les cellules et le sang des vaisseaux; Une perfusion réussie est notée par le blanchiment des poumons et le foie à mesure que le sang est déplacé.
- Décapiter l'animal avec des ciseaux moyens. Dissectionnez la colonne vertébrale avec des ciseaux fins et séparez-le du corps en excitant la musculature de la paroi abdominale sur le côté ventral de la colonne vertébrale et en coupant la colonne vertébrale à la base de la queue.
- Insérez une seringue de 10 ml contenant du PBS et une pointe de pipette de 200 μL montée dans le côté lombaire deLa colonne vertébrale et rincer la moelle épinière du côté cervical.
REMARQUE: la pointe de la pipette de 200 μL est coupée avec des ciseaux à son extrémité la plus large (environ 1 cm) et bien insérée sur une seringue de 10 ml précédemment remplie de PBS. - Retirez la peau au-dessus du crâne et utilisez une pince pour exposer le cerveau. Insérez une lame à ciseaux à la base du crâne et coupez le crâne suivant la suture sagittale. Insérez de petites pinces dans la coupe et soulevez doucement le crâne. Dissecez le cerveau de la tête de la souris et retirez l'ampoule olfactive et le cervelet.
- Recueillir le cerveau et la moelle épinière dans un tube de 1,5 ml contenant 1,128 mL de PBS avec un cocktail de digestion (à partir de l'étape 1.1).
3. Dissociation cellulaire
- Couper finement le cerveau et la moelle épinière dans le tube de 1,5 mL (étape 2.9) en 1-2 mm 3 avec de petits ciseaux ( Figure 1 ).
- Incuber le tube de 1,5 ml contenant les tissus émincés pendant 30 min dans une incubaÀ 37 ° C avec 5% de CO 2 .
REMARQUE: Préparez le gradient de densité à cette étape. - Ajouter 20 μL d'EDTA 0,5 M (solution mère), concentration finale 10 mM, au tube de 1,5 ml pour arrêter la réaction enzymatique.
- Faites doucement une suspension de cellules en pipetant vers le haut et vers le bas avec une pipette de 5 mL.
- Passer la suspension cellulaire à travers un maille de nylon (taille de pores de 70 μm) dans un tube de 50 ml en utilisant le piston d'une seringue de 10 ml.
- Laver le filet de nylon avec 20 mL de sérum bovin fêtal 5% (FBS) -PBS.
- Centrifugeuse pendant 7 min (300 xg) à température ambiante (18 ° C). Jeter le surnageant par aspiration et passer à l'étape suivante. Soyez extrêmement prudent lorsque vous retirez le surnageant; Ne pas déranger la pastille, qui peut être facilement aspirée par la pipette d'aspiration.
4. Dégradé de densité
- Préparer une solution stock du milieu gradient de densité en ajoutant la quantité appropriée de PBS 10x au milieu à gradient de densité.
REMARQUE: Ajoutez une partie 10X PBS à un gradient de densité de neuf parties. - Diluer le milieu de gradient de densité de stock avec 1x PBS pour les différents pourcentages, comme décrit dans le tableau 1 .
- Remettre en suspension la pastille (à partir de l'étape 3.7) avec un milieu gradient de densité de 4 mL et 30% et passer à un tube de 15 mL.
- Placer une pipette Pasteur dans le fond du tube de 15 ml et sous-couche lentement 4 mL de milieu de gradient de densité de 37%.
- Ajouter 4 mL de milieu à gradient de densité à 70%, comme décrit ci-dessus.
- Centrifuger le gradient pendant 40 min (800 xg) à température ambiante (18 ° C). Assurez-vous que la centrifugeuse s'arrête avec un frein minimal ou nul, de sorte que l'interphase n'est pas perturbée.
REMARQUE: Le tube apparaîtra stratifié. Les cellules superposées à l'interface à gradient de densité de 70% à 37% sont les cellules immunitaires mononucléées (sous-populations de microglie et de macrophages); Les niveaux supérieurs sont respectivement les débris cellulaires et la myéline ( figure 2 ). - Recueillir 3 à 4 ml de l'interphase de gradient de densité 70 à 37% contenant les cellules des sous-populations de macrophages dans un tube propre de 15 ml.
- Lavez les cellules 3x avec du PBS, volume total de 15 ml. Assurez-vous que le milieu de gradient de densité contenant les cellules est dilué au moins trois fois avec du PBS et centrifuger pendant 7 minutes (500 xg, 4 ° C) avec le frein "on".
- Remettre en suspension le culot cellulaire avec 1 mL de PBS pour l'étiquetage cellulaire ou pour d'autres essais fonctionnels.
5. Étiquetage cellulaire pour la cytométrie de flux
- Transférer les cellules (étape 4.10) dans un tube de cytométrie en flux.
- Ajouter 1 μL de réactif de coloration de cellules mortes fixable à chaque échantillon de cellule obtenu à l'étape 4.10. Incuber pendant 30 minutes sur de la glace, protégé de la lumière.
- Laver les cellules une fois avec 2 ml de PBS et centrifuger pendant 5 min (300 xg, 4 ° C).
- Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire avec400 μL de PBS 1% de BSA, 0,1% d'azide.
- Ajouter 1 μg d'anticorps CD16 / CD32 à 100 μL des cellules pour bloquer les récepteurs Fc. Incuber 10 à 15 minutes sur de la glace, protégé de la lumière.
- Préparer le mélange d'anticorps primaire dans PBS 1% de BSA, 0,1% d'azide ou PBS 1% de BSA, 0,1% d'azide, 0,25% de saponine, pour la perméabilisation cellulaire pour la coloration intracellulaire.
- Ajouter 100 μL de mélange d'anticorps primaires (2x) et incuber pendant 30 minutes sur de la glace, protégé de la lumière.
REMARQUE: Tous les anticorps doivent être titrés avant de mener l'expérience afin d'obtenir des résultats optimaux. - Laver les cellules avec 2 mL de PBS et centrifuger pendant 5 min (300 xg, 4 ° C). Répétez cette étape trois fois.
- Ajouter 100 μL d'un anticorps secondaire si les anticorps primaires ne sont pas directement conjugués à un fluorophore et incuber pendant 30 minutes sur de la glace, protégés de la lumière.
- Laver les cellules avec 2 mL de PBS et centrifuger pendant 5 min à 300 xg à 4 ° C). Répétez cette étape trois fois.
- Repare leCellules avec 100 μL de PFA à 1% pendant 15 minutes à température ambiante, protégées de la lumière.
REMARQUE: Attention: le PFA est toxique. Utiliser dans une hotte et porter un équipement de protection individuelle. - Laver les cellules avec 2 ml de PBS et centrifuger pendant 5 minutes à 300 xg à 4 ° C. Répétez cette étape trois fois.
- Remise en suspension de la pastille cellulaire avec 200 μl de PBS et procéder à l'acquisition et à l'analyse de la cytométrie en flux. Suivez la stratégie de verrouillage de la figure 3 .
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Representative Results
Après la centrifugation en gradient de densité et la coloration d'anticorps, les cellules ont été acquises sur un cytomètre de flux et analysées à l'aide d'une stratégie de fermeture morphologique comme suit. Une première grille a été définie dans la zone de répartition par points (FSC-A) par rapport à la hauteur réversible (FSC-H) pour discriminer les cellules individuelles des doublets ( Figure 3A ). Les cellules individuelles ont ensuite été fermées sur les diagrammes de points FSC-A contre les zones de dispersion dispersées latérales (SSC-A) pour exclure les débris cellulaires et les cellules pyknotiques, en fonction de la taille relative de la cellule et de la granularité cellulaire ( Figure 3B ). Ensuite, la microglie et Les MDM ont été identifiés en fonction de leurs niveaux d'expression des marqueurs CD11b et CD45 ( Figure 3C , 3D ). Enfin, d'autres marqueurs d'expression ont été analysés pour chaque sous-population de macrophages ( figure 3E -3G ). Le microglIl a été signalé que l'on exprime le CX3CR1 mais pas le marqueur CCR2 contrairement au MDM 23 . Récemment, il a été démontré que Tmem119 est un marqueur spécifique pour la microglie 19 . Les marqueurs suivants (Tmem119, CX3CR1 et CCR2) ont été évalués par cytométrie en flux utilisant des anticorps détecteurs spécifiques pour chaque marqueur; Toutes les cellules CD11b + CD45 med ont été positives pour les marqueurs Tmem119 et CX3CR1 mais pas pour le marqueur CCR2, qui valide cette stratégie de verrouillage ( Figure 3E -3G ).
En l'absence de l'isolation du gradient de densité, les sous-populations de macrophages n'ont pas pu être définies dans le diagramme de points FSC-A contre SSC-A en raison de la présence de nombreuses cellules et de débris de myéline ( Figure 3H ). Il est à noter que le traitement de perméabilisation induit un rétrécissement cellulaire et, par conséquent, les sous-populations de macrophages apparaissentAller dans le diagramme de points FSC versus SSC ( Figure 3I , J ) comme décrit précédemment 24 . La viabilité des cellules a été déterminée à l'aide du kit de taches de cellules mortes fixables. Après le gradient de densité, 85 à 95% des cellules sont en vie ( figure 3K ). Les populations de microglie et MDM peuvent être définies par les marqueurs CD45 et CD11b sur un diagramme de points après l'isolement du cerveau et des cellules de la moelle épinière dans un seul échantillon ( Figure 3L ), et aussi du cerveau ou de la moelle épinière seul ( Figure 3M , 3N ).
Pour l'étiquetage par cytométrie en flux, il est important de savoir si la protéine et / ou l'épitope reconnu par l'anticorps est intra ou extracellulaire. Dans le cas des antigènes intracellulaires, un tampon de perméabilisation est nécessaire. Tmem119 est une protéine transmembranée, mais l'epitope est reconnuPar les taches d'anticorps comme intracellulaires 19 . En l'absence de perméabilisation cellulaire, il n'y avait pas d'étiquetage ( figure 3O ). L'absence de cette étape de perméabilisation pourrait conduire à des résultats faussement négatifs. Puisque l'anticorps Tmem119 n'est pas directement conjugué à un fluorophore, les cellules ont été marquées avec un anticorps secondaire; Le témoin négatif était l'anticorps secondaire seul (ligne noire) ( Figure 3E , 3O-3R ). Lorsque des anticorps directement conjugués sont utilisés, il existe deux stratégies principales pour évaluer l'étiquetage spécifique: les anticorps isotypiques comme témoin négatif ou les contrôles Fluorescence Minus One (FMO). Les contrôles FMO contiennent tous les anticorps d'étiquetage dans le mélange, à l'exception de l'anticorps témoin pour cet échantillon. Ainsi, un contrôle FMO est nécessaire pour chaque marqueur, alors qu'un seul mélange d'étiquetage est nécessaire pour le contrôle des anticorps isotypiques, par échantillon. Pour l'étiquetage des cellules immunitaires du cerveau, nous avons choisi l'isotLa lutte contre les anticorps de ype depuis un nombre limité de cellules (400 000 cellules) est obtenue après le gradient de densité d'un cerveau de souris.
Figure 1: Étapes de la procédure de dissociation cellulaire. ( A ) Le tissu a été placé dans un tube avec des enzymes de cocktail de digestion. ( B ) Le tissu a été finement coupé en petits morceaux avec des ciseaux. ( C ) Les petits morceaux de tissu ont été incubés pendant 30 min (37 ° C) pour une digestion efficace des tissus. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Schéma du gradient de densité après CenÉtape de trifugation. Après la centrifugation, la myéline est présente au sommet du gradient de densité et les cellules immunitaires contenant des populations de macrophages se trouvent à l'interphase entre les couches de gradient de densité de 37% et 70%. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Analyse de cytométrie de flux représentatif des macrophages. Une stratégie de verrouillage logique a été appliquée: ( A ) La discrimination de doublet se réfère à la trame de points FSC-A versus FSC-H. ( B ) La stratégie de verrouillage morphologique se réfère à la trame de points FSC-A par rapport à SSC-A. ( C ) Les sous-populations de macrophages se réfèrent au tracé de points CD45 versus CD11b. ( D ) Le tableau des points des cellules staIncorporé avec des anticorps isotypiques comme témoin pour la coloration CD45 et CD11b. L'analyse des marqueurs exprimée par ces deux sous-populations de macrophages: Tmem119 ( E ), CX3CR1 ( F ) et CCR2 ( G ) (10 000 événements dans la porte P2 ont été acquises). Les parcelles montrent la taille de la cellule (FSC-A) et la granularité (SSC-A) du cerveau et des cellules de la moelle épinière avant le gradient de densité ( H ) ou après l'isolement du gradient de densité et avec le traitement perméabilisant ( I ) ou sans ( J ) . ( K ) L'histogramme de cytométrie de flux illustre le pourcentage de cellules mortes après le gradient de densité. Gates montrés dans les parcelles de points illustrent la population de microglia CD11b + CD45 et la population MDM élevée CD11b + CD45 dans le cerveau et la moelle épinière ( L ) ou dans le cerveau ( M ) ou la moelle épinière ( N ) séparément. Analyse de Tmem119 expriméePar les sous-populations de macrophages dans le cerveau et les cellules de la moelle épinière perméabilisées ( O ) ou non perméabilisées ( P ) et dans le cerveau ( Q ) ou dans les cellules perméabilisées de la moelle épinière ( R ). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Volume pour 1 tube (mL) | Densité gradient moyen 1x | PBS 10x | PBS 1x |
| Gradient de densité moyen 30% | 1.5 | 0,15 | 3.35 |
| Gradient de densité moyen 37% | 1,85 | 0,1885 | 2.965 |
| Gradient de densité moyen 70% | 3.5 | 0,35 | 1,15 |
Tableau 1: Composition des différents pourcentages du milieu de gradient de densité.
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Discussion
Il a été démontré que la microglie et le MDM ont différentes fonctions et phénotypes dans le SNC, et donc l'identification et l'analyse de ces sous-populations de macrophages sont essentielles pour mieux comprendre les maladies neurologiques 9 , 18 , 25 . L'analyse de cytométrie de flux utilisant deux marqueurs (CD11b et CD45) permet la distinction entre chaque sous-population ( Figure 3C ). Cette stratégie a déjà été validée en utilisant d'autres marqueurs spécifiques, tels que CCR2 pour MDM et CX3CR1 pour la microglie, et une approche récemment développée avec un anticorps contre Tmem119 ( Figure 3E - 3G ). Nous avons effectué des expériences avec des anticorps CCR2 et CX3CR1 ( figure 3F , 3G ), comme nous l'avons déjà publié 18 . CD11b + CD45La population de Med très exprimée Tmem119 et CX3CR1 mais pas CCR2 contrairement à la population CD11b + CD45 élevée . La population élevée CD11b + CD45 est composée de diverses sous-populations avec ou sans expression CCR2. L'identification et la caractérisation de ces sous-populations de macrophages (macrophages périvasculaires, macrophages infiltrants, etc. ) constituent une vaste zone de recherche. En outre, les marqueurs de ces populations peuvent changer en fonction des processus pathologiques. En effet, CCR2 est réglementé par la baisse lorsque les monocytes traversent la barrière hémato-encéphalique 26 .
Les anticorps CD45 et CD11b ont reconnu les antigènes de la surface cellulaire, de sorte que le traitement de perméabilisation n'est pas nécessaire. Par conséquent, cette technique pourrait également être utilisée pour purifier chaque sous-population de macrophages par tri cellulaire pour l'analyse d'ARNm ou d'autres dosages fonctionnels. Il est à noter que l'utilisation de l'enzyme et de la densitéIent peut induire, dans une certaine mesure, l'activation de la microglie. Nous avons précédemment observé qu'après l'isolement, la microglie et les macrophages expriment l'oxyde nitrique synthase inducible (iNOS). Néanmoins, le niveau d'expression iNOS augmenté observé dans l'état pathologique par rapport à l'état normal peut être mis en évidence à l'aide de cette méthode 18 . En outre, cette technique permet d'obtenir une population cellulaire bien séparée (single) avec une forte proportion de cellules vivantes.
Pour la réplication réussie de ce protocole, il existe plusieurs paramètres critiques. La configuration du dégradé est la plus critique. Notre expérience indique que la préparation des gradients dans des tubes de 15 mL contre 50 mL entraîne de meilleures séparations. Si aucune cellule n'est visible dans l'interface de 70 à 37%, la quantité de tissu du SNC utilisé pour l'isolement cellulaire doit être envisagée. Nous recueillons habituellement ~ 400 000 cellules d'un cerveau de souris. Bien que ce rendement fluctue selon diverses conditions expérimentalesS, un pour une meilleure visualisation de l'interface 70-37% est de réaliser la couche de gradient de densité de 37% avec du PBS et du rouge de phénol.
Avec l'aide de différents lasers et filtres dans le cytomètre de flux, ce protocole peut quantifier plusieurs marqueurs exprimés par chacune des sous-populations de macrophages 18 . Cette technique est également utile pour évaluer l'implication d'autres cellules immunitaires telles que les lymphocytes T et les cellules B dans le même échantillon. En effet, les techniques utilisant l'enrichissement immunomagnétique ne permettent que l'étude des populations sélectionnées précédemment 21 .
Dans l'ensemble, cette technique constitue un outil utile pour caractériser les différentes sous-populations de macrophages dans les modèles de souris de maladies neurologiques. Cette alternative unique peut évaluer les effets du traitement sur les processus inflammatoires dans les pathologies.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions de l'Agence Nationale pour la Recherche (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), de l'Association France Alzheimer et de Bpifrance. Notre laboratoire est également soutenu par l'Inserm, le CNRS, l'Université Pierre et Marie-Curie et le programme "Investissements d'avenir" ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM). Nous tenons à remercier l'assistance de l'établissement de base CELIS de la culture cellulaire.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 month-old Mice | Janvier | C57BL/6J | |
| Liberase TL Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401020001 | Digestion enzyme |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17-0891-01 | Density gradient medium |
| Cell Strainer size 70 µm Nylon | Corning | 731751 | |
| Venofix 25 G | BRAUN | 4056370 | |
| Piston syringe 10 mL | Terumo | SS+10ES1 | |
| Pasteur pipette 230 mm | Dustcher | 20420 | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| 15 mL tube | TPP | 91015 | |
| 50 mL tube | TPP | 91050 | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352054 | |
| D-PBS (1x) without Ca2+/Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| D-PBS (10x) without Ca2+/Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14200-067 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | |
| Bovine Serum Albumin solution 30% | Sigma-Aldrich | A7284 | |
| Paraformaldehyde 32% Solution | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Caution -Toxic |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| PerCPCy5.5 Rat anti-mouse CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 45-0112 | |
| Rat IgG2b K Isotype Control PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-4031 | |
| BV421 Rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) | BD Biosciences | 563890 | |
| BV421 Rat IgG2b, κ Isotype Control RUO | BD Biosciences | 562603 | |
| Rabbit anti-mouse TMEM119 (clone28 - 3) | Abcam | ab209064 | |
| AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG | Life Technologies | A31573 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Purified | eBioscience | 14-0161 | Mouse Fc Block |
| Fixable Dead Cell Stain Kits | Invitrogen | L34969 | |
| Mouse CCR2 APC-conjugated Antibody | R&D | FAB5538A | |
| Rat IgG2B APC-conjugated Isotype Control | R&D | IC013A | |
| Mouse CX3CR1 PE-conjugated Antibody | R&D | FAB5825P | |
| Goat IgG PE-conjugated Antibody | R&D | IC108P | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Cell analyzer | BD Biosciences | BD FACSVERSE | |
| Data Analysis Software | FlowJo LLC | FlowJo | |
| Fine scissors | F.S.T | 14090-11 | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T | 11000-13 | |
| Mayo Scissors | F.S.T | 14010-15 | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T | 11251-20 |
References
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